吳慧敏綜述 鐘建審校

蛋白尿是腎臟疾病最重要的癥狀之一，其中大部分為腎小球性蛋白尿。腎小球性蛋白尿與腎小球?yàn)V過屏障的病理損傷有關(guān)，腎小球?yàn)V過屏障由3層組成：腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基底膜(glomerular basement membrane，GBM)和腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)。過去20余年的研究表明，第三層足細(xì)胞是最后的屏障[1]。足細(xì)胞是GBM外層終末分化的上皮細(xì)胞，對于腎小球?yàn)V過屏障的完整性至關(guān)重要，它們是阻止蛋白質(zhì)和大分子進(jìn)入尿液的主要屏障。

1 狹縫隔膜的特征

狹縫隔膜(slit diaphragms，SD)是足細(xì)胞間一種特殊的細(xì)胞—細(xì)胞連接，與突觸有共同的特點(diǎn)。足細(xì)胞的足突覆蓋GBM的外側(cè)，鄰近足細(xì)胞的足突重疊呈交叉指狀。在相鄰的交叉指狀足突之間形成的“濾過縫”是一個高度專門化的縫隙連接，稱為狹縫隔膜，SD具有大小和電荷選擇性濾過作用，所以濾過屏障的選擇性濾過作用依賴于SD的完整性，它形成了蛋白質(zhì)泄漏的主要尺寸屏障。早期的電子顯微鏡研究表明[2]，狹縫膜片呈現(xiàn)出拉鏈狀的亞結(jié)構(gòu)，交替周期性的跨橋從對側(cè)足細(xì)胞質(zhì)膜延伸出來，證明相鄰足突是指間的。發(fā)育分析顯示，毛細(xì)血管袢階段出現(xiàn)SD，并逐漸取代緊密連接。Nephrin、NEPH1、P-cadherin、FAT和Ephrin-B1為形成狹縫隔膜分子篩的細(xì)胞外成分。其中，ZO-1、podocin、CD2AP、MAGI和Par復(fù)合物等胞質(zhì)蛋白被鑒定為連接SD和細(xì)胞骨架的支架蛋白。SD不僅起到防止蛋白尿的過濾器作用，還起到復(fù)雜的信號中樞的作用，將不同的化學(xué)和機(jī)械刺激轉(zhuǎn)移到足細(xì)胞。足細(xì)胞骨架失調(diào)或SD的完整性喪失可導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，這是足細(xì)胞疾病中最常見的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)[3-4]。

2 Nephrin的特征

Nephrin是在研究先天性腎病綜合征芬蘭型時發(fā)現(xiàn)的，它是第一個被確定為SD細(xì)胞外成分的分子[5]，Nephrin 被認(rèn)為是SD細(xì)胞外部分的主體。編碼Nephrin的基因NPHS1由Kestila及其同事首次克隆。人類Nephrin被分配到染色體19，由19q13.1上的NPHS1基因編碼，具有端粒到著絲粒的取向。NPHS1主要定位于腎小球，但在睪丸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、胎盤、心臟和淋巴組織中也有表達(dá)[6-7]。NPHS1基因大小為26 kb，共包含29個外顯子，由1 241個殘基的跨膜蛋白組成，含胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)3個功能域。胞內(nèi)區(qū)含9個酪氨酸(tyrosine，Tyr) 殘基，其中 Tyr1176、Tyr1193、Tyr1210具有被細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶 Src 磷酸化的潛力，與含 SH2、SH3 結(jié)構(gòu)的結(jié)合蛋白的親和力顯著增加，參與多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。Nephrin有1個很長的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，由8個C2型IgG樣結(jié)構(gòu)域(Ig區(qū))及 1 個Ⅲ型纖維蛋白區(qū)域組成。每個Ig區(qū)含 2 個半胱氨酸殘基，可與Nephrin 分子或其他蛋白形成二硫鍵，與對側(cè)足突的 Nephrin 分子或與其他SD蛋白發(fā)生嗜同性或異性結(jié)合，正是這些IgG—IgG界面形成了圍繞腎小球毛細(xì)血管的拉鏈狀SD網(wǎng)，形成了篩狀結(jié)構(gòu)[9]。

Nephrin是足細(xì)胞中維持SD正常結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵分子。Nephin與許多其他足細(xì)胞和SD蛋白相互作用，還介導(dǎo)足細(xì)胞中重要的細(xì)胞信號通路。Nephrin的缺失或氨基酸序列的改變[10-11]，會導(dǎo)致SD的破壞，進(jìn)而產(chǎn)生大量尿蛋白。在許多成人發(fā)病的腎小球疾病中，Nephrin的表達(dá)發(fā)生改變[12-14]。一項關(guān)于誘導(dǎo)性Nephrin基因敲除的小鼠模型研究，觀察到獲得性長期Nephrin敲除影響腎小球足細(xì)胞、系膜細(xì)胞和基質(zhì)、GBM和內(nèi)皮細(xì)胞的所有成分，這表明Nephrin在基礎(chǔ)條件下及在腎小球疾病中對腎小球功能至關(guān)重要[7]。這些研究表明，Nephrin是SD的關(guān)鍵功能分子，其功能障礙是人類腎小球疾病蛋白尿的常見致病機(jī)制之一。

3 Nephrin與SD上其他分子的聯(lián)系

3.1 Nephrin與SD細(xì)胞外成分其他分子的聯(lián)系

3.1.1 Nephrin與NEPH1: NEPH1是SD細(xì)胞外成分的另一個關(guān)鍵分子。通過基因捕獲鑒定出NEPH1為Nephrin相關(guān)蛋白。它是一種跨膜蛋白，包含5個細(xì)胞外IgG結(jié)構(gòu)域[15]。NEPH1敲除小鼠腎小球足細(xì)胞足突消失，產(chǎn)生蛋白尿，在大量足突消失和蛋白尿?yàn)樘卣鞯膶?shí)驗(yàn)動物模型中，如原發(fā)性局灶性節(jié)段性腎小球硬化、微小病變腎病綜合征及阿霉素腎病和嘌呤霉素氨基核苷腎病，NEPH1降低[16]，說明NEPH1對維持SD的屏障功能也是必不可少的。

NEPH1和Nephrin相互作用鑒于NEPH1和Nephrin的共定位和結(jié)構(gòu)相似性。Nephrin的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域直接與NEPH1的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用，形成順式異源寡聚體[17]。一項利用高分辨率超微結(jié)構(gòu)的成像研究顯示[18]，SD中可能的Nephrin和NEPH1成分的排列：單個NEPH1分子似乎以23 nm的寬度形成靠近腎小球基底膜連接的下部，而單個Nephrin分子以45 nm的寬度在更頂端形成相鄰的連接。這些Nephrin和NEPH1復(fù)合物間隔7 nm，形成2層結(jié)構(gòu)，將SD與其他類似Nephrin—Nephrin的細(xì)胞—細(xì)胞黏附模塊區(qū)分開來。通過這些結(jié)構(gòu)，結(jié)合Nephrin和NEPH1重復(fù)Ig折疊固有的靈活性，表明SD可能代表高度動態(tài)的細(xì)胞—細(xì)胞連接，在腎濾過裝置內(nèi)形成可調(diào)節(jié)的屏障。

3.1.2 Nephrin與Ephrin-B1：Ephrin-B1是Eph-Ephrin家族中的一種蛋白。Ephrin和Eph是作為受體—配體對發(fā)揮作用的膜結(jié)合蛋白。Ephrins分為2個亞類，B型Ephrins有1個跨膜結(jié)構(gòu)域和1個包含4個酪氨酸殘基的短細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，C端有1個PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合基序。Fukusumi等[19]研究表明，Ephrin-B1在SD上表達(dá)，Ephrin-B1參與維持SD分子的正確分子排列和SD的屏障功能。Ephrin-B1 細(xì)胞特異性條件敲除(cell specific conditional knockout，CKO)小鼠改變了SD成分的表達(dá)、足突消失并出現(xiàn)輕度但顯著的蛋白尿，提示Ephrin-B1在維持SD的結(jié)構(gòu)和屏障功能方面起著關(guān)鍵作用。

Ephrin-B1通過其胞外結(jié)構(gòu)域與Nephrin結(jié)合，Ephrin-B1—Nephrin復(fù)合物在維持SD的結(jié)構(gòu)和屏障功能方面起著至關(guān)重要的作用[20]。細(xì)胞外Nephrin刺激不僅使Nephrin磷酸化，而且使Nephrin結(jié)合的Ephrin-B1磷酸化[21]。這表明SD上的Ephrin-B1作為信號分子傳遞Nephrin檢測到的信號。

3.2 Nephrin與SD細(xì)胞骨架連接的多種支架蛋白的聯(lián)系

3.2.1 Nephrin與CD2AP：CD2AP是最初在T淋巴細(xì)胞分子CD2中發(fā)現(xiàn)的一種具有多個蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞內(nèi)蛋白[22]，包括3個Src同源3(Src homology 3，SH3)結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸和盤繞的線圈區(qū)域，它與參與各種信號傳導(dǎo)和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程的許多蛋白質(zhì)相互作用，從而參與細(xì)胞骨架重塑的調(diào)節(jié)、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞凋亡和內(nèi)吞作用。在腎小球中，CD2AP是一種80 kDa的SD相關(guān)支架蛋白[23]，CD2AP直接與肌動蛋白相互作用，表明CD2AP可能起到將膜蛋白(如Nephrin)連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架的作用，從而穩(wěn)定狹縫隔膜，被認(rèn)為是SD復(fù)合物的“穩(wěn)定劑”。缺乏CD2AP的小鼠出現(xiàn)足突缺失、嚴(yán)重蛋白尿及腎小球硬化等形態(tài)學(xué)改變[24]。

CD2AP可以通過其C末端結(jié)構(gòu)域與Nephrin相互作用。CD2AP的N端結(jié)構(gòu)域可以與p85結(jié)合，并促進(jìn)Nephrin誘導(dǎo)的AKT信號傳導(dǎo)，從而保護(hù)足細(xì)胞免于凋亡[25]。最近，Tossidou等[26]報道CD2AP是VEGF-A刺激的受體酪氨酸激酶的磷酸化靶點(diǎn)，并證明了CD2AP SH3-1結(jié)構(gòu)域Y10位酪氨酸的磷酸化可以改變CD2AP對Nephrin的親和力，對CD2AP的功能發(fā)揮是不可或缺的。并表明CD2AP和Nephrin之間存在一種精細(xì)調(diào)節(jié)的親和平衡，這種平衡受受體酪氨酸激酶刺激的影響。

3.2.2 Nephrin與Podocin：Podocin(由NPHS2編碼)僅在足細(xì)胞中表達(dá)，在SD復(fù)合體中作為支架蛋白。Podocin是一種完整的膜蛋白，其N端和C端結(jié)構(gòu)域都指向胞漿。Podocin缺陷小鼠在產(chǎn)前或出生后5周內(nèi)死亡[6]。電子顯微鏡顯示足突與巨大系膜硬化融合，Nephrin表達(dá)顯著降低。

Podocin通過其C末端結(jié)構(gòu)域與位于質(zhì)膜特定脂筏微結(jié)構(gòu)域的Nephrin的細(xì)胞質(zhì)部分結(jié)合，使其能夠形成SD并執(zhí)行其信號傳遞功能。Podocin可與Nephrin、NEPH1和CD2AP相互作用。

3.2.3 Nephrin與MAGI蛋白：MAGI蛋白(MAGI-1, MAGI-2, MAGI-3)屬于膜相關(guān)鳥苷酸激酶蛋白(MAGUK)家族，具有分子支架功能，通過連接細(xì)胞表面受體和細(xì)胞骨架來協(xié)調(diào)信號復(fù)合物。MAGI-1與連接黏附分子4 (junctional adhesion molecule 4,JAM4)相互作用，共同提供了緊密連接的黏附機(jī)制，并且MAGI-1和JAM-4都在足細(xì)胞中表達(dá)[27]。免疫電鏡顯示，MAGI-1的定位局限于SD，而JAM4分布在SD和根尖膜上。

體外相互作用實(shí)驗(yàn)表明，MAGI-1通過中間PDZ結(jié)構(gòu)域和Nephrin羧基末端結(jié)合[28]。據(jù)了解，MAGI-1在SD上與Nephrin和JAM4形成一個三部復(fù)合體。MAGI-2也在足細(xì)胞中表達(dá)，是在足細(xì)胞中表達(dá)的多域支架蛋白之一[29]。Shirata等[30]報道，MAGI2-CKO小鼠表現(xiàn)出SD破壞，足突形態(tài)異常和足細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致足細(xì)胞丟失。Yamada等[31]最近的一項研究表明，MAGI-2通過PDZ結(jié)構(gòu)域與其他支架蛋白一起協(xié)調(diào)Nephrin和NEPH1的定位。

3.2.4 Nephrin與Par-3/Par-6/ aPKC：在幾種細(xì)胞類型中，Par-3/Par-6/ aPKC是調(diào)節(jié)細(xì)胞極性的核心。Par-3和aPKC在足細(xì)胞SD上表達(dá)，而NEPH1—Nephrin復(fù)合物與Par -復(fù)合物結(jié)合。

最近，Takamura等[20]證實(shí)，Par-3與Nephrin相互作用，而Par-6與SD上的另一種跨膜蛋白Ephrin-B1結(jié)合，Ephrin-B1通過胞外部分與Nephrin相互作用。使用顯性陰性aPKC結(jié)構(gòu)的小鼠顯示出顯著的蛋白尿，并且在使用aPKC抑制劑的隔離腎小球中檢測到足突結(jié)構(gòu)的缺失。這些觀察清楚地表明，NEPH1—Nephrin—Par復(fù)合物對于維持SD的屏障功能是必不可少的。

3.2.5 Nephrin與NHERF2：Na+/H+交換調(diào)節(jié)因子2( Na+/H+exchanger regulatory factor 2，NHERF2)是NHERF蛋白質(zhì)的一種亞型，最初通過使用Na+/H+交換器3(NHE3)的細(xì)胞質(zhì)尾部進(jìn)行雙雜交篩選來鑒定[32]。NHERF蛋白質(zhì)是將質(zhì)膜蛋白與ezrin/radixin/moesin(ERM)家族成員連接起來的支架蛋白，從而將其與肌動蛋白細(xì)胞骨架連接起來。NHERF2的功能是調(diào)節(jié)其結(jié)合膜蛋白的表面表達(dá)[33]。

最近Fukusumi等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NHERF2不僅在根尖膜上表達(dá)，而且在SD上也表達(dá)，NHERF2通過Ephrin-B1與Nephrin—Ephrin-B1復(fù)合物相互作用，Nephrin—Ephrin-B1—NHERF2復(fù)合物與ezrin相互作用。Nephrin—Ephrin-B1—NHERF2—ezrin—actin的連接是連接SD與肌動蛋白細(xì)胞骨架的關(guān)鍵連接之一，并且這種連接在維持交叉指狀足突和SD方面起著重要作用。并發(fā)現(xiàn)刺激SD、Nephrin和Ephrin-B1的磷酸化可導(dǎo)致NHERF2和ezrin的去磷酸化，并破壞Nephrin—Ephrin-B1—NHERF2—ezrin—actin復(fù)合物。Ephrin-B1的磷酸化和隨后的NHERF2的去磷酸化是導(dǎo)致蛋白尿和足突消失的關(guān)鍵起始事件。

4 Nephrin磷酸化在SD建立的信號平臺

狹縫隔膜的作用不僅是一個屏障，也是一個信號平臺，將信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。Nephrin是SD細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的關(guān)鍵跨膜蛋白。Nephrin除了作為物理屏障的作用外，還在SD內(nèi)發(fā)揮著中央信號平臺的作用。Nephrin具有幾個酪氨酸殘基，這些酪氨酸通常相互獨(dú)立協(xié)調(diào)信號傳播，但有時也可以協(xié)同工作。將誘導(dǎo)信號通路的酪氨酸殘基分為2組。A類酪氨酸包括Y1114(YEES)和Y1138/9(YYRS)，而B類酪氨酸是YDxV基序，包括Y1176 (YDEV)、Y1193 (YDEV)和Y1217 (YDQV)(人類編號系統(tǒng))。Nephrin的酪氨酸殘基可被Src家族激酶磷酸化，包括Src、Fyn、Lyn和Yes[34]。A類酪氨酸的磷酸化誘導(dǎo)與p85/PI3K的結(jié)合，最終導(dǎo)致Akt和Rac1的激活和Cofilin的招募，從而影響足細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白和局部黏附動力學(xué)[35]。B類酪氨酸磷酸化的影響是最廣泛的。B類酪氨酸磷酸化導(dǎo)致Nck、PLC-γ1和ShcA的招募。Nck是一種含SH2/SH3的適配蛋白，Nck隨后招募Pak和N-W ASp[8]，允許在Nephrin上聚合肌動蛋白。也有報道Nephrin在這個基團(tuán)的酪氨酸殘基處磷酸化，與另一個含有蛋白PLC-γ1的SH2/SH3相連[36]。至于Nephrin酪氨酸的磷酸化是否與足細(xì)胞損傷的促進(jìn)或保護(hù)有關(guān)，目前尚缺乏共識，了解到磷酸化在基線、損傷和恢復(fù)中存在位點(diǎn)特異性差異。

酪氨酸磷酸化的Nephrin誘導(dǎo)2種形式的肌動蛋白結(jié)構(gòu)[9]。一種形式是板狀足，其中觀察到二維肌動蛋白網(wǎng)格。板狀足與足細(xì)胞的足突消失有關(guān)，并由第一組酪氨酸的磷酸化介導(dǎo)。另一種形式是肌動蛋白聚合物的生長(在Nephrin產(chǎn)生肌動蛋白尾)，這被認(rèn)為與足突的穩(wěn)定和SD結(jié)構(gòu)的維持有關(guān)。肌動蛋白尾部的產(chǎn)生基本上是通過B類酪氨酸的磷酸化來介導(dǎo)的。B類酪氨酸磷酸化水平的降低在人類腎小球疾病中被檢測到。最近的研究表明，與人類B類酪氨酸殘基相對應(yīng)的小鼠編號系統(tǒng)的3個酪氨酸殘基Y1191、Y1208和Y1232在敲入小鼠后轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸，發(fā)生進(jìn)行性蛋白尿并伴有結(jié)構(gòu)變化[37]。結(jié)果表明，這些酪氨酸的磷酸化可穩(wěn)定足細(xì)胞形態(tài)。

Nephrin酪氨酸的磷酸化受多種酪氨酸磷酸酶的負(fù)調(diào)控。在幾種致病狀態(tài)下也能檢測到酪氨酸磷酸酶水平的改變。蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)可直接去磷酸化B類的酪氨酸，在大鼠嘌呤霉素氨基核苷腎病(PAN)中上調(diào)[38]。含SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶1(phosphatase 1 of SH2 domain，SHP-1)在糖尿病腎病模型中升高，SHP-1可以使B類的酪氨酸脫磷酸化[39]。C1-Ten最近被鑒定為Nephrin酪氨酸磷酸酶，靶向A類酪氨酸(Y1114和Y1138)，在糖尿病腎病中也上調(diào)[40]。最近的一項研究表明[41]，Nephrin信號通路導(dǎo)致整合素β1的激活。這一發(fā)現(xiàn)提示Nephrin介導(dǎo)的信號調(diào)節(jié)足細(xì)胞附著在腎小球基底膜上。最近Martin等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞損傷后，Nephrin磷酸化出現(xiàn)短暫上升，并與表面Nephrin減少相關(guān)，導(dǎo)致過濾屏障滲漏。揭示了足細(xì)胞損傷期間Nephrin酪氨酸磷酸化的瞬時變化、Nephrin定位和腎小球?yàn)V過屏障完整性之間的體內(nèi)相關(guān)性?？傊?，Nephrin磷酸化決定了集群內(nèi)效應(yīng)蛋白的組成，以動態(tài)調(diào)節(jié)Nephrin周轉(zhuǎn)和足細(xì)胞健康。

5 總 結(jié)

綜上所述，足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過最后的屏障，足細(xì)胞細(xì)胞骨架失調(diào)或SD的完整性喪失可導(dǎo)致足細(xì)胞足突消失，導(dǎo)致蛋白質(zhì)泄漏。Nephrin是SD上重要的組成蛋白，它與SD上的其他組成蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上有著密切的聯(lián)系，對維持SD的正常結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，Nephrin應(yīng)該是蛋白尿新療法最重要的靶點(diǎn)。Nephrin也在SD內(nèi)發(fā)揮著中央信號平臺的作用，Nephrin的磷酸化調(diào)控該區(qū)域的幾個保守酪氨酸殘基影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，信號通路的改變是足細(xì)胞損傷的重要途徑之一。雖然Nephrin信號通路的病理意義尚不明確，但多項研究表明Nephrin各酪氨酸殘基的磷酸化水平受到嚴(yán)格調(diào)控。Nephrin的磷酸化水平受PTP-1B和C1-Ten等磷酸酶活性的調(diào)控。這些磷酸酶可能成為蛋白尿新的治療靶點(diǎn)。