華芳，汪欣然，宋敏，吳瓊，馮芳，龔春霞

（安徽新華學(xué)院藥學(xué)院,安徽合肥 230088）

石榴為石榴科石榴屬植物，石榴花開(kāi)花量大，花期長(zhǎng)，花中含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)，具有延緩衰老、抗過(guò)敏、抗炎等藥理活性。根據(jù)其藥理活性，將其制備成凝膠劑，方便患者使用。關(guān)于其制成凝膠劑后抗氧化活性的測(cè)定研究較少，因此本研究對(duì)石榴花中總黃酮凝膠劑的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為后期石榴的綜合利用提供實(shí)踐基礎(chǔ)[1-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴花，亳州百姓中藥材廠(chǎng)；卡波姆940、蘆丁對(duì)照品，≥98%，上海源葉生物科技有限公司；其余溶劑均為分析純。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；UV-1000可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司；恒溫磁力攪拌器，江蘇常州同宇儀器制造有限公司；電子天平，上海菁海儀器有限公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市金城國(guó)盛實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 石榴花總黃酮的提取

稱(chēng)取適量干石榴花粉碎，在85℃加入10倍量的60%乙醇，回流提取兩次，每次2 h。合并濾液濃縮，至稠膏狀。

1.2.2 凝膠劑的制備

稱(chēng)取0.8 g卡波姆940，溶脹過(guò)夜。加入14 g丙二醇、8 g甘油、0.7 g石榴花提取物和兩滴氮酮。三乙醇胺調(diào)節(jié)pH至6～7，加水至50 mL得到石榴花總黃酮凝膠劑。

1.2.3 總黃酮的含量測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)照品的制備

精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品12.8 mg，用60%乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶中，搖勻，配置出的對(duì)照品溶液濃度為0.128 mg/mL。

1.2.3.2 供試品的制備

精密稱(chēng)取1 g總黃酮凝膠劑，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇稀釋50倍，搖勻。

1.2.3.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL對(duì)照品溶液于6支10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，充分搖勻，置于背陰處5 min。加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置5 min后加入另配制的1 mol/L NaOH 4 mL，60%乙醇定容后靜置10 min。同法配制10 mL空白對(duì)照溶液，該混合溶液中不加入對(duì)照品，最后，在相同波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

1.2.3.4 含量測(cè)定

供試品溶液1 mL，在510 nm處測(cè)吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算凝膠劑中的總黃酮濃度：

式中：X為帶入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)后求得的濃度；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 抗氧化活性的測(cè)定[6-8]

1.2.4.1超氧陰離子清除能力的測(cè)定

將凝膠劑用無(wú)水甲醇配制成0.22 mg/mL、0.88 mg/mL、1.54 mg/mL、2.2 mg/mL、2.86 mg/mL、3.52 mg/mL的不同濃度溶液，并在該濃度梯度下配制Vc對(duì)照品溶液。在配制好的溶液中各取1 mL，加入至4.5 mL pH為8.2的Tris-HCl緩沖液中，加水24 mL，攪拌至充分混合。將水浴鍋溫度設(shè)置為25℃，溶液在其中放置10 min，加入50 mmol/L的連苯三酚溶液0.1 mL，等待3 min，加入0.1 mL 10 mol/L HCl溶液。反應(yīng)結(jié)束后，在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

式中：A為以水替代凝膠溶液；A1為以水替代連苯三酚溶液；A2為不同濃度溶液吸光度。

1.2.4.2 鐵離子還原能力的測(cè)定

將凝膠配制成1.54 mg/mL、2.2 mg/mL、2.86 mg/mL、3.52 mg/mL、4.81 mg/mL、4.84 mg/mL六份不同濃度梯度的溶液，再將Vc配制成相同濃度梯度作為對(duì)照品溶液。配制pH為6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，在配制好的溶液中各加入2.5 mL緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液。設(shè)置水浴鍋溫度為50℃，在其中放置20 min，取出并置于冷水中使其降溫。加入2.5 mL 10%三氯乙酸，離心，用膠頭滴管精密量取上清液2.5 mL于試管中。在試管中加入1 mL的水和1 mL 0.1%的FeCl3，10 min后在700 nm處測(cè)吸光度[28]。

A為被測(cè)物質(zhì)吸光度。

1.2.4.3 羥基自由基清除率的測(cè)定

將石榴花總黃酮凝膠劑稀釋成0.22 mg/mL、0.88 mg/mL、1.54 mg/mL、2.2 mg/mL、2.86 mg/mL、3.52 mg/mL

的不同濃度溶液，分別放置在六支試管中，將配制好的9 mmol/L的FeSO4?7H2O、9 mmol/L的水楊酸溶液以及8.8 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各1 mL依次加入，搖至均勻，放置在37℃的水浴鍋中。30 min后反應(yīng)完全，以水做空白對(duì)照測(cè)吸光度。用同濃度的Vc在相同條件下用同種方法做空白對(duì)照。

式中：A0為以水代替被測(cè)物質(zhì)的空白吸光度；A為被測(cè)物質(zhì)吸光度。

2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和抗氧化活性結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立

回歸方程Y=0.011 5X-0.002 9，R=0.996 7，表明蘆丁在12.8～76.8μg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系（X為濃度，Y為吸光度），凝膠劑中的總黃酮濃度為2.2 mg/mL。

2.2 抗氧化活性結(jié)果

從圖1、圖2、圖3的體外抗氧化活性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，石榴花總黃酮凝膠劑對(duì)超氧陰離子、鐵離子、羥基自由基均具有一定的清除還原能力，但是均弱于Vc。

圖1 超氧陰離子清除能力分析

圖2 鐵離子還原能力分析

圖3 羥基自由基清除率的分析

3 討論和結(jié)論

通過(guò)對(duì)比石榴花總黃酮凝膠劑和Vc對(duì)超氧陰離子、羥基自由基、鐵離子的清除能力和還原力，發(fā)現(xiàn)石榴花總黃酮凝膠劑的體外抗氧化活性總體呈現(xiàn)出增強(qiáng)的趨勢(shì)，但低于Vc。凝膠劑超氧陰離子清除能力最高能達(dá)到71.7%（3.52 mg/mL），清除率達(dá)50%時(shí)濃度為2.2 mg/mL；鐵離子還原能力最高達(dá)1.172（4.84 mg/mL）；羥基自由基清除率最高達(dá)55.6%（3.52 mg/mL），清除率達(dá)50%時(shí)濃度為3.2 mg/mL，結(jié)果表明，石榴花總黃酮凝膠在體外具有一定的抗氧化活性。

石榴花分布廣，資源多，以其為原料制成的總黃酮凝膠劑具有一定的體外抗氧化活性。在新醫(yī)科的背景下，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性，開(kāi)創(chuàng)思維，不斷創(chuàng)新擴(kuò)大石榴花總黃酮凝膠劑的應(yīng)用范圍。