喬云龍，曾曉龍，黃益芃，楊成

（皖南醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

芽孢桿菌（Bacillus sp.），由于能產(chǎn)生多種胞外生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)及飼料工業(yè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1]，其中的抗菌肽類物質(zhì)往往又是該類芽孢桿菌產(chǎn)生的一類主要活性物質(zhì)，它們能夠造成細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄而具有廣譜抗菌、抗病毒、抗原蟲和抗腫瘤等活性[2-3]，而且芽孢桿菌在一定條件下產(chǎn)生芽孢，對(duì)高溫、高壓、強(qiáng)酸堿、擠壓等不良環(huán)境的抵抗力很強(qiáng)，并且具有很強(qiáng)的蛋白酶、淀粉酶等活性，也是開發(fā)新型微生態(tài)多功能劑的首選菌種，且近年來，不斷有新的活性芽孢桿菌菌株及抗菌物質(zhì)被報(bào)道[4-6]，因此，對(duì)芽孢桿菌類微生物進(jìn)行研究，為尋找抗生素的替代物開辟了新途徑，同時(shí)也能在生物防治、微生態(tài)制劑中發(fā)揮重要作用。

本研究從藥用植物車前草組織篩選出一株對(duì)白色念珠菌具有很強(qiáng)抑制活性的芽孢桿菌，擬通過形態(tài)學(xué)觀測(cè)、生理生化特征及分子生物學(xué)手段分析明確該活性菌株種屬分類地位，在此基礎(chǔ)上對(duì)該菌株胞外抗菌活性物質(zhì)的抗菌特性進(jìn)行初步研究，為開發(fā)具有抗白色念珠菌活性代謝產(chǎn)物提供一定的資源。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

芽孢桿菌Y1，白色念珠菌，皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃，15 min；PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，121℃，15 min；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121℃，15 min。

1.1.3 主要試劑與儀器

HBI芽孢桿菌生化鑒定條，批號(hào)20201028，青島海博生物；甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚，分析純，國藥集團(tuán)。

SHZ-82恒溫振蕩器；ESCD ClassII Biohazard Safe?ty Cabinet生物安全柜；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器；BECKMAN COULTER Allegra 64R Centrifuge冷凍離心機(jī)；Olympus顯微鏡；PHS-3C型pH計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 菌株Y1的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將純化Y1菌株接種至NA培養(yǎng)基上，并置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，觀察其菌落特征并染色鏡檢觀察菌體形態(tài)學(xué)特征。

生理生化特征鑒定：《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]方法進(jìn)行測(cè)定。

分子生物學(xué)鑒定：將純化Y1菌株收集菌體，菌株基因組DNA的提取、擴(kuò)增以及測(cè)序純化由上海生工生物工程股份有限公司完成。采用通用引物7F、1540R進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，采用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分類地位。

1.2.2 菌株Y1抗菌活性測(cè)試

參考文獻(xiàn)[8]，將斜面保存的Y1菌株，無菌條件下直接挑取適量接種至發(fā)酵液中，37℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min條件下培養(yǎng)45 h，12 000 r/min，離心30 min收集上清液，0.22μm濾膜過濾兩次，作為無菌發(fā)酵液備用待測(cè)。然后將白色念珠菌的菌液用無菌水將濃度調(diào)整為1×106CFU/mL，用無菌棉棒直接涂布于PDA平板中，用無菌圓紙片蘸取無菌發(fā)酵液，放置培養(yǎng)皿中，以無菌水對(duì)照，輕輕移至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，取平均值作為該樣本抑菌結(jié)果。

1.2.3 粗提物的制備及其抗菌活性測(cè)定

將200 mL上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至膏狀，分別用20 mL甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚抽提5 h，抽提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得抽提物；將抽提物用無菌水配制成100 mg/mL的抽提物溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾兩次，參照1.2.2操作處理并涂布白色念珠菌液，然后放牛津杯，并讓其自然下沉后，吸取100μL抽提物溶液至牛津杯，輕輕移至37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，取平均值作為結(jié)果。

1.2.4 培養(yǎng)基篩選

選擇LB液體培養(yǎng)基、PDA液體培養(yǎng)基、改良PDA液體培養(yǎng)基、NB液體培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基，接種45 h后，使用篩選出的最佳有機(jī)溶劑，仍按1.2.3方法處理，抽提物溶液濃度為100 mg/mL，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，篩選較為理想的培養(yǎng)基。

1.2.5 菌株Y1抗菌粗提物穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 粗提物熱穩(wěn)定性測(cè)定

分別于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃、121℃條件下處理1.2.4中最佳有機(jī)溶劑處理的抽提液30 min，以37℃未處理組為對(duì)照，采用牛津杯法測(cè)定粗提物熱穩(wěn)定性。

1.2.5.2 粗提物的酸堿穩(wěn)定性測(cè)定

分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH將粗提物溶液pH值分別調(diào)為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，室溫處理1 h后，再依次調(diào)節(jié)為原pH，以原始pH為對(duì)照，采用牛津杯法測(cè)定粗提物酸堿穩(wěn)定性。

1.2.5.3 粗提物酶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取粗提物溶液，調(diào)節(jié)至最適pH值后，使各酶的終濃度控制在1 mg/mL，胃蛋白酶（pH=2.0），酸性蛋白酶（pH=3.0），堿性蛋白酶（pH=10.0），蝸牛酶，37℃水浴1 h，再調(diào)整為原始pH值，以相同濃度的未經(jīng)酶處理的粗提物作對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)平行，采用牛津杯法測(cè)定粗提物酶穩(wěn)定性。

1.2.6 最佳培養(yǎng)時(shí)間的確定

按上述篩選的培養(yǎng)基進(jìn)行配制，按1%接種量接種，180 r/min、37℃進(jìn)行培養(yǎng)，每隔4 h取發(fā)酵液30 mL，12 000 r/min，離心30 min收集上清液，旋轉(zhuǎn)蒸干，采用1.2.3中篩選出的最佳有機(jī)溶劑2 mL抽提5 h，負(fù)壓蒸干，將抽提物用無菌水配制成50 mg/mL的抽提物溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾兩次，進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株Y1的形態(tài)學(xué)及生理生化特征

接種于NA培養(yǎng)基，菌株Y1菌落如圖1A所示，菌落乳白色，近圓形，邊緣不規(guī)整，表面較為粗糙，有褶皺。革蘭氏染色觀察如圖1B所示，革蘭氏染色為紫色，陽性菌，菌體呈桿狀，兩端比較圓鈍，芽孢位于菌體中間，呈無色透明折光小體，被菌體包裹。生理生化特征鑒定結(jié)果如表1所示。

圖1 菌株Y1菌落及形態(tài)特征

表1 菌株Y1的生理生化特征

2.2 菌株Y1 16SrDNA序列分析

通過PCR擴(kuò)增菌株Y1的16SrDNA序列，片段大小1383bp。利用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株Y1與芽孢桿菌屬中貝萊斯芽孢桿菌（Bacil?lus velezensisHSB1）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliq?uefaciensBV2007）、枯 草 芽 孢 桿 菌（Bacillus subtilisY17B）等菌株序列相似性均為100%（覆蓋率100%）。選取與該種菌株同源性接近的菌株，使用軟件Mega7.0構(gòu)建基于16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），鑒于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌不能產(chǎn)生卵磷酯酶[9-10]，因此，初步將菌株Y1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖2 基于16SrDNA序列構(gòu)建的菌株Y1發(fā)育樹

2.3 拮抗性芽孢桿菌Y1抗菌活性的檢測(cè)

拮抗性芽孢桿菌Y1對(duì)白色念珠菌表現(xiàn)的拮抗性結(jié)果見圖3B所示，菌株Y1發(fā)酵液上清液對(duì)供試白色念珠菌具有明顯的抑制活性，見圖3C所示，抑菌圈平均直徑達(dá)到（20.4±0.5）mm，而無菌水對(duì)照組（A）沒有出現(xiàn)抑菌圈，表明菌株Y1對(duì)供試的白色念珠菌具有明顯的抗菌活性，且抗菌成分可能存在發(fā)酵液中。

圖3 菌株Y1對(duì)白色念珠菌拮抗性及抗菌活性

2.4 粗提物的活性測(cè)定

根據(jù)抗菌活性測(cè)試結(jié)果可知，抗菌活性可能存在于發(fā)酵液中，因此，通過牛津杯法測(cè)定不同提取劑（甲醇、氯仿、正丁醇、乙醚）抽提物抗菌活性，其結(jié)果如圖4所示，甲醇抽提的粗提物活性最高，抑菌直徑達(dá)（38±0.4）mm，而乙醚則毫無活性，提示該抗菌活性物質(zhì)的極性較大。

圖4 不同有機(jī)溶劑抽提物抑菌活性比較

2.5 不同培養(yǎng)基對(duì)抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

為了提高菌株Y1抗菌物質(zhì)產(chǎn)量，在同種發(fā)酵條件下，采用常見的5種培養(yǎng)基對(duì)菌株Y1進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙氏液體培養(yǎng)基與改良PDA液體培養(yǎng)基可以獲得相對(duì)較好的抑菌活性，抑菌直徑均超過了40 mm，如圖5所示，且考慮到改良PDA液體培養(yǎng)基原料易得，成本相對(duì)較低，因此，采用改良PDA液體培養(yǎng)基作為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵培養(yǎng)基，其抑菌效果見圖6所示。

圖5 不同培養(yǎng)基抗菌活性比較

圖6 改良PDA培養(yǎng)基的抗菌活性測(cè)試結(jié)果

2.6 菌株Y1抗菌粗提物穩(wěn)定性研究

2.6.1 粗提物熱穩(wěn)定性

由圖7可知，粗提物在90℃以下處理30 min后仍然具有較為穩(wěn)定的抗菌活性，100℃處理后，抑菌活性降低至約83%，121℃高溫高壓30 min后活性完全喪失，結(jié)果表明，粗提物抑菌活性在90℃以下具有很好的熱穩(wěn)定性。

圖7 不同溫度處理粗提物后的抑菌活性

2.6.2 粗提物酸堿穩(wěn)定性

由圖8可知，粗提物在不同pH處理1 h后，在pH 2.0～8.0具有較穩(wěn)定抗菌活性和很好的酸堿穩(wěn)定性，如圖8所示，抑菌圈直徑與對(duì)照組基本相同。與毛馨[11]等人的研究結(jié)果相似，當(dāng)pH=10時(shí)，可能恰好是抑菌活性物質(zhì)最適pH值，抑菌圈最大，達(dá)到約（50±0.8）mm，如圖8所示，pH>10.0時(shí)，粗提物抑菌活性降低?？梢?，強(qiáng)堿性條件下粗提物活性會(huì)受到抑制。

圖8 不同p H下粗提物抗菌活性比較

2.6.3 粗提物酶穩(wěn)定性

由圖9可知，粗提物在經(jīng)過酸性蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和蝸牛酶處理后抗菌活性沒有明顯減弱，具有較好的穩(wěn)定性。

圖9 粗提物的酶穩(wěn)定性比較

2.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗菌活性的影響

抑菌活性隨著培養(yǎng)時(shí)間變長(zhǎng)而迅速增強(qiáng)，在發(fā)酵至44 h時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到最大（37.1±0.2）mm，隨后抑菌活性逐漸減弱，這可能是因?yàn)榫w生長(zhǎng)速度快，導(dǎo)致營養(yǎng)成分不足，限制了活性代謝物質(zhì)的產(chǎn)出，結(jié)果如圖10所示。

圖10 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗菌活性的影響

3 討論

貝萊斯芽孢桿菌[12]相比枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和蘇蕓金芽孢桿菌等，分類地位確定比較晚，是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種。目前，研究者已分離獲得多株具有抗菌活性的貝萊斯芽孢桿菌[13-16]。本研究從車前草中分離獲得一株對(duì)白色念珠菌具有抑制活性的貝萊斯桿菌Y1，經(jīng)濾紙片法測(cè)定該菌株Y1無菌發(fā)酵液抑菌圈平均直徑為（20.4±0.5）mm。通過發(fā)酵上清液抗菌抽提粗體物穩(wěn)定性及最佳培養(yǎng)時(shí)間測(cè)試，表明該抗菌成分具有一定的耐熱性，90℃處理后抑菌活性開始下降，到121℃喪失活性；當(dāng)pH>10.0時(shí)，粗提物抑菌活性降低；對(duì)蛋白水解酶的水解作用穩(wěn)定性較好，培養(yǎng)到44 h抗菌活性最好，這有利于該菌株進(jìn)一步大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，開展活性代謝產(chǎn)物的分離純化。因此，接下來對(duì)其產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)進(jìn)行研究，旨在揭示該菌株Y1產(chǎn)生的抗真菌活性成分，為完善貝萊斯芽孢桿菌的拮抗物質(zhì)研究提供依據(jù)。