張正偉 吳佳玉 李 斌

膽結(jié)石是臨床常見的肝膽系統(tǒng)疾病，其中膽固醇結(jié)石是最常見的結(jié)石類型，目前尚缺乏有效的藥物治療手段，臨床上以外科手術(shù)切除膽囊為重要的治療方式。中醫(yī)理論認(rèn)為膽結(jié)石屬于“膽脹”“脅痛”“虛勞”范疇，濕濁和熱毒分別作為陰邪和陽邪在膽結(jié)石的形成中起到重要作用，濁毒理論也是中醫(yī)理論中膽結(jié)石形成的重要理論[1，2]。鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院藥學(xué)部以濁毒理論為基礎(chǔ)，將化濁解毒法作為治療大法，自擬茵連化濁解毒湯為基礎(chǔ)方用于膽結(jié)石的治療，為了明確該湯劑治療膽結(jié)石的效果，本研究通過高脂、高膽固醇、高熱量的導(dǎo)石飼料喂養(yǎng)的方式建立了膽結(jié)石小鼠模型，用茵連化濁解毒湯干預(yù)后分析了血生化指標(biāo)、膽汁代謝譜及肝臟內(nèi)膽汁酸代謝蛋白Abcb11、Abcc2的表達，旨在為臨床實踐中應(yīng)用茵連化濁解毒湯治療膽結(jié)石提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料選擇C57BL/6雄性小鼠作為實驗動物，許可證號：SCXK(豫)2020-0002，購買于普萊柯生物工程有限公司。茵連化濁解毒湯(黃芩9 g，黃連6 g，蒲公英15 g，砂仁6 g，豆蔻9 g，茯苓15 g，白術(shù)10 g，半枝蓮9 g，白花蛇舌草15 g)由醫(yī)院藥劑科配制，濃縮得到含有0.72 g/ml生藥的藥液。超純RNA提取試劑盒(DNase I)、SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑購自北京康為世紀(jì)公司。生化分析儀購自Nova公司，熒光定量PCR儀購自Bio-rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及實驗方法C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組。模型組和實驗組小鼠按照下列方法建立膽結(jié)石模型：給予高脂、高熱量、高膽固醇(脂肪15%、膽固醇1%、膽酸0.5%)的飼料進行喂養(yǎng)、連續(xù)8周。實驗組小鼠在高脂、高熱量、高膽固醇飼料喂養(yǎng)的過程中給予茵連化濁解毒湯10 ml/kg灌胃，每日1次；對照組及模型組小鼠給予生理鹽水10 ml/kg灌胃。

1.2.2 血液指標(biāo)的測定造模8周，處死大鼠后采集血液標(biāo)本，在全自動生化分析儀中測定總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)的含量。

1.2.3 膽汁代謝指標(biāo)的測定造模8周，處死大鼠后采集膽汁標(biāo)本，在全自動生化分析儀中測定總膽汁酸(TBA)、丙氨酸(Gla)及TC、LDL-C的含量。

1.2.4 肝臟中Abcb11、Abcc2表達的測定造模8周后，處死大鼠后采集肝臟組織，采用超純RNA提取試劑盒(DNase I)和SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒進行實驗，分離肝臟中的RNA并合成為cDNA；取cDNA與UltraSYBR Mixture試劑混合為PCR反應(yīng)體系，通過PCR反應(yīng)擴增Abcb11、Abcc2，根據(jù)擴增曲線計算mRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件錄入數(shù)據(jù)，3組間計量資料的分析采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血生化指標(biāo)比較與對照組比較，模型組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯升高，HDL的含量明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實驗組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯減少，HDL的含量明顯升高(P<0.05)。見表1、表2。

表1 3組小鼠血液中肝功能相關(guān)生化指標(biāo)比較 (只，

表2 3組小鼠血液中脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)比較(只，

2.2 3組小鼠膽汁代謝指標(biāo)比較與對照組比較，模型組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，實驗組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯減少(P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠膽汁代謝指標(biāo)比較 (只，

2.3 3組小鼠肝臟中Abcb11、Abcc2表達水平比較與對照組比較，模型組肝臟中Abcb11、Abcc2的mRNA表達水平明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，實驗組肝臟中Abcb11、Abcc2的mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組小鼠肝臟中Abcb11、Abcc2表達水平比較 (只，

3 討論

中醫(yī)學(xué)中的濁毒理論是受到廣泛認(rèn)可的膽結(jié)石發(fā)病的中醫(yī)病機，濕濁和熱毒分別屬于陰邪和陽邪，能夠引起“膽脹”“脅痛”“虛勞”的發(fā)生，根據(jù)濁毒理論對膽結(jié)石進行干預(yù)能夠起到確切效果[3]。本研究為了明確濁毒理論在膽結(jié)石治療中的價值，首先通過高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)建立了膽結(jié)石動物模型。膽固醇結(jié)石是最常見的膽結(jié)石類型，高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)能夠引起體內(nèi)膽固醇代謝異常、引起膽固醇結(jié)晶形成，同時膽結(jié)石形成后造成肝內(nèi)膽汁淤積并出現(xiàn)肝功能損害[4，5]。在建立膽結(jié)石模型后分析血液中肝功能及脂代謝相關(guān)生化指標(biāo)的變化可知：模型組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯升高，HDL的含量明顯減少，提示高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料飼養(yǎng)所建立的膽結(jié)石小鼠模型存在脂代謝紊亂、肝功能異常。

鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院藥學(xué)部以濁毒理論為基礎(chǔ)，將化濁解毒法作為治療大法，自擬茵連化濁解毒湯用于膽結(jié)石的治療，該方劑中的黃芩、黃連、蒲公英、砂仁、豆蔻、茯苓、白術(shù)、半枝蓮、白花蛇舌草等中藥材能夠起到清熱解毒、通絡(luò)祛瘀的功效，能夠針對膽結(jié)石的中醫(yī)病機起到化濁解毒的作用[6]。近代藥理學(xué)研究證實，茵連化濁解毒湯中的多種中藥材具有細(xì)胞保護作用，能夠起到穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗炎抗氧化等作用[7，8]。本研究的實驗組在高脂肪、高膽固醇、高熱量飼料的飼養(yǎng)過程中給予茵連化濁解毒湯進行灌胃干預(yù)，旨在發(fā)揮該湯劑的化濁解毒作用，通過分析干預(yù)后的血生化指標(biāo)可知：實驗組血液中TBIL、DBIL、ALT、AST、TC、LDL-C的含量明顯低于模型組，HDL的含量明顯高于模型組，提示茵連化濁解毒湯對膽結(jié)石模型小鼠的肝功能及脂代謝均具有改善作用。

膽汁分泌及代謝的異常在膽固醇結(jié)石形成的過程中起到重要作用，膽汁中的主要成分為膽汁酸，同時還含有Gla、苯丙氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸等多種代謝產(chǎn)物[9]。膽汁分泌的異常及膽固醇結(jié)石的形成存在相互促進、相互作用的關(guān)系，膽汁分泌的異常能夠誘導(dǎo)膽固醇結(jié)石的形成、膽固醇結(jié)石形成后對膽管的阻塞會加重膽汁分泌的異常[10]。本研究在造模后分析了膽結(jié)石模型小鼠膽汁中代謝指標(biāo)的變化并發(fā)現(xiàn)：模型組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯升高，提示膽結(jié)石模型小鼠的膽汁代謝發(fā)生了明顯的紊亂。在使用茵連化濁解毒湯灌胃干預(yù)后觀察到：實驗組膽汁中TBA、Gla、TC、LDL-C的含量明顯低于模型組，提示茵連化濁解毒湯對膽結(jié)石模型小鼠的膽汁代謝具有改善作用。

ATP結(jié)合盒超家族的成員Abcb11及Abcc2在膽汁酸的分泌、肝膽管細(xì)胞內(nèi)外膽汁酸的運輸中起到重要調(diào)控作用。Abcb11作為肝細(xì)胞的膽汁酸輸出泵，參與牛磺酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸等膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運，能夠促進肝膽管細(xì)胞內(nèi)外膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運[11]；Abcc2主要參與有機陰離子從肝細(xì)胞向膽汁的分泌[12]。當(dāng)Abcb11及Abcc2表達發(fā)生異常時，膽汁酸鹽及相應(yīng)陰離子的分泌發(fā)生障礙，進而出現(xiàn)膽汁代謝的障礙及膽囊結(jié)石的形成。本研究對肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2表達的分析顯示：模型組肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達水平明顯減少，而實驗組肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達水平明顯升高。由此表明茵連化濁解毒湯對膽結(jié)石模型小鼠肝臟內(nèi)Abcb11及Abcc2的表達具有促進作用，這可能是茵連化濁解毒發(fā)揮膽結(jié)石治療作用的分子機制。

綜上所述，茵連化濁解毒湯用于膽結(jié)石小鼠能夠通過增加Abcb11、Abcc2的表達來改善肝功能、調(diào)節(jié)膽汁代謝，該湯劑是治療膽結(jié)石的潛在藥物。