肖雪蓮，劉潤坤，涂康生

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，陜西西安710000）

原發(fā)性肝癌是世界第五大常見腫瘤，其中75%～85%為肝細胞癌（HCC），而中國該病發(fā)病例數(shù)約占全球的45.3%[1]。盡管現(xiàn)有治療手段如手術(shù)切除、局部射頻消融治療和介入治療等取得了不錯的進展，但由于較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率，HCC 患者的5年生存率仍不到12%[2]。越來越多的研究表明在HCC 中存在大量分子的異常表達，在癌癥進程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3-4]。進一步探索HCC 進展的機制將有助于治療方法的改進，最終改善患者預(yù)后。

實體腫瘤中，由于腫瘤細胞的快速增長對氧的大量消耗導(dǎo)致缺氧微環(huán)境的產(chǎn)生，缺氧進一步誘導(dǎo)腫瘤細胞適應(yīng)性地表達缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），而HIF-1α 參與調(diào)控多種靶基因的表達，進而促進腫瘤細胞的多種惡性生物學(xué)行為[5-6]。長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNA）是一類長度＞200 核苷酸的非編碼RNA，在包括HCC 在內(nèi)的多種腫瘤中表達紊亂，并影響患者預(yù)后[7-8]。研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，缺氧不僅可以調(diào)控蛋白編碼基因的表達，同時也可以誘導(dǎo)lncRNA 的表達。缺氧誘導(dǎo)的lncRNA 表達可通過多種機制影響細胞的增殖、遷移和代謝，進而影響患者預(yù)后[11-12]。然而，仍有很多缺氧反應(yīng)性lncRNA，以及這些lncRNA 調(diào)控腫瘤進程的機制有待發(fā)現(xiàn)。本研究通過芯片發(fā)現(xiàn)了HCC 細胞中的缺氧反應(yīng)性lncRNA AC114803，并進一步探索了其對HCC 生物學(xué)功能的影響及可能的機制，以期更好地理解HCC 進展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究下載了TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）中HCC 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（HCC 組織374 例，正常組織50 例），同時獲取了患者的生存時間。

1.2 實驗材料

人HCC 細胞系HCCLM3 和Hep3B 購買于中科院上海細胞庫，缺氧培養(yǎng)箱（PHCbi），Dulbecco 的改良Eagle 培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM） （Sigma）， 青霉素- 鏈霉素雙抗（HyClone），胰酶及胎牛血清（Gibco），RNA 提取試劑TRIzol（Life technologies），RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermFisher）， SYBR Premix Ex Taq ? II Kit（Takara），AC114803 過表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒、AC114803 引物，18S 引物（北京擎科），RIPA 細胞裂解液，BCA 蛋白定量試劑盒，5×蛋白示蹤緩沖液，轉(zhuǎn)染試劑lip8000，CCK-8 試劑盒（碧云天），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescent，ECL）試劑（Millipore），N-cadherin，E-cadherin，vimentin，β-actin 抗體（Proteintech），bcl-2，bax，CCND1 抗體（Santa Cruz）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人HCC 細胞HCCLM3 和Hep3B 培養(yǎng)于含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，并放置于5%CO2或1%O2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 lncRNA 芯片 Hep3B 細胞分別在常氧（20%O2）和缺氧（1%O2）條件下培養(yǎng)48 h，然后，使用TRIzol 試劑從Hep3B 細胞中分離總RNA，通過NanoDrop ND-1000 測量RNA 數(shù)量和質(zhì)量。根據(jù)制造商的標準方案，應(yīng)用上海數(shù)譜生物的Arraystar Human LncRNA Arrays V5 芯片鑒定不同培養(yǎng)條件下Hep3B 表達的lncRNA 和 mRNA。 芯片數(shù)據(jù)（GSE155505）被上傳到GEO 數(shù)據(jù)庫。

1.3.3 細胞轉(zhuǎn)染 將處于生長對數(shù)期的HCCLM3 和Hep3B 細胞計數(shù)，按照3×105個細胞/孔接種于6 孔板中，待細胞融合度達約50%時進行轉(zhuǎn)染。按照lip8000 試劑轉(zhuǎn)染說明書，將2.5 μg AC114803 質(zhì)粒或陰性對照質(zhì)粒稀釋至125 μL 無血清培養(yǎng)基，4 μL lipo8000 稀釋至125 μL 無血清培養(yǎng)基，兩者混合后加入6 孔板細胞中，24 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。48 h 收取細胞并提取RNA 進行qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率，同時收取細胞并提取蛋白進行蛋白質(zhì)免疫印記實驗，其余細胞進行后續(xù)功能學(xué)試驗。

1.3.4 RNA 提取和qRT-PCR 參照TRIzol 說明書將TRIzol 加入細胞中提取總RNA。用核酸儀測定RNA 濃度后，取1 μg RNA 按PrimeScript RT 試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,反應(yīng)條件為：16 ℃30 min，42 ℃30 min，72 ℃10 min。取3 μL cDNA按照SYBR Premix Ex Taq?II Kit 說明書進行qRTPCR，反應(yīng)條件為：98 ℃10 min，98 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共50 個 循環(huán)。反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR 在BIO-RAD CFX96 上進行。AC114803 正向：5'-CCT CTG GGG ACT TGG ACT GAT-3'，反向：5'-TGC TCT GG TGT CCT CTC TGT A-3'；以 人18s 為內(nèi)參，18s 正向：5'-CGG CGA CGA CCC ATT CGA AC-3'，反向：5'-GAA TCG AAC CCT GAT TCC CCG TC-3'。采用2-ΔΔCt法計算AC114803 的相對表達量。

1.3.5 CCK-8 試驗 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后按5 000 個/孔接種于96 孔板，每組實驗設(shè)5 個復(fù)孔。于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度值（OD 值）。

1.3.6 細胞劃痕試驗 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，用槍頭在每孔細胞中十字交叉畫出4 條直線，PBS 洗滌細胞，加入新鮮培養(yǎng)液，拍照，此時為0 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后拍照為48 h。細胞遷移率=（寬度0h-寬度48h）/寬度0h×100%。

1.3.7 Western blotting 試驗 按照RIPA 試劑盒步驟，在4 ℃條件下充分裂解細胞提取總蛋白。采用BCA 法進行蛋白定量，取20 μg 總蛋白加入5×上樣緩沖液后100 ℃煮沸5 min 變性蛋白。將變性蛋白質(zhì)在10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠上電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用5%封閉牛奶封閉2 h，膜與一抗（Ncadherin：1∶2 000；E-cadherin：1∶2 000；vimentin：1∶1 000；bcl-2：1∶1 000；bax：1∶1 000；CCND1：1∶1 000；β-actin：1∶2 000）4 ℃孵育過夜，將膜與二抗（1:3 000）室溫孵育1 h，用ECL 發(fā)光液顯影，最后用Amersham?Imager 680 凝膠成像儀拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析。符合正態(tài)分布、方差齊性的計量資料的兩組間比較使用t檢驗，方差不齊性計量資料的兩組間比較使用非參數(shù)檢驗。表達量采用均數(shù)±標準差（±s）表示。根據(jù)AC114803 表達中位值將患者分為高、低表達組，使用R 語言的survival 包繪制生存曲線，采用Kaplan-Meier 法計算其與生存的相關(guān)性。P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧對HCC細胞AC114803表達的影響

將Hep3B 細胞缺氧處理48 h 后通過芯片檢測缺氧相關(guān)的lncRNA，結(jié)合TCGA 預(yù)后分析，圖1A展示了與HCC 患者預(yù)后有關(guān)的缺氧誘導(dǎo)變化倍數(shù)較大的lncRNA。通過qRT-PCR 進一步驗證，發(fā)現(xiàn)在HCC 細 胞HCCLM3 和Hep3B 中 僅AC114803 可 被缺氧誘導(dǎo)表達（圖1B-C）。

2.2 AC114803表達與HCC患者預(yù)后的關(guān)系

通過TCGA 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)AC114803 在HCC 組織中表達水平明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖2A）。根據(jù)AC114803 表達中位值將患者分為高表達組和低表達組，采用Kaplan-Meier 法計算其與總生存時間的相關(guān)性，生存曲線顯示，AC114803 高表達組患者的總生存率明顯低于AC114803 低表達組（P＜0.05）（圖2B）。以上結(jié)果提示AC114803 在HCC 中可能發(fā)揮促癌作用。

2.3 AC114803對HCC細胞增殖的影響

在 HCC 細胞 HCCLM3 和 Hep3B中轉(zhuǎn)染AC114803 過表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，用RTqPCR 檢測轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示AC114803 質(zhì)粒組和陰性對照組的AC114803 相對表達量分別是345 310±27 377 和1.000±0.271（HCCLM3），70 510±2 589 和1.000±0.164（Hep3B），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（ 圖3A-B）。 通 過CCK-8 試驗檢測AC114803 對細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示，自轉(zhuǎn)染后第3 天，AC114803 過表達組細胞增殖能力明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖3C-D），提示過表達AC114803 可以促進HCC 細胞的增殖能力。

2.4 AC114803對HCC細胞遷移的影響

為了進一步探索AC114803 對細胞遷移能力的影 響， 在HCC 細 胞HCCLM3 和Hep3B中轉(zhuǎn)染AC114803 過表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒48 h 后進行細胞劃痕試驗。結(jié)果顯示AC114803 質(zhì)粒組和陰性對照組的細胞遷移率分別為0.490±0.018 和0.296±0.084 （HCCLM3）， 0.507±0.065 和 0.312±0.056（Hep3B），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4A-B），提示過表達AC114803 可以促進HCC 細胞的遷移能力。

2.5 AC114803對細胞增殖和遷移相關(guān)蛋白表達的影響

為了揭示AC114803 促進HCC 細胞增殖和遷移能力的潛在機制，在HCC 細胞HCCLM3 和Hep3B 中轉(zhuǎn)染了AC114803 過表達質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒，48 h后檢測了細胞增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示AC114803 過表達組間葉細胞標志物N-cadherin和vimentin 表達上調(diào)，而上皮細胞標志物E-cadherin表達下調(diào)，提示AC114803 可能通過促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進細胞的遷移；同時發(fā)現(xiàn)AC114803 過表達組抗凋亡蛋白bcl-2 表達上調(diào)而促凋亡蛋白bax表達下調(diào)，細胞周期蛋白CCND1 表達上調(diào)，提示AC114803 可能通過抑制細胞的凋亡、調(diào)控細胞周期促進HCC 細胞的增殖（圖5）。

3 討 論

HCC 中存在大量基因的表達紊亂，包括編碼基因和非編碼基因[13]。lncRNA 作為非編碼基因，在HCC 中常異常表達并參與調(diào)控腫瘤進程[14-15]。肝腫瘤中常存在不同程度的缺氧，并導(dǎo)致HIF-1α 適應(yīng)性的激活，從而改變下游靶基因的表達[5,16]。因此，進一步地探索缺氧反應(yīng)性lncRNA 與HCC 的關(guān)系將有助于更好地理解HCC 發(fā)生發(fā)展的分子機制[17-18]。本研究通過芯片檢測發(fā)現(xiàn)缺氧可誘導(dǎo)Hep3B 細胞中多種lncRNA 的表達，并進一步通過qRT-PCR 在HCC 細胞中驗證發(fā)現(xiàn)了一個新的缺氧誘導(dǎo)性lncRNA AC114803。通過TCGA 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)AC114803 在腫瘤組織中表達上調(diào)，其高表達與患者預(yù)后不良有關(guān)，提示AC114803 可能參與調(diào)控HCC 的疾病進程。研究報道多種缺氧反應(yīng)性lncRNA 如AC099850.4、MIR210HG 和NRAV可聯(lián)合作為HCC 的獨立預(yù)后標志物[19]。這些研究結(jié)果表明缺氧反應(yīng)性lncRNA 可能參與調(diào)控了腫瘤進展，進而影響患者預(yù)后。

缺氧反應(yīng)性lncRNA 通過影響腫瘤的多種生物學(xué)行為調(diào)控腫瘤進展，如腫瘤細胞的增殖、遷移、血管侵犯、代謝特性等[11-12,20]。 本研究發(fā)現(xiàn)AC114803 可促進HCC 細胞的增殖和遷移，進一步機制探索發(fā)現(xiàn)AC114803 促進抗凋亡基因bcl-2 表達，而抑制促凋亡基因bax 表達，同時促進細胞增殖標志物CCND1 的表達，提示AC114803 可能通過抑制細胞的凋亡促進細胞的增殖。多個研究表明缺氧誘導(dǎo)lncRNA 表達上調(diào)，并通過不同機制促進腫瘤細胞的增殖。Wang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)MIR31HG 通過靶向作用于HIF-1α 和P21 調(diào)控細胞周期進程，抑制細胞凋亡，從而促進頭頸癌細胞的增殖。Zhou 等[22]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α 可以激活lncRNA RAET1K 轉(zhuǎn)錄，RAET1K 沉默顯著抑制HCC 細胞增殖和侵襲并阻斷缺氧誘導(dǎo)的乳酸濃度和葡萄糖攝取的增加，提示缺氧誘導(dǎo)性lncRNA 可能作為潛在的治療靶點。另外，本研究發(fā)現(xiàn)AC114803 可促進間葉細胞標志物N-cadherin 和vimentin 的表達，而抑制上皮細胞標志物E-cadherin 的表達， 表明AC114803 可能促進HCC 細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程，減弱細胞的黏附能力，從而促進細胞的遷移。EMT 是上皮細胞獲得間質(zhì)細胞特征的過程，在上皮腫瘤中常被激活，從而促進腫瘤細胞遷移、腫瘤干性和化療抵抗等[23-24]。lncRNAs 可通過調(diào)控EMT 過程影響腫瘤進展，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-PNUTS 通過靶向作用于miR-205 激活乳腺癌細胞的EMT 過程，表現(xiàn)為vimentin 表達增強和E-cadherin 表達減弱，最終促進癌細胞的遷移和侵襲[25]。

由于缺氧可誘導(dǎo)HIF-1α，HIF-2α 等多種分子表達上調(diào)[26]，后期需要進一步探索缺氧是通過何種機制誘導(dǎo)AC114803 的表達。lncRNA 可競爭性結(jié)合相應(yīng)的miRNA 而相互調(diào)控[27-28]，也可以通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控基因的表達等機制影響細胞的增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)行為[29-30]，故下一步需要探究AC114803 具體通過哪個靶點來調(diào)控增殖和遷移相關(guān)蛋白的表達。

總之，本研究新發(fā)現(xiàn)了HCC 中的缺氧誘導(dǎo)性lncRNA AC114803，其高表達導(dǎo)致患者預(yù)后不良,這可能與AC114803 促進HCC 細胞的增殖和遷移能力有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。