覃國新，閆飛燕，周其峰，李慧玲，勞水兵，楊玉霞，莫仁甫，羅麗紅，陳泳锨，何潔，韋宇寧，王海軍

（廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全與檢測技術研究所，農(nóng)業(yè)部甘蔗品質監(jiān)督檢驗測試中心(南寧)，廣西南寧 530007）

豆芽作為人們日常餐桌上的蔬菜之一，其營養(yǎng)豐富，富含維生素C、維生素A、氨基酸、膳食纖維等有易于人體健康的成份，深受人們的喜愛[1]。然而，為了提高豆芽產(chǎn)量，有不法商販在豆芽種植生產(chǎn)過程中濫用添加劑（如植物激素、化學試劑、抗生素等），致使有關“毒豆芽”的事件時有報道，使人們對食用豆芽存在一定的安全隱患。由于植物激素能參與調控植物生長和發(fā)育的全過程[2-4]，成為了不法商販主要濫用的添加劑之一。吲哚乙酸（Indole acetic acid，IAA）作為重要的植物激素之一，對植物的生長、分化起著極其重要的調節(jié)控制作用[5,6]。在豆芽種植過程中使用IAA不僅能促進豆芽生長發(fā)育縮短生產(chǎn)周期，而且能提高產(chǎn)量，但是盲目或者過量的使用該植物激素，勢必會造成環(huán)境污染、殘留量超標、危害人們身體健康等與“毒豆芽”事件息息相關的問題[7,8]。然而，我國國家標準尚未規(guī)定吲哚乙酸在豆芽中的殘留限量值，也未查到豆芽中吲哚乙酸殘留檢測的國家標準。因此，建立簡單、快速、準確的方法檢測豆芽中吲哚乙酸殘留尤為重要。

目前，測定吲哚乙酸的方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[9]、化學發(fā)光分析法[10]、氣相色譜法[11]、高效液相色譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[13]等。其中，酶聯(lián)免疫分析方法雖然儀器操作簡單且分析速度快，但容易造成假陽性，定性和定量同時存在問題；化學發(fā)光分析法背景干擾較大且檢測過程操作較復雜；氣相色譜法需要柱前衍生，明顯增加了影響因素；液相色譜-串聯(lián)質譜法同時具有高靈敏度和高選擇性好的優(yōu)勢[14]，但面臨儀器購置和運行成本高昂等問題，難以實現(xiàn)普及；高效液相色譜分析法因具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、準確性可靠、儀器較容易普及等優(yōu)點而備受關注。但由于豆芽樣品本身存在一定的基質干擾，按傳統(tǒng)固相萃取凈化方法前處理，操作繁瑣、費時，難于滿足大批樣品的快速檢測需求。

QuEChERS前處理技術是2003年由Anastassiades等開發(fā)并用于植物源性食品中農(nóng)藥多殘留檢測的樣品前處理，因其具有簡單、快速、有效、可靠等優(yōu)點而獲得廣泛應用[15,16]。近年來，水果和蔬菜中農(nóng)藥多殘留色譜分析檢測一般都選擇 QuEChERS方法進行樣品前處理[17,18]，而多功能針式過濾器（F-QuEChERS）是基于QuEChERS原理，在通過式固相固相萃取凈化的基礎上[19]，將提取溶液的凈化和過濾集于一步完成而建立的色譜分析樣品前處理方法，不僅具有QuEChERS方法的優(yōu)點，而且還節(jié)省了振搖凈化和離心的多個環(huán)節(jié)。將多功能針式過濾器方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)固相萃取凈化方法，不僅能簡化繁瑣的步驟，縮短樣品前處理時間，而且能有效降低樣品本身帶來的基質效應，從而有效解決傳統(tǒng)固相萃取凈化方法操作繁瑣費時的問題。本實驗在前人研究的基礎上，基于F-QuEChERS原理，建立了多功能針式過濾器-高效液相色譜（HPLC）法快速檢測豆芽中的吲哚乙酸，方法操作簡便，快速準確，能滿足豆芽中吲哚乙酸殘留快速檢測的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀配置有二級管陣列檢測器，美國 Waters公司；色譜柱 XDB-C18（4.6 mm×250，5 μm），Agilent；DS-1 型高速組織搗碎機，上海標模儀器廠；LD5-2A型低速離心機，北京京立離心機有限公司；多功能針式過濾器F-QuEChERS（含150 mg MgSO4、50 mg乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）PSA、50 mg十八烷基鍵合相硅膠（C18）、5 mg石墨化碳黑（GCB）），天津阿爾塔科技有限公司。

吲哚乙酸（純度≥99.6%，m/m），上海安譜試驗科技股份有限公司；甲酸、乙酸、乙腈（色譜純），賽默飛世爾（中國）科技有限公司。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取適量的吲哚乙酸標準品，用乙腈配制成濃度為1000 mg/L的標準儲備容液；準確吸取標準儲備液，用乙腈稀釋成濃度為100 mg/L的標準中間溶液；接著用乙腈逐級稀釋標準中間溶液，配制得到0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L系列的乙腈標準工作溶液。

1.3 樣品的前處理

提?。喝⌒迈r豆芽試樣（購于本地市場）用組織搗碎機搗碎并混勻后，準確稱取10.00 g，加入10.0 mL 1%乙酸乙腈提取液，渦旋提取2 min后，再加入1 g氯化鈉、2 g無水硫酸鎂后，接著渦旋提取1 min，最后以4000 r/min轉速離心5 min，收集上清液待凈化。

凈化：取上述上清液1.5 mL以2滴/s的速度通過多功能針式過濾器F-QuEChERS于進樣瓶中，供高效液相色譜測定。

1.4 高效液相色譜的檢測條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），Agilent；柱溫：35 ℃；流速 1.0 mL/min；進樣量10.0 μL。流動相A：乙腈，流動相B：0.1%甲酸溶液。梯度洗脫程序為：0～2.0 min，10% A；2.0～3.0 min，10%～40% A；3.0～4.0 min，40% A；4.0～5.0 min，40%～80% A；5.0～6.0 min，80% A；6.0～7.0 min，80%～40% A；7.0～8.0 min，40% A；8.0～9.0 min，40%～10% A；9.0～10.0 min，10% A；檢測波長：267 nm。

2 結果與討論

2.1 提取條件的選擇

眾所周知，農(nóng)藥殘留檢測樣品前處理通常使用的提取溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等。根據(jù)目標農(nóng)藥的理化性質，本實驗對比了甲醇、乙腈、酸化甲醇及酸化乙腈作為提取溶劑對目標物的提取效果，實驗發(fā)現(xiàn)，甲醇和乙腈對吲哚乙酸都有較好的提取效率，但甲醇提取所得成分更復雜，提取液較難凈化，檢測干擾較大。而吲哚乙酸在酸性條件下提取效果更好，通過實驗研究表明，1.0%的乙酸乙腈提取樣品中的吲哚乙酸，其回收率達到80%以上，均比其它幾種溶劑的提取效果好。因此，實驗以濃度為1.0%的乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本實驗分別對比了甲醇和乙腈作為高效液相色譜法的流動相時的分離效果，實驗發(fā)現(xiàn)當采用乙腈時得到響應值較高且的峰形較好；同時，考察不同濃度甲酸水溶液（0.01%、0.05%、0.1%、0.5%）為流動相的響應效果，實驗發(fā)現(xiàn)當甲酸水溶液濃度為0.1%時得到的峰形及響應值均最佳，且在優(yōu)化的色譜條件下，待測植物激素在豆芽基質中能達到良好的基線分離（分離色譜圖如圖1所示），因此，選擇了乙腈-0.1%甲酸溶液作為分離分析的流動相進行梯度洗脫，由圖可見，豆芽基質不干擾目標物的分離測定。

2.3 凈化方式的選擇

高效液相色譜法分析植物源性樣品的農(nóng)藥殘留，色譜分析容易受樣品基質的干擾，從而影響檢測的靈敏度及準確性。因此，選擇合適的樣品前處理凈化方式極其重要。多功能針式過濾器主要是基于QuEChERS原理，將凈化材料（PSA、C18、GCB等）填充于帶有有機濾膜的一次性注射針管筒中，以簡化樣品前處理過程，具有QuEChERS的簡單、快速、可靠、有效等特點，有效提高樣品前處理的效率，適合大批量樣品的分析檢測。本研究采用酸化乙腈渦旋提取2 min后，加入適量氯化鈉和無水硫酸鎂，再繼續(xù)渦旋提取 1 min，離心后，上清液直接經(jīng)多功能針式過濾器凈化以吸附蛋白質、色素等干擾物質，和傳統(tǒng)的固相萃取凈化方式相比，本方法將凈化方式縮減到一步完成，明顯提高了檢測效率。

2.4 實際樣品基質效應的考察

在實際樣品的分析檢測過程中，采用同一種前處理方法處理不同的樣品，樣品基質仍然會對同一目標物產(chǎn)生不同的干擾。本實驗采用了基質標準曲線的斜率與純溶劑標準曲線的斜率比值（ME），來評價豆芽基質對吲哚乙酸色譜分析的基質效應，當ME越接近于1時，表明基質效應就越小。方法如下：取不含待測物的豆芽空白樣品，經(jīng)“1.3”方法進行前處理，得到樣品提取凈化液，接著用此凈化液稀釋100 mg/L的吲哚乙酸溶液，配成濃度為0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L的基質標準工作容液。在優(yōu)化的實驗條件下進樣分析，以吲哚乙酸標準物質濃度作為橫坐標，相對應的峰面積作為縱坐標進行制作基質標準曲線。實驗結果如表1所示，吲哚乙酸在豆芽提取凈化液中的基質效應較?。∕E=0.98），因此，本實驗選擇純溶劑配制標準溶液進行外標法定量。

表1 豆芽中吲哚乙酸的基質效應Table 1 Matrix effects of indoleacetic acid in matrix of bean sprout

表2 實際樣品中吲哚乙酸殘留量回收率和精密度實驗結果(n=6)Table 2 Spike recovery rates for indoleacetic acid (n=6)

2.5 方法的線性范圍、檢出限及定量下限

本研究在優(yōu)化的實驗條件下測定“1.2”節(jié)配制的系列吲哚乙酸標準工作溶液，用峰面積（Y）對質量濃度（X）繪制標準曲線，線性方程見表1，實驗結果表明，吲哚乙酸在0.05～10.0 mg/L范圍內具有良好的線性關系，相關系數(shù)為0.9999。以3倍信噪比所對應的吲哚乙酸濃度來確定檢出限（LOD），以10倍信噪比所對應的吲哚乙酸濃度來確定定量限（LOQ），計算得吲哚乙酸在豆芽基質中的檢出限（LOD）為0.03 μg/kg，定量下限（LOQ）為 0.1 μg/kg。

2.6 回收率及精密度

取市售未檢出吲哚乙酸的豆芽為空白樣品，按“1.2”節(jié)進行前處理。按低、中、高3個濃度水平進行加標回收實驗，對比多功能針式過濾器凈化方法（F-QuEChERS）和固相萃取凈化方法（SPE）兩種前處理方式。在10 g勻漿樣品中吲哚乙酸添加0.1、0.5、5.0 mg/kg 3個濃度水平的標準溶液，進行含量測定，結果如表2所示，吲哚乙酸在豆芽中2種凈化方式的平均添加回收率范圍分別為80.6%～105.3%和78.5%～98.6%，相對標準偏差（RSD）分別為 1.8%～4.6%和2.9%～5.2%。實驗結果表明，F(xiàn)-QuEChERS和SPE的方法回收率和精密度都能滿足農(nóng)藥殘留檢測的要求，但F-QuEChERS方法操作簡便、耗時短，適合大批樣品的快速檢測。

2.7 實際樣品的檢測

從農(nóng)貿(mào)市場隨機購買10份豆芽樣品，按照本研究新建立的方法對豆芽中的吲哚乙酸進行測定，10份樣品均未檢出吲哚乙酸殘留。

3 結論

本研究基于QuEChERS前處理技術，將多功能針式過濾器用于樣品前處理，將凈化和過濾集于一體，報道了HPLC方法檢測豆芽中吲哚乙酸殘留量，以乙腈和0.1%甲酸為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長267 nm，該方法操作簡潔、快速、準確、可靠。將多功能針式過濾器用于農(nóng)藥殘留檢測樣品前處理，不僅能有效除去蛋白質、色素等樣品基質的干擾物質，而且對實驗研究中吲哚乙酸能保持較高的回收率，有效提高了檢測效率，適用于批量豆芽樣品中吲哚乙酸殘留的快速檢測。