張金磊，陳興煌

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350000）

草莓（Fragaria ananassaDuch.）果實柔軟多汁，芳香馥郁，含有多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)，素有“水果皇后”之稱[1,2]。隨著人們健康意識、經(jīng)濟水平的提高，對于草莓的需求逐年增加。而草莓果皮薄嫩，含水量高，極易受到病原菌侵染，引起腐爛。采后主要病害包括灰霉病、青霉病、軟腐病和炭疽病，其中尤以灰霉病造成的損失最為嚴(yán)重[3]。

灰霉病是由病原真菌灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染所致，屬于低溫高濕型病害，4 ℃以上灰葡萄孢即可萌發(fā)，7～20 ℃可產(chǎn)生大量孢子[4]。目前，對于果蔬灰霉病防治主要通過品種選育，田間管理，合理密植，適時采收，噴施化學(xué)藥劑等措施降低果實帶菌率和發(fā)病率，其中噴施農(nóng)藥是主要手段[5]。

但是，近年來由于對化學(xué)殺菌劑的使用不夠科學(xué)合理，灰葡萄孢對嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺、腐霉利、異菌脲等多種殺菌劑普遍產(chǎn)生抗性，世界范圍內(nèi)多有報道，新形態(tài)的灰葡萄孢菌不斷被發(fā)現(xiàn)[6-8]。由于新產(chǎn)品迭代較慢，農(nóng)產(chǎn)品殘留劑量問題，以及人們食品安全意識的提高，環(huán)境保護的需要，化學(xué)殺菌劑的使用受到了嚴(yán)格限制。因此，全球趨勢正在轉(zhuǎn)向?qū)ふ腋踩?、更環(huán)保的替代方法來控制采后病害和腐爛[9]。

精油作為一類天然食品添加劑，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、香精香料、調(diào)味品等諸多方面[10]；對真菌、細菌、病蟲害等均具有抑殺作用，鑒于植物精油優(yōu)良的抑菌抗氧化特性，有望取代或替代傳統(tǒng)抑菌劑及殺菌劑[11]。柑橘精油被美國食品和藥品管理局（FDA）認定為“一般認為安全（GRAS）的食品添加劑”[12]。關(guān)于其抑菌研究多有見報道[13,14]，如Tao等[15]的結(jié)果顯示椪柑精油處理能夠通過導(dǎo)致細胞質(zhì)丟失和菌絲體變形來改變意大利青霉（Penicillium italicum）和指狀青霉（Penicillium digitatum）菌絲結(jié)構(gòu)；通過改變胞外電導(dǎo)率、細胞成分的釋放以及總脂質(zhì)含量對細胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致菌體凋亡。Chutia等[16]研究了柑橘精油對5種植物病原真菌的影響，發(fā)現(xiàn)在2 mL/100 mL的精油中，尖芽孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和稻長蠕孢（Helminthosporium oryzae）孢子形成率僅為0.5%和0.25%，鏈格孢菌（Alternaria alternata）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）的孢子的形成完全被抑制。

本研究以從福州地區(qū)分離的草莓灰霉病菌為研究對象，選用特早熟溫州蜜橘橘皮精油對灰葡萄孢的抑制作用及抑菌機理進行探討，以期為草莓灰霉病害的綠色防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑

材料：柑橘（特早熟溫州蜜桔），9成熟，采自福建永安，當(dāng)日（12 h內(nèi)）運回，取皮，50 ℃干燥，粉碎，過40目篩，裝袋于-20 ℃冰箱備用；草莓采自福州荊溪芳香草莓園，8～9成熟；本實驗室分離、鑒定所得灰葡萄孢菌種。

試劑：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），生化試劑，上海博微生物；活性白土，食品級，鞏義龍騰水處理；其它常用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱，太倉市科教器材廠；6890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices。

1.3 試驗方法

1.3.1 精油提取

1.3.1.1 水蒸氣蒸餾

參照王會全等[17]的方法略有改動。取柑橘粉50 g于圓底燒瓶，加0.3% NaCl溶液，至料液比1:8，采用精油提取器加熱蒸餾2 h，收集冷凝管油水混合物，加入經(jīng)干燥的無水硫酸鈉攪拌，靜置，抽濾，將濾液存儲于棕色瓶保存至-20 ℃冰箱待用。

1.3.1.2 有機試劑萃取

參照張鐘等[18]的方法略有改動。稱取柑橘粉50 g于三角燒瓶，加入正己烷，料液比1:6，超聲波處理30 min，避光靜置2 h，真空抽濾，將抽濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于38 ℃旋蒸，回收有機試劑，待抽提液轉(zhuǎn)變?yōu)橛蜖钗?，體積不再減少，即為混有微量正己烷的精油混合物，經(jīng)脫蠟，脫色[19]即得柑橘精油。

1.3.2 精油成分分析

色譜條件：色譜柱為Rtx-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（99.9%），流速為1 mL/min，分流比為40:1，進樣口溫度為220 ℃，柱溫從50 ℃以3 ℃/min升溫至220 ℃，然后保持2 min，進樣量0.2 μL。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度220 ℃，EI電子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，m/z掃描范圍29～400。

1.3.3 精油對菌絲生長的抑制

參照馬江鋒等[20]方法略有改動。將10 mL不同濃度精油儲備液分別加入到90 mL PDA培養(yǎng)基混勻，使終體積濃度分別為0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，以添加10 mL無菌水組為對照，傾注平板，冷卻，接種9 mm菌柱于培養(yǎng)皿中央，置與25 ℃恒溫培養(yǎng)，每日測量菌落直徑，每個濃度平行處理3次。

1.3.4 精油對菌體生物量的影響

參照馬江鋒等[20]方法略有改動。90 mL PDB培養(yǎng)基中加入10 mL不同體積分數(shù)精油儲備液，混勻，使精油終體積分數(shù)分別為 0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，以添加10 mL無菌水組為對照。每個處理接種1 mL孢子懸浮液（108cfu/mL）25 ℃震蕩培養(yǎng)5 d，過濾收集菌絲，蒸餾水洗滌3次，于65 ℃烘干至恒重，每處理平行處理3次。

1.3.5 精油對菌體孢子萌發(fā)率的影響

參照馬江鋒等[20]方法略有改動。PDB培養(yǎng)基中加入不同濃度精油儲備液，接種200 μL孢子懸浮液（107cfu/mL）混勻，使精油終體積分數(shù)分別為 0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，25 ℃震蕩培養(yǎng)12 h，血球計數(shù)板鏡檢計數(shù)，以孢子出芽為依據(jù)。重復(fù)3次，取均值。

1.3.6 精油抑菌活性測定

采用 96孔版微量稀釋法[21]測定柑橘精油對灰葡萄孢的最低抑菌體積濃度（MIVF）。具體方法：向第1孔加入100 μL 20%精油儲備液，100 μL PDB培養(yǎng)基，進行二倍稀釋使得第1～7孔精油濃度為10%～0.156%，第8孔加100 μL PDB作為生長對照，1～8孔接種100 μL濃度為106cfu/mL孢子懸浮液，終體積200 μL，混勻。第9孔加入200 μL PDB作為空白。25 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h進行觀察菌落生長狀態(tài)，72 h肉眼觀察無菌絲生長即為MIVF。

1.3.7 精油對細胞膜透性影響

參照馬江鋒等[20]方法略有改動。7 mL離心管加入3.6 mL無菌PBS，200 μL孢子懸浮液（107cfu/mL），200 μL精油儲備液，使精油終體積分數(shù)分別為0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%，對照添加200 μL 無菌水，25 ℃恒溫震蕩培養(yǎng) 24 h，10000 ×g，4 ℃離心30 min，酶標(biāo)儀測定上清液260 nm波長處的吸光度值。

1.3.8 精油對草莓灰霉病發(fā)生的影響

參照Bi[22]選擇紅顏草莓為研究對象，75%乙醇浸泡1 min，撈出瀝除多于液體于超凈工作臺自然晾干。將所有果實分為6組，每組20個果實，在超凈工作臺，每個草莓用打孔器打成直徑3 mm、深5 mm的孔，接種15 μL菌液（孢子含量為6×105cfu/mL），室溫定植12 h，5組分別添加15 μL體積分數(shù)分別為0.156%、0.312%、0.625%、1.25%、2.5%含有蒸餾油的精油儲備液，以接種15 μL無菌水作為對照，置于無菌聚乙烯盒（5.6 L）。25 ℃培養(yǎng)10 d，以損傷接種處長出菌絲為標(biāo)準(zhǔn)，觀察創(chuàng)口真菌生長狀況。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行分析，應(yīng)用一般線性模型單變量最小顯著性差異法進行處理間差異分析，單因素方差分析進行個體差異分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘精油化學(xué)組分

由表1可知蒸餾油共鑒定出39種成分，醛類6種，烯萜類20種，醇類9種，酯類2種，酮類1種，有機酸1種，烯萜類占總量的98.15%。浸提油共鑒定出25種成分，烯萜類20種，醇類3種，烷烴類2種，未檢測出醛類物質(zhì)，其中烯萜類占總量的97.38%。兩種精油主要成分均為檸檬烯、γ-松油烯，其中蒸餾油檸檬烯含量為82.37%，浸提油為85.25%，γ-松油烯在兩者中的含量占比分別為7.78%和6.08%。這與陳潘等人[23]的研究結(jié)果檸檬烯（91.52%）、γ-松油烯（3.85%）等萜類化合物為柑橘皮精油的主要成分大體上相吻合，其次為β-月桂烯、α-蒎烯。其中檸檬烯含量最高，這與王會全等[17]的結(jié)果檸檬烯（84.22%）、萜品烯（6.55%)、β-月桂烯（1.67%）、α-蒎烯（1.13%）相吻合。兩種方法所得精油成分組成存在的差異，可能是由于提取方法及純化過程中的處理方式不同而造成。

表1 柑橘精油化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of citrus essential oils

續(xù)表1

2.2 精油對菌絲生長的抑制

由圖2可知精油對菌絲生長有較好的抑制效果，蒸餾油與浸提油兩種處理之間存在顯著差異（p＜0.05），蒸餾油抑菌效果顯著優(yōu)于浸提油。濃度0.156%～0.625%不同處理相同濃度組間差異未達到顯著水平（p＞0.05），即濃度低于 0.625%時兩種精油對于菌絲的影響無差異。具體原因可能是固體培養(yǎng)環(huán)境下，精油與菌絲不能完全接觸，灰葡萄孢菌絲為多核有隔菌絲，精油中對菌絲細胞壁起主要作用的是檸檬烯，細胞壁是檸檬烯的首要靶點，檸檬烯濃度未達一定限度，對細胞壁、細胞膜造成的破壞有限[24]，精油其它成分對于內(nèi)容物不能達到相應(yīng)效果所致。

2.3 精油對菌體生物量的影響

由圖3可知精油對菌體生長量的抑制效果，隨精油含量增加，抑制效果增強。濃度0.156%～0.625%時，兩種處理同一濃度組間及同一處理不同濃度組間均存在顯著差異（p＜0.05），濃度1.25%和2.5%時兩種精油處理間及處理內(nèi)不存在差異（p＞0.05），但經(jīng)蒸餾油處理實驗組的菌絲生長量低于浸提油處理實驗組菌絲量。濃度 0.312%時蒸餾油對灰葡萄孢生長量的抑菌率已經(jīng)達到了 90.71%，浸提油的抑制率僅為25.19%，濃度0.625%時，蒸餾油已經(jīng)完全抑制，浸提油的抑制率為 80.74%。相較于固體環(huán)境對菌絲的影響，液體環(huán)境下精油對于菌絲生長的影響更為顯著，可能是液體環(huán)境供氧量降低、精油能夠與菌絲充分接觸，檸檬烯迅速破壞細胞壁、細胞膜，其它多種抑菌成分進入胞內(nèi)對菌體產(chǎn)生影響，而蒸餾油獨有物質(zhì)能夠使細胞周期受阻、細胞核破碎，減緩灰葡萄孢的轉(zhuǎn)錄翻譯速率，進而影響生長繁殖[25,26]，致蒸餾油更早達到完全抑制。

2.4 精油對菌體孢子萌發(fā)率的影響

由圖4可知柑橘精油對灰葡萄孢孢子萌發(fā)率有一定的抑制作用，各處理組與對照的差異均達到顯著水平（p＜0.05）。蒸餾油與浸提油處理濃度為 0.156%～0.625%時，同一濃度不同處理組間存在顯著差異（p＜0.05），相較于對菌絲生長量的影響，相同濃度，對于孢子的抑制作用更弱，可能與孢子活性較低、抗逆境能力較強相關(guān)。蒸餾油的效果始終優(yōu)于浸提油，可能與其含有更高含量對孢子產(chǎn)生影響的物質(zhì)（如2-己烯醛、羅勒烯等）有關(guān)[27]。濃度為1.25%時，蒸餾油和浸提油萌發(fā)率分別為3.43%和4.04%，抑制率均達到了95%以上。由此說明，柑橘精油對灰葡萄孢菌的重要繁殖體有影響。

2.5 最小抑菌濃度測定

由表2可知72 h后蒸餾油濃度1.25%處理組有微量菌絲生長，濃度2.5%組未生長，MIVF為2.5%；浸提油濃度2.5%處理組有微量菌絲，5%處理組未生長，MIVF為5%。檸檬烯為柑橘精油主體物質(zhì)，有研究表明 2 mg/mL檸檬烯處理灰葡萄孢即可達到完全抑制[28]，認為檸檬烯為精油主要抑菌物質(zhì)，浸提油具有更高的檸檬烯含量，但其抑菌活性弱于蒸餾油，具體原因可能是蒸餾油成分的豐富性及其中含有多種與檸檬烯相當(dāng)?shù)囊志镔|(zhì)及較高含量具有強效抑菌性能的含氧化合物（醇、醛）及各物質(zhì)的協(xié)同增效作用相關(guān)[25,29]，如有研究表明芳樟醇、己烯醛等物質(zhì)，其抑菌活性是檸檬烯的10～1000倍左右[30]。

表2 柑橘精油對灰葡萄孢的MIVFTable 2 MIVF of citrus essential oil against Botrytis cinerea

2.6 精油對細胞膜透性影響

濃度升高含量升高。蒸餾油濃度為1.25%、2.5%時260 nm波長處吸光值顯著高于對照（p＜0.05），而0.156%、0.312%、0.625%實驗組與對照的差異未達到顯著水平（p＞0.05），表明濃度 0.625%以上會導(dǎo)致細胞透性明顯增強，進而引起核酸外泄。浸提油各濃度處理實驗組之間不存在顯著差異（p＞0.05），但隨精油處理濃度升高，核酸泄漏量整體呈上升趨勢。對于細胞膜透性的影響，蒸餾油的效果整體優(yōu)于浸提油，可能與蒸餾油含有較高含量的β-欖香烯及多種含氧化合物有關(guān)，如有研究表明β-欖香烯能促進細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、細胞核破碎[25,31]。

2.7 精油對草莓灰霉病發(fā)生的影響

圖6和圖7反映了損傷接種實驗各濃度處理組發(fā)病率和果實創(chuàng)口真菌生長情況。由圖6可知精油處理組與對照的發(fā)病率均存在顯著差異（p＜0.05），發(fā)病率介于80%～95%，濃度0.625%時發(fā)病率為僅為21.1%。由圖7可觀察到隨蒸餾油濃度升高，創(chuàng)口處真菌菌絲生長受到的抑制作用增強，萼片處均有菌絲生長，且隨處理濃度增高花萼處菌絲生長有減少趨勢。濃度1.25%處理組幾乎未發(fā)生真菌長出菌絲現(xiàn)象，濃度2.5%處理組損傷處菌絲完全未生長，達到完全抑制。具體原因可能與柑橘精油抑制菌體生長、某些物質(zhì)能夠促進草莓果實相關(guān)抗病基因的表達有關(guān)[32]。

由圖7可以觀察到濃度2.5%精油處理組草莓顏色較其余組明顯偏淡，這種高濃度精油處理達到較好的抑菌效果，影響果實色度的現(xiàn)象與薩仁高娃[33]的結(jié)果相類似，究其原因可能是高濃度精油對細胞造成毒性，加劇了果實無氧呼吸，促進了果實軟化腐爛所致。

3 結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法所得精油共鑒定出39種成分，除烯萜類化合物外，含有醇、醛、酮、酸、酯在內(nèi)的多種含氧化合物；有機試劑浸提法所得精油共鑒定出25種成分，主要為烯萜類、烴類、醇類化合物。共有主要成分為檸檬烯（limonene）、γ-松油烯（γ-Terpinene）、β-月桂烯（β-myrcene）、α-蒎烯（α-Pinene），總含量均達到精油組分的97%以上。其中，檸檬烯為最主要成分，蒸餾油檸檬烯含量為82.37%，浸提油為85.25%。抑菌實驗結(jié)果表明兩種精油對灰葡萄孢均具有較好的抑制效果，其中蒸餾油MIVF為2.5%，浸提法精油MIVF為5%。體外抑菌實驗表明，精油能夠通過對灰葡萄孢的菌絲、生長量、孢子萌發(fā)率、細胞透過性產(chǎn)生影響，誘導(dǎo)細胞凋亡，且蒸餾油的效果優(yōu)于浸提法精油。草莓抑菌實驗表明柑橘精油能夠有效抑制灰葡萄孢在草莓果實上的生長，但過高濃度精油處理會對草莓品質(zhì)產(chǎn)生負面影響。