張淑瑜，陳春秀，李國英

（四川大學(xué)皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，制革清潔技術(shù)國家工程研究中心，四川成都 610065）

膠原具有良好的生物相容性、可生物降解性、良好的加工成型性和成膜性，膠原膜可廣泛應(yīng)用于可食性腸衣[1]、豬肉保鮮[2]、油炸食品包裝[3]等領(lǐng)域。然而，作為食品包裝材料，純膠原膜的機(jī)械強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性較差，限制了其應(yīng)用范圍[4]。目前，膠原膜理化性能的提高主要通過物理改性、化學(xué)改性和共混改性來實(shí)現(xiàn)。物理改性通過在基體中加入填料或助劑來改善制品性能，效果不明顯；化學(xué)改性通過接枝、嵌段等方法改變聚合物大分子的主鏈、支鏈或側(cè)基，作用明顯但可能會(huì)破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)；共混改性是將兩種或兩種以上聚合物經(jīng)混合制備宏觀均勻材料的方法，因其操作簡單，效果明顯且不影響膠原本身生物學(xué)性質(zhì)而備受研究者關(guān)注[5,6]。

天然高分子因具有良好的生物相容性及可降解性，研究者們常常將其與膠原共混以獲得性能更優(yōu)的膠原基材料。目前，與膠原共混的天然高分子主要有天然蛋白質(zhì)和纖維素及其衍生物，包括海藻酸鈉[7]、羧甲基纖維素（CMC）[8]、羥丙基甲基纖維素（HPMC）[9]等。HPMC是一種非離子型纖維素衍生物，具有較好的成膜性、耐酶解性以及親水性，被應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域[10]。Ding等人[11]采用質(zhì)量比1:1制備膠原/HPMC共混膜，結(jié)果表明共混膜的熱穩(wěn)定性相對于純膠原膜有所提高，且膜表面更加均勻致密。然而，由于膠原與 HPMC之間僅存在氫鍵和纏結(jié)作用，相互作用較弱，所得復(fù)合材料部分性能仍有不足。相關(guān)研究表明，醛基能夠與膠原的氨基形成席夫堿共價(jià)交聯(lián)鍵，從而進(jìn)一步提高膠原的穩(wěn)定性[12,13]。

纖維素能被高碘酸鈉氧化將C2-C3上的羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槿┗瑫r(shí)氧化過程導(dǎo)致纖維素的降解，醛基含量和降解程度都與氧化程度成正比[14]。醛基含量的增多有助于纖維素與膠原之間交聯(lián)鍵的形成，增強(qiáng)體系之間的相互作用，提高膠原的穩(wěn)定性；同時(shí)醛基含量的增多勢必導(dǎo)致纖維素的降解，影響纖維素的理化性能，例如成膜性能下降[15]，進(jìn)而影響其與膠原共混成膜性能。HPMC具有上述纖維素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其單體C2-C3上含有羥基，故可用高碘酸鈉氧化HPMC獲得醛基，與膠原的氨基形成席夫堿共價(jià)交聯(lián)，提高膠原的穩(wěn)定性。但是，HPMC氧化程度的不同會(huì)導(dǎo)致分子鏈不同程度的降解，從而影響氧化羥丙基甲基纖維素（DHPMC）與膠原共混成膜性能。因此，本文探究不同氧化度DHPMC對復(fù)合膜結(jié)構(gòu)和性能的影響。將HPMC進(jìn)行高碘酸鈉氧化，制備不同氧化度的DHPMC，分別將其與膠原以質(zhì)量比1:1.25共混制膜，測定成膜的機(jī)械性能、熱穩(wěn)定性、耐酶降解及親水性等性能，并表征不同氧化度DHPMC與膠原成膜的前后性能變化，以期得到性能更優(yōu)良的膠原基復(fù)合膜材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

牛皮膠原，實(shí)驗(yàn)室自提；HPMC（甲氧基含量27.0%～30.0%，羥丙基含量為4.0%～7.5%），赫克力士有限公司；I型膠原酶（分析純），美國Sigma-Aldrich公司；冰醋酸、醋酸鈉、高碘酸鈉，成都科隆化學(xué)品有限公司；羥脯氨酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

透度/霧度儀，WGT-S；傅里葉變換紅外光譜儀，Nicolet iS10；差示掃描量熱儀，DSC 200PC；熱重分析儀，TG 209-F1；電子萬能試驗(yàn)機(jī)，UTM2102；掃描電鏡，JSM-7500F；接觸角測量儀，DSA25。

1.2 測定方法

1.2.1 不同氧化度DHPMC的制備

通過控制 NaIO4用量，分別為 n（NaIO4）:n（HPMC）=0.08:1和 0.9:1，制備不同氧化度的DHPMC，根據(jù)氧化程度的高低，記為DHPMC（高），DHPMC（低）。制備過程如下：將HPMC溶于去離子水，室溫?cái)嚢枞芙狻Ｈ缓髮⑵渑cNaIO4溶液混合攪拌，用1.0 mol/L的H2SO4溶液調(diào)節(jié)pH值至2.0，于25 ℃下避光反應(yīng)6 h。待反應(yīng)完成后，進(jìn)行遮光透析，除盡未反應(yīng)的 NaIO4。最后將產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥，于干燥器中保存。

1.2.2 DHPMC氧化度的測定

采用鹽酸羥胺法[16]測定 DHPMC的氧化度。將DHPMC和鹽酸羥胺分別溶于去離子水中，調(diào)節(jié) pH至4.5。將兩者混合在40 ℃下反應(yīng)4 h。將反應(yīng)完成的溶液用0.1 mol/L的NaOH進(jìn)行滴定直到pH為4.5，將消耗的NaOH的體積記為V1。同時(shí)，用同樣的方法測得HPMC的醛基含量，將消耗的NaOH的體積記為V0。氧化度的計(jì)算公式如下：

式中:

CNaOH——滴定用NaOH濃度，為0.1 mol/L；

m——用于反應(yīng)的DHPMC干重，g；

162——DHPMC每個(gè)重復(fù)單元的相對分子質(zhì)量，g/mol。

1.2.3 復(fù)合膜的制備

將膠原海綿溶于 0.5 mol/L醋酸/醋酸鈉緩沖液（pH=4.00）中，制備6.25 mg/mL的膠原溶液。同時(shí)，用相同方法配置20 mg/mL HPMC、DHPMC（低）和DHPMC（高）。然后將5 mL HPMC、DHPMC（低）和DHPMC（高）分別與20 mL膠原溶液進(jìn)行共混，m（膠原）:m（纖維素）為1.25:1。反應(yīng)12 h后，透析，離心脫泡，倒入硅膠模具，于室溫下干燥成膜，將膜揭下后置于飽和溴化鈉溶液的干燥器（RH 59.14%±0.44%，溫度20 ℃）中待用。此外，制備等固體質(zhì)量（225 mg）的純膠原膜作為對照。為簡便起見，將純膠原膜和復(fù)合膜分別命名為 COL、COL/HPMC、COL/DHPMC（低）、COL/DHPMC（高）。

1.2.4 透光率測定

采用透度/霧度測試儀測定薄膜樣品的透光率。測量前先將儀器開機(jī)預(yù)熱30 min，然后選取表面潔凈、無折痕的膜樣品，將其放置于夾具中，置于通光孔處并按下測試按鈕。測試3次，取其平均值作為膜樣品的透光率。

1.2.5 含水量測試

將稱量瓶進(jìn)行恒重，直至干燥前后質(zhì)量差不超過2 mg，質(zhì)量記為M0。然后放入剪碎后的膠原膜，質(zhì)量記為M1。于105 ℃加熱干燥4 h后取出，蓋好蓋子，于干燥器中冷卻至室溫后稱重，反復(fù)操作直至干燥前后的質(zhì)量差小于2 mg，記錄質(zhì)量為M2。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行組，取平均值記作膠原膜的最終含水量。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測試

將改性處理的膠原膜置于樣品架上進(jìn)行紅外掃描，光譜測試范圍為650～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品重復(fù)掃描32次。

1.2.7 機(jī)械性能測試

將膜剪成分析區(qū)域?yàn)?5 mm×5 mm矩形，用厚度儀測定膜厚度，取測試膜的上、中、下三個(gè)位置的厚度，取其平均值。將試樣固定于拉力機(jī)的夾具中，設(shè)置夾具間的間距為25 mm，拉伸速率為5 mm/min，記錄其抗張強(qiáng)度和斷裂伸長率值，每個(gè)樣品設(shè)置5組平行，取其平均值。

1.2.8 熱重（TG）分析測試

稱取樣品約8.0 mg，置于Al2O3坩堝中。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，從40 ℃加熱到800 ℃，升溫速率為20 ℃/min。

1.2.9 差示掃描量熱儀（DSC）測試

稱取約4.0 mg的膜樣品，剪碎后密封于鋁制坩堝中，以同樣密封的空坩堝作為對照。根據(jù)牛皮膠原熱變性溫度的相關(guān)研究[17,18]，選取40～100 ℃溫度范圍，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以5 ℃/min的升溫速率進(jìn)行測試。每個(gè)樣品至少設(shè)置三個(gè)平行組。

1.2.10 酶解率測試

取適量的 I型膠原酶溶解于 pH值為 7.4的 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，該緩沖液中含有 0.36 mmol/L氯化鈣，最終得到酶活力為5 U/mL的I型膠原酶酶解液。將其置于37 ℃水浴鍋中預(yù)先進(jìn)行活化。將膜樣品浸于酶解液中，在37 ℃下酶解4 h，按照羥脯氨酸試劑盒說明書檢測酶解液中羥脯氨酸含量ρ（mg/mL）。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征成分，其在皮膠原中含量約為14%[19]。因此可根據(jù)酶解液中羥脯氨酸的含量計(jì)算被酶解的膠原蛋白質(zhì)量。每個(gè)樣品測試三次，取其平均值。

式中：

V——酶解液總體積，mL；

M——膜樣品中膠原蛋白的總質(zhì)量，mg。

1.2.11 接觸角測試

通過計(jì)算去離子水滴在膜表面的接觸角來判斷膜樣品的親水性。接觸角測試如下：將4 μL的水滴滴于樣品表面，根據(jù)切向法計(jì)算膜樣品與液滴之間的夾角大小，選取膜上6個(gè)不同位置重復(fù)上述操作，取其平均值。

1.2.12 掃描電鏡（SEM）斷面結(jié)構(gòu)測試

采用 SEM 觀察膜的橫截面。將斷裂面的樣品固定在導(dǎo)電膠上后進(jìn)行噴金觀察，測試時(shí)的加速電壓為10 kV。

1.2.13 試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

文中數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05代表有顯著性差異。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，使用Microsoft Excel 2013進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 膜的外觀

圖1為純膠原膜及改性膠原膜的光學(xué)照片。樣品膜的透光率值列于表1。經(jīng)過氧化所得的DHPMC（低）和DHPMC（高）的氧化度分別為17.78%和45.12%?？梢园l(fā)現(xiàn)，COL、COL/HPMC、COL/DHPMC（低）和COL/DHPMC（高）的透光率均在90%左右，相差不大，均具有較好的透明度。此外，相對于 COL，COL/HPMC、COL/DHPMC（低）和 COL/DHPMC（高）的膜表面更加平整。該結(jié)果表明，經(jīng)過DHPMC改性后的膠原溶液的粘稠度能滿足制膜過程中對溶液流平性的要求。

2.2 含水量分析

膠原膜的含水量會(huì)直接影響其機(jī)械性能及熱穩(wěn)定性。圖2為純膠原膜及各復(fù)合膜的含水量。由圖可知，膜樣品的含水量均在18%左右，由此推測，不同氧化度的DHPMC對膠原膜的含水量沒有明顯的影響，可判斷其含水量與空氣濕度相關(guān)。因此可以得出，在此條件下測定純膠原膜與改性膠原膜的機(jī)械性能與熱穩(wěn)定性能時(shí)，可以對含水量的影響忽略不計(jì)。

表1 膜樣品的透光率Table 1 The film transmittance of COL, COL/HPMC, COL/DHPMC (low) and COL/DHPMC (high)

表2 膜樣品的厚度以及抗張強(qiáng)度和斷裂伸長率Table 2 Parameters of mechanical property of films

2.3 紅外吸收光譜分析

圖3為COL、COL/HPMC、COL/DHPMC（低）和COL/DHPMC（高）的紅外吸收光譜圖。由圖可知，經(jīng)過不同氧化度DHPMC共混的膠原復(fù)合膜均具有純膠原膜的特征吸收峰[20]，但是發(fā)生了不同程度的偏移。其中，酰胺 A帶從 COL的 3292 cm-1向COL/DHPMC（高）的3318 cm-1高波數(shù)偏移，發(fā)生了藍(lán)移，這主要是由于引入的 HPMC中含有羥基，DHPMC中含有羥基和醛基，可以與膠原的氨基之間形成氫鍵和共價(jià)交聯(lián)，這與程慶甦等[12]的研究結(jié)果一致。此外，還可以通過計(jì)算酰胺Ⅲ帶和1450 cm-1處的吸光度的比值來判斷膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)是否完整[21]，即AⅢ/A1450。純膠原的AⅢ/A1450的比值接近與1，而三股螺旋不完整的明膠的 AⅢ/A1450的比值為 0.5。經(jīng)過計(jì)算獲得，改性膠原膜樣品 COL/HPMC，COL/DHPMC（低）和COL/DHPMC（高）的AⅢ/A1450比值分別為0.96，0.92和0.87，與純膠原膜的吸光度比值 0.95接近，均接近于 1，表明不同氧化程度的DHPMC的加入沒有破壞膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4 膜的機(jī)械性能分析

將純膠原膜和復(fù)合膜測試的相關(guān)參數(shù)列于表 2。改性膠原膜的抗張強(qiáng)度和斷裂伸長率均高于純膠原膜，表明共價(jià)鍵的引入有利于增強(qiáng)膠原膜的機(jī)械強(qiáng)度[22,23]。同時(shí)，應(yīng)用 DHPMC（低）改性獲得的膠原膜的機(jī)械性能最好，抗張強(qiáng)度和斷裂伸長率分別為115.74 MPa和22.26%，明顯優(yōu)于DHPMC（高）改性的膠原膜（p＜0.05），可能是當(dāng)DHPMC（低）與膠原共混時(shí)，由于DHPMC（低）氧化程度低，將部分羥基轉(zhuǎn)變?yōu)槿┗耐瑫r(shí)又使得纖維素具備較好的成膜性和機(jī)械強(qiáng)度，延伸性強(qiáng)[24]。因此，DHPMC（低）與膠原具有良好的相容性的同時(shí)又形成了分子間交聯(lián)鍵和氫鍵，所以COL/DHPMC（低）機(jī)械性能顯著提升。而DHPMC（高）與膠原共混時(shí)，氧化纖維素自身的成膜性能下降，成膜機(jī)械強(qiáng)度較弱，雖然含有較多的醛基能與膠原分子之間形成交聯(lián)，共混形成的COL/DHPMC（高）機(jī)械性能優(yōu)于 COL，但不如COL/DHPMC（低）和COL/HPMC。

2.5 熱穩(wěn)定性分析

圖4是熱穩(wěn)定性分析曲線。圖4a、b、c分別為純膠原膜和復(fù)合膜的TG、DTG曲線和DSC曲線。由圖4a、b可知，COL，COL/HPMC，COL/DHPMC（低）和 COL/DHPMC（高）的熱失重包括兩個(gè)階段，第一階段是樣品中膠原分子間和分子內(nèi)氫鍵的斷裂和自由水的蒸發(fā)過程，主要發(fā)生在40～150 ℃之間。第二階段是膠原肽鏈的熱分解過程，肽鏈發(fā)生斷裂并逐漸發(fā)生降解，同時(shí)伴隨著結(jié)合水還有一些小分子產(chǎn)物揮發(fā)，在此階段質(zhì)量損失最大且失重速率最快，主要發(fā)生在200～800 ℃之間。將COL、COL/HPMC、COL/DHPMC（低）和COL/DHPMC（高）的殘留質(zhì)量，第二階段的起始分解溫度（T0）和最大分解速率時(shí)溫度（Tm）列于表4。由表可知，經(jīng)過改性的膠原膜的殘留質(zhì)量均高于純膠原膜的殘留質(zhì)量，且COL/DHPMC（低）的殘留質(zhì)量最高，為 28.32%。同時(shí)，COL/DHPMC（低）的 T0和 Tm分別為 179.58 ℃和338.14 ℃，表明其熱穩(wěn)定性最好。相比于COL，COL/HPMC的熱穩(wěn)定性提高主要是由于HPMC與膠原分子間形成氫鍵；對于 COL/DHPMC（低）和COL/DHPMC（高），由于DHPMC與膠原之間形成了共價(jià)交聯(lián)，交聯(lián)鍵的引入阻礙了膠原肽鏈的分解和質(zhì)量損失，故熱穩(wěn)定性提高。此外，可能是由于DHPMC（高）的氧化程度遠(yuǎn)高于DHPMC（低），因此造成纖維素分子鏈斷裂，形成較小的分子，主要分散在膠原基體中起到一部分填充作用，其交聯(lián)鍵主要是在膠原分子內(nèi)形成；而DHPMC（低）具有較大的分子，能夠在膠原分子之間形成橋鍵作用，進(jìn)一步促進(jìn)了與膠原分子間氫鍵和交聯(lián)鍵的形成[25,26]。因此，經(jīng)過 DHPMC（低）改性的膠原膜的熱穩(wěn)定性優(yōu)于DHPMC（高）復(fù)合的膠原膜。

同時(shí)，利用 DSC來測定膠原膜的熱變性溫度（Td）。膠原的熱變性溫度是指膠原受熱導(dǎo)致三股螺旋結(jié)構(gòu)解旋時(shí)的溫度，常用于表征膠原材料的熱穩(wěn)定性[27]。膠原膜的DSC曲線如圖4c所示。在檢測溫度范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個(gè)吸熱峰，該峰的峰值所對應(yīng)的溫度即為膠原膜的熱變性溫度（Td）。COL/DHPMC（低）的Td為 76.24 ℃，高于COL（68.45 ℃），COL/HPMC（69.67 ℃）和COL/DHPMC（高）（71.13 ℃），再次驗(yàn)證了改性膠原膜的熱穩(wěn)定性能夠明顯提高，且DHPMC（低）與膠原形成的復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性優(yōu)于HPMC和DHPMC（高）與膠原形成的復(fù)合膜。這與前面TG和DTG分析結(jié)果一致。

表3 純膠原和改性膠原膜的殘留質(zhì)量、起始分解溫度（T0）和最大分解速率時(shí)溫度（Tm）Table 3 The residue weight, T0 and Tm for pure collagen and modified collagen films

2.6 酶解率分析

圖5為膜樣品的酶解率。未改性的膠原膜酶解率高達(dá) 90.41%，經(jīng)過改性之后酶解率均有降低，COL/HPMC、COL/DHPMC（低）、COL/DHPMC（高）的酶解率分別為 49.88%、62.40%、72.55%。說明共混改性后的膠原膜的耐酶降解能力有所提高，但仍可被酶解。由于DHPMC能夠與膠原分子之間形成共價(jià)交聯(lián)，使得復(fù)合體系的分子間纏繞更加緊密，阻礙了I型膠原酶與膠原上的位點(diǎn)相互作用[28]，故COL/DHPMC（低）和COL/DHPMC（高）的酶解率相比于COL降低。而COL/HPMC的酶解率最低，可能是由于HPMC成膜性好，分子鏈長，可以很好地包裹膠原分子，使酶難以進(jìn)攻膠原的作用位點(diǎn)。

2.7 膜的親水性

親水性也是評價(jià)膜材料性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。接觸角越小，膜材料的親水性越強(qiáng)；相反，接觸角越大，膜材料的疏水性越強(qiáng)[29]。圖6為純膠原膜和復(fù)合膜的親水狀態(tài)。COL、COL/HPMC、COL/DHPMC（低）、COL/DHPMC（高）的接觸角分別為 115.10 °、94.83 °、95.56 °、70.44 °。經(jīng)改性之后復(fù)合膜的接觸角均有減小，親水性明顯增強(qiáng)（p＜0.05）。Ding等[11]采用質(zhì)量比 1:1制備膠原/HPMC共混膜，由于HPMC含有大量羥基，故復(fù)合膜親水性相比純膠原膜增強(qiáng)，本文研究結(jié)果與其一致。另外，雖然膠原與DHPMC（低）之間形成交聯(lián)鍵，消耗膠原中親水基團(tuán)氨基，但是由于DHPMC（低）氧化程度低，本身具有親水基羥基，故最終表現(xiàn)為親水性增強(qiáng)。當(dāng)采用DHPMC（高）與膠原共混時(shí)，其氧化度較高，而氧化的同時(shí)伴隨分子鏈的斷裂，使得親水基團(tuán)更多地暴露，且因其能夠較好地分散于膠原基體中，故接觸角進(jìn)一步減小[30]。

2.8 膜的截面觀察（SEM）

圖7為膜樣品橫截面的SEM圖。由圖7a可以看出純膠原膜樣品的斷面結(jié)構(gòu)為層狀結(jié)構(gòu)，而復(fù)合膜層狀結(jié)構(gòu)相對減弱，變得更加均勻致密，也進(jìn)一步說明了膠原與HPMC和不同氧化度的DHPMC均具有較好的相容性。DHPMC（低）與膠原之間形成了氫鍵和交聯(lián)鍵，加強(qiáng)了大分子間的連接，從而增強(qiáng)了膜樣品的相容性，進(jìn)而使膠原膜樣品變得更加致密；DHPMC（高）均勻地分散于膠原基體中，形成交聯(lián)鍵的同時(shí)還能起到一部分填充作用；HPMC具有較好的成膜性能，能夠與膠原之間形成氫鍵，具有較好的流平性，從而使膜變得更加均勻致密，這與 Ding等[11]研究結(jié)果一致。其團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，純HPMC膜的結(jié)構(gòu)均勻，斷面平滑，具有良好的成膜性能。將HPMC與膠原共混制膜，復(fù)合膜的表面粗糙度相比于純膠原膜明顯下降。本文進(jìn)一步說明氧化后的DHPMC與膠原同樣具有良好的相容性，與其共混可以使膠原膜的結(jié)構(gòu)更加均勻致密。

3 結(jié)論

本文通過測定HPMC和不同氧化度DHPMC共混膠原膜的各項(xiàng)性能指標(biāo)，得出DHPMC氧化度對復(fù)合膜理化性能的影響。結(jié)果表明，復(fù)合膜具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)，其機(jī)械性能、耐熱分解能力、耐酶降解能力以及親水性能均有所提升。氧化度低的DHPMC（低）能夠?qū)⒉糠至u基轉(zhuǎn)變?yōu)槿┗耐瑫r(shí)又具備較好的成膜性和機(jī)械強(qiáng)度，延伸性強(qiáng)，與膠原共混時(shí)具有良好的相容性，這為膠原基復(fù)合膜在食品包裝方面的廣泛應(yīng)用提供可能。