喻豆，潘力，王斌

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東省發(fā)酵與酶工程重點實驗室，廣東廣州 510006）

關鍵字：絲氨酸羧肽酶；黑曲霉；重組表達；蛋白脫苦

羧肽酶（Carboxypeptidases，E.C.3.4.16-E.C.3.4.18）是一種外肽酶，能夠依次水解釋放蛋白質和多肽C末端的氨基酸[1]。根據(jù)羧肽酶的活性中心可以分為絲氨酸羧肽酶（E.C.3.4.16）、金屬性羧肽酶（E.C.3.4.17）和半胱氨酸羧肽酶（E.C.3.4.18）[2]。絲氨酸羧肽酶是一種能夠在酸性條件下逐個水解肽鏈C末端氨基酸的外肽酶，屬于絲氨酸羧肽酶的S10家族，能夠參與蛋白質在生物體內的運輸、靶向和加工過程，在酸性條件下除了能夠水解肽鏈末端之外還具有酯酶和脫酰胺酶的活性[3]。除此之外絲氨酸羧肽酶具有許多共同的結構特征，有一個S-D-H（絲氨酸、天冬氨酸、和組氨酸）組成的三聯(lián)體結構，其中Ser是活性中心。目前已報道的絲氨酸羧肽酶來源很廣泛，存在于動植物組織和各種微生物中[4-6]。絲氨酸羧肽酶在曲霉中的研究較少，且產量較低[7-14]。已報道的文獻中表達量較高的是Morita[8]等將Aspergillus oryzae的絲氨酸羧肽酶基因cpI在Aspergillus nidulans中進行過量表達測得的85.31 U/mL。

大豆蛋白是食品加工行業(yè)中應用廣泛的原材料，其水解液中含有許多活性多肽，可作為功能性食品成分和營養(yǎng)添加劑等。但在大豆蛋白水解過程中會產生大量的苦味肽，嚴重限制其在食品加工行業(yè)的應用?？辔吨饕从诘鞍姿膺^程中生成的苦味肽，而苦味肽中的疏水性氨基酸是苦味產生的主要因素。在蛋白質中由于疏水性氨基酸被包埋在分子內部，故而不會被品嘗出苦味，這也是分子量大于6000 u的多肽不會呈現(xiàn)出苦味的原因。當疏水性氨基酸在分子表面的暴露程度越高，產生的苦味越重。但當疏水性氨基酸位于肽鏈內部和以游離形式存在時，其結構較少能與苦味受體結合，因此呈現(xiàn)的苦味較輕。與游離形式相比，當疏水性氨基酸位于肽鏈末端時的苦味較重。當疏水性氨基酸位于肽鏈的C末端時產生的苦味較位于N末端時更重，這表明氨基酸的順序與苦味值相關。此外肽鏈的長度、疏水值和氨基酸的組成也會對苦味產生較大的影響[15,16]。在大豆蛋白的水解液中含有Gly-Leu、Leu-Lys、Arg-Leu、Phe-Leu、Arg-Leu-Leu等多種苦味肽。降低苦味的方法主要有物理法和生物酶解法，其中生物酶解法具有反應條件溫和、產物安全可靠等優(yōu)點。生物酶解法中使用的蛋白酶主要分為內肽酶、外肽酶和 plastein蛋白酶[17-20]。內肽酶主要包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶等，氨肽酶是在脫苦研究中使用較多的一類外肽酶。單獨使用一種生物酶時水解液中仍會存在較多苦味肽，但將內肽酶與外肽酶協(xié)同酶解大豆蛋白時的苦味降低最明顯。

黑曲霉（Aspergillus niger）具有強大的蛋白分泌能力，使其能夠承擔蛋白高表達時的分泌壓力；具有完善的轉錄后和翻譯后修飾系統(tǒng)（在表達真核基因產物時具有明顯的優(yōu)勢）；被認為是 GRAS（Generally Regarded as Safe）安全菌株，具有生物安全性；基因編輯技術在黑曲霉中廣泛應用，使得基因操作更加簡單可靠；黑曲霉因環(huán)境適應能力較強，發(fā)酵時所用的培養(yǎng)基由價格相對廉價的基礎營養(yǎng)物質組成；最后黑曲霉可進行高密度發(fā)酵且發(fā)酵放大技術較成熟[21-25]。因此黑曲霉是優(yōu)秀的蛋白表達宿主。

本研究以低蛋白背景的無孢黑曲霉A.nigerHL-1為宿主，表達A.nigerCBS 513.88中3個絲氨酸羧肽酶基因（CPA、CPF、CPG），篩選得到高活力的絲氨酸羧肽酶基因CPG，并研究了重組酶CPG的酶學性質，最后將其應用于大豆蛋白脫苦，研究了胃蛋白酶與重組酶CPG復配所產生的脫苦效果，為解決大豆蛋白水解液脫苦處理工藝提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

黑曲霉宿主菌株A.nigerHL-1（ΔpyrG、ΔglaA）由本實驗室構建并保藏，通用表達載體 UEV由本實驗構建并保藏，大腸桿菌Escherichia coliMatch1 T1購自美國Invitrogen公司

1.1.2 試劑限制性內切酶ApaⅠ和XbaⅠ，美國 Thermo Fisher Scientific公司；Prime STAR HS DNA Polymerase （premix），日本TaKaRa公司；HiFi DNA Assembly Cloning Kit試劑盒，美國 NEB公司；DreamTaq Green PCR Master Mix，美國Thermo Fisher Scientific公司；胃蛋白酶、茚三酮和氯化鎘，上海麥克林生化科技有限公司；FA-Phe-Ala，成都云?；び邢薰竞铣?；大豆分離蛋白，廣州普博欣生物科技有限公司；DNA marker（250 bp Ladder、DL 5000TM）和26616 Protein Marker，日本TaKaRa公司。

表1 引物Table 1 Primer

表2 絲氨酸羧肽酶基因序列Table 2 The sequence of serine carboxypeptidase genes

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：1%蛋白胨、1%氯化鈉、0.5%酵母提取物。

DPY培養(yǎng)基：2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.1% KH2PO4、0.05% MgSO4·7H2O。

CD培養(yǎng)基：2%葡萄糖、0.3% NaNO3、0.2% KCl、0.1% KH2PO4、 0.05% MgSO4·7H2O 、 0.001%FeSO4·7H2O、2%瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：5%玉米淀粉、3%玉米漿、2%豆粕粉。

1.1.4 引物

實驗中所使用的引物如表1所示。

1.2 儀器

Veriti 96-Well Thermal Cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀，美國Applied Biosystems公司；AKATA層析儀，美國通用電氣公司；浸入式水平電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；M200多功能酶標儀，德國TECAN公司；移液槍和高速離心機，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 絲氨酸羧肽酶表達載體的構建

1.3.1.1 本章所選取的羧肽酶基因

從 Uniprot上篩得到的黑曲霉絲氨酸羧肽酶基因序列如表2所示。

1.3.1.2 表達載體構建

通過SignalP 4.0 server信號肽預測基因原有信號肽，分別構建信號肽為自身信號肽和糖化酶信號肽的絲氨酸羧肽酶表達載體。以黑曲霉A.nigerCBS 513.88的基因組為模板，以 CPG-F和 CPG-R，CPF-F和CPF-R，CPA-F和CPA-R為引物擴增信號肽為自身信號肽的CPG，CPF和CPA基因片段，以CPG-g-F和CPG-g-R，CPF-g-F和CPF-g-R，CPA-g-F和CPA-g-R為引物擴增信號肽為糖化酶信號肽的CPG-g、CPF-g和CPA-g基因片段（每個目的基因的C端均通過引物加入6ⅹHis標簽），用PnaⅡ-F和PnaⅡ-R為引物擴增雜合啟動子片段PnaⅡ。將目的基因（CPG，CPF、CPA、CPG-g、CPF-g或CPA-g）、雜合啟動子PnaⅡ和線性化的通用載體 UEV（含pyrG篩選標記、Ttef終止之和amyA同源臂）通過HiFi DNA連接酶的作用連接成環(huán)形質粒，轉化至大腸桿菌E.coliMatch1 T1感受態(tài)細胞，經過氨芐青霉素的抗性篩選、菌液電泳、酶切驗證和測序驗證后篩選出正確的表達載體。構建正確的表達載體命名為 UEV-CPG/CPF/CPA/CPG-g/CPF-g/CPA-g。

1.3.2 絲氨酸羧肽酶重組菌株的構建

將 6個絲氨酸羧肽酶表達載體（UEV-CPG、UEV-CPF、UEV-CPA、UEV-CPG-g、UEV-CPF-g和UEV-CPA-g）經過質粒大量提取、濃縮后，通過PEG介導轉化至無孢黑曲霉A.nigerHL-1原生質體中，30 ℃恒溫培養(yǎng)。將轉化子挑至CD板上繼續(xù)培養(yǎng)。待轉化子長大之后提取基因組。以轉化子基因組模板，利用驗證引物CP-F和CP-R驗證目的基因表達框是否完整整合至轉化子基因組上。篩選正確的絲氨酸羧肽酶重組菌株，并將正確的菌株命名為 HL-CPG/CPF/CPA/CPG-g/CPF-g/CPA-g。

1.3.3 絲氨酸羧肽酶酶活測定

將鑒定正確的絲氨酸羧肽酶菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵168 h（30 ℃，250 r/min），每24 h取樣一次。利用鎘-茚三酮法測定絲氨酸羧肽酶的酶活。以FA-Phe-Ala為底物，將其溶于pH 4.5，45 mmol的乙酸鈉緩沖液中配制成0.5 mmol的底物溶液。取已用乙酸鈉緩沖液稀釋的粗酶液 100 μL加入 900 μL FA-Phe-Ala溶液，混勻，30 ℃反應30 min。向450 μL無菌水中加入50 μL反應液，然后加入1 mL顯色液即鎘-茚三酮溶液，84 ℃水浴5 min，冰上冷卻至室溫，用酶標儀測量A506 nm的吸光值，對照組將100 μL粗酶液煮沸 15 min使酶失活，其余操作與實驗組相同。酶活定義：30 ℃，pH 4.5的條件下，每小時水解1 μmoL丙氨酸所需要的酶量為1個酶活力單位（U）。

1.3.4 絲氨酸羧肽酶的純化

因在構建表達載體時在目的基因中加入 6ⅹHis標簽，故可以利用鎳柱親和層析的方法進行絲氨酸羧肽酶的純化。將重組菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，將發(fā)酵培養(yǎng)基離心取上清后用0.45 μm的濾膜過濾，將其用于純化。使用HisTrapTMHP層析柱，上樣量為20 mL，流速為1 mL/min。采用梯度洗脫法（洗脫液中咪唑的濃度為0～0.5 mol/L）收集不同的洗脫峰。利用SDS-PAGE檢驗每個洗脫峰，得到單一的絲氨酸羧肽酶溶液。

1.3.5 絲氨酸羧肽酶的酶學性質研究

1.3.5.1 溫度對絲氨酸羧肽酶的影響

最適溫度測定：在pH值為4.5的條件下，將純化得到的蛋白酶液分別在20、40、50、60、70、80 ℃條件下測定絲氨酸羧肽酶的酶活，以最高的酶活力為100%。溫度穩(wěn)定性測定：將酶液在上述溫度下保溫處理2 h，測定剩余的酶活力，以未經處理組的酶活力為100%。

1.3.5.2 pH對絲氨酸羧肽酶的影響

最適pH值測定：配制不同pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0）0.5 mmol的FA-Phe-Ala底物溶液，在測量得到的最適溫度下，測定不同 pH值條件的酶活變化，以最高的酶活力為100%。pH穩(wěn)定性測定：將酶液在上述pH條件下保溫處理2 h，測定酶液剩余的酶活力，以未經處理組的酶活力為100%。

1.3.5.3 金屬離子對絲氨酸羧肽酶的影響

在標準的酶液反應體系下，加入不同的金屬離子（Ba2+、Mn2+、K+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Na+、Zn2+、Cu2+），在反應體系中每種離子的終濃度為 5.0 mmol，測定絲氨酸羧肽酶的酶活，以未經處理組的酶活力為100%。

1.3.6 絲氨酸羧肽酶在大豆蛋白脫苦中的應用

1.3.6.1 甲醛滴定法測定水解度

取5 mL SPI水解樣品加入60 mL超純水，用0.1 mol/L NaOH調節(jié)樣品pH至8.2。向溶液中緩慢加入10 mL pH值為8.2中性甲醛溶液，用0.01 mol/L NaOH進行滴定實驗，滴定至pH 9.2，記錄NaOH標準溶液的消耗體積V。空白對照組為將5 mL SPI樣品換成5 mL超純水，其他步驟與樣品組一致，記錄NaOH標準溶液的消耗體積V0。按以下公式計算水解樣品的水解度[23]：

式中：

C——樣品中原大豆分離蛋白濃度，g/L；

0.33——大豆分離蛋白中游離氨基的濃度，mmol/g；

7.8——每克大豆分離蛋白的肽鍵當量數(shù)，mmol/g。

1.3.6.2 不同pH值條件下胃蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究

配制pH為3、3.5、4、4.5的緩沖液溶解大豆分離蛋白。胃蛋白酶的添加量為1:100（酶：底物），溫度為37 ℃，每隔1 h測定其水解度，酶解時間為8 h。

1.3.6.3 胃蛋白酶與絲氨酸羧肽酶復配水解大豆分離蛋白

在pH為3.5時測定胃蛋白酶與絲氨酸羧肽酶復配對大豆分離蛋白的影響。實驗組：向經過預處理的大豆分離蛋白中按照1:100的酶量加入胃蛋白酶，酶解處理6 h，再加入300 U/g的絲氨酸羧肽酶酶液CPG反應6 h，反應結束時測量水解度。對照組處理方法為經過預處理的SPI中加入相同酶量的胃蛋白酶，反應12 h，反應結束時測量水解度并測定水解液中游離氨基酸的含量。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗重復三次，所有的實驗數(shù)據(jù)采用采用SPSS 19.0進行方差分析，Origin進行圖表的繪制。

2 結果與討論

2.1 重組絲氨酸羧肽酶菌株的篩選

將黑曲霉A.nigerCBS 513.88中3個絲氨酸羧肽酶基因（CPA、CPF、CPG）在 SignalP 5.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析工具上進行信號肽預測發(fā)現(xiàn)3個基因均含有N端的分泌信號。

為構建正確的絲氨酸羧肽酶表達載體，根據(jù)表 1中的引物進行 PCR擴增得到分別含自身信號肽和糖化酶信號肽的絲氨酸羧肽酶基因片段（圖 1a），將絲氨酸羧肽酶基因片段、啟動子PnaⅡ和線性化的UEV通用載體片段進行連接構建表達載體，最終得到測序正確的表達載體 UEV-CPG/CPF/CPA/CPG-g/CPF-g/CPA-g。為了篩選得到高表達的絲氨酸羧肽酶重組菌株，將 6個表達載體（UEV-CPG/CPF/CPA/CPG-g/CPF-g/CPA-g）轉化至黑曲霉HL-1宿主中得到6種絲氨酸羧肽酶重組菌株，經PCR驗證正確后的陽性轉化子接種至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h后測定絲氨酸羧肽酶酶活（圖 1c）。信號肽為自身信號肽的重組菌株（HL-CPG、HL-CPF、HL-CPA）的酶活均比信號肽為糖化酶信號肽的重組菌株（HL-CPG-g、HL-CPF-g、HL-CPA-g）的酶活高，可能是因為在絲氨酸羧肽酶的N端含有約90個殘基的失活前結構域，該結構域能夠保護蛋白質不被其他內肽酶切割且與蛋白質的折疊有關，更換信號肽之后可能會影響蛋白質的結構導致羧肽酶的活性部位被剪切[25]。在兩個系列的重組菌株中含CPG基因的重組菌株酶活最高，且在6株不同的絲氨酸羧肽酶菌株中酶活最高的為HL-CPG菌株，酶活為163.71 U/mL，與Morita等[8]報道的85.31 U/mL相比，絲氨酸羧肽酶酶活提高了96.61%，說明篩選得到的絲氨酸羧肽酶重組菌株能達到較高的表達水平。

2.2 重組酶CPG的純化

將經過預處理的HL-CPG菌株的發(fā)酵上清液經過鎳柱親和層析并將純化之后的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖2所示，泳道3為純化之后的蛋白樣品，蛋白條帶大小與發(fā)酵上清液中的大小一致。

2.3 重組絲氨酸羧肽酶CPG的酶學性質

2.3.1 溫度對重組酶CPG的影響

重組酶CPG在40 ℃時酶活最高，當溫度為80 ℃時僅具有10%左右的相對酶活力（圖3a）。另外重組酶在20～50 ℃時酶活相對穩(wěn)定，在此范圍內處理2 h后能保持60%以上的相對酶活力（圖3b）。

2.3.2 pH值對重組酶CPG的影響

重組酶CPG在pH為3.5時酶活最高且隨著pH值的升高酶活迅速下降，在pH值為9時僅保持10%的相對酶活（圖4a）。將重組酶CPG在各pH條件下反應2 h后，在pH值為3～5時保持50%以上的相對酶活力，在中性條件及堿性條件下不能穩(wěn)定存在（圖4b）。

2.3.3 金屬離子對重組酶CPG的影響

在各金屬離子的濃度為5 mmol/L時，實驗結果如表3所示。Cu2+對重組酶CPG具有明顯的抑制效果，Ba2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Zn2+對重組酶CPG具有輕微的抑制效果，K+對CPG的作用效果非常小，Na+對羧肽酶CPG有激活的作用，能夠提高10%的酶活力。

表3 金屬離子對純化后重組酶CPG酶活的影響Table 3 The effect of metal ions on the activity of purified recombinant CPG

2.4 重組絲氨酸羧肽酶CPG在大豆蛋白脫苦中的應用

2.4.1 胃蛋白酶在不同pH值條件下水解大豆蛋白

用胃蛋白酶水解不同pH值條件的大豆分離蛋白，結果如圖5所示。在pH值為3時大豆分離蛋白的水解最高。且隨著pH值的升高，胃蛋白酶的水解能力逐漸下降，大豆分離蛋白的水解度降低。在所有條件下，前3 h的水解度變化較大，隨后趨于穩(wěn)定并在第6 h時水解度達到最高。在pH值為3.5時大豆分離蛋白的水解度略低于pH值為3時的水解度，但考慮重組酶CPG的酶學性質，選擇pH 3.5作為重組酶CPG與胃蛋白酶復配實驗的水解條件。

2.4.2 重組酶CPG與胃蛋白酶聯(lián)合水解大豆蛋白

實驗組中加入胃蛋白酶處理6 h之后繼續(xù)加入重組酶CPG進行處理6 h，對照組中加入相同酶量的胃蛋白酶處理12 h后分別測量水解液的水解度和氨基酸含量。對照組中水解液的水解度為10.17%，而實驗組的水解度為19.72%，水解度明顯提高。實驗組中氨基酸的種類和含量明顯高于對照組（圖6）。在實驗組中Glu、leu、Phe、Tyr和Arg氨基酸的含量較高，疏水性氨基酸 Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr和 Phe 的含量增加明顯，特別是Phe的含量增加最明顯，其次是Leu 和 Tyr，含量分別增加 606.47 μg/mL、434.06 μg/mL和205.11 μg/mL。另外實驗組中鮮味氨基酸Glu等的含量也明顯增加。因此將胃蛋白酶和重組酶CPG復配水解大豆蛋白會明顯降低水解液的苦味同時水解液中鮮味也明顯增加。

3 結論

3.1 黑曲霉是優(yōu)秀的蛋白表達宿主，具有強大的蛋白分泌能力，完善的蛋白修飾體系和生物安全性等優(yōu)點。本研究利用啟動子PnaⅡ、終止子Ttef和雙向篩選標記pyrG篩選高表達量的絲氨酸羧肽酶基因，并嘗試更換信號肽來增高絲氨酸羧肽酶的表達量。通過PCR鑒定挑選表達正確的重組絲氨酸羧肽酶菌株，通過搖瓶發(fā)酵篩選高表達量的菌株，最終成功篩選得到重組絲氨酸羧肽酶菌株 HL-CPG，其酶活達到 163.71 U/mL。對重組絲氨酸羧肽酶CPG進行鎳柱親和層析并進行SDS-PAGE檢測，得到單一的蛋白條帶。對重組酶CPG進行酶學性質研究，重組酶CPG在40 ℃時酶活最高，在20 ℃～50 ℃時具有較好的熱穩(wěn)定性；在pH值為3.5時酶活最高，pH值在3.0～5.0時具有較好的穩(wěn)定性；Na+對重組酶CPG具有激活作用，而Cu2+具有較強的抑制作用。

3.2 將胃蛋白酶和絲氨酸羧肽酶CPG復配后應用于大豆蛋白脫苦，其水解度比僅使用胃蛋白酶時高9.55%，水解液中疏水性氨基酸（Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr和Phe）含量明顯增加，鮮味氨基酸（Glu）含量也明顯增加，不僅降低了水解液的苦味，還明顯增加了鮮味。因此重組酶CPG能夠改善苦味，在食品工業(yè)上擁有較好的應用前景。