廖雪艷，王琦，汪克純*

（1.四川大學華西第四醫(yī)院，老年醫(yī)學/心血管內(nèi)科，四川成都 610041）

（2.成都市第六人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 610051）

高血壓是一種臨床綜合癥，主要特征表現(xiàn)為人體的收縮壓大于等于140 mm Hg和舒張壓大于等于90 mm Hg。高血壓病的發(fā)病機制較為復雜，肝、腎、心、脾功能失調(diào)造成機體的正常生理活動失衡，從而可能導致機體出現(xiàn)高血壓[1]。高血壓除了對大腦有損害，也會一定程度造成心臟和腎臟的損傷，甚至也會對眼睛造成影響，是一種對多個人體器官有危害的疾病，2018年全國高血壓調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國18歲及以上成人高血壓患病率為27.9%，而且患病率呈上升趨勢[2]。天然無毒的植物，特別是可作為食品直接使用的植物，已經(jīng)被證實能通過促進血液循環(huán)、緩解血瘀、調(diào)節(jié)血脂、恢復血壓調(diào)節(jié)來起到良好的高血壓預防和干預效果[3-5]。林檎（Malus pumila）可作為中藥使用，林檎葉則可以制成保健茶作為飲品進行使用，林檎葉作為一種食品資源已廣泛使用[6]。研究顯示林檎葉含有豐富的黃酮、多種氨基酸、生物堿以及多種礦物質(zhì)成分[7]。林檎葉能夠提高人體免疫力和提高人體細胞新陳代謝的活性都有一定的作用，同時林檎葉還具有較好的抗氧化效果、改善心臟功能和促進微循環(huán)的效果[8]，林檎葉的這些生物活性作用都將可能產(chǎn)生預防和干預高血壓的作用。

由于高血壓是一種綜合癥，發(fā)病的原因也不盡相同，臨床上在藥物的選擇上也需要區(qū)分對待，患病后用藥和治療都較為復雜。但是不同原因造成的高血壓大部分具有相同的特點，體內(nèi)一氧化氮的水平均有異常。一氧化氮的一個重要生理作用是調(diào)節(jié)血管張力，降低血壓[9]。研究報道一氧化氮是預防包括高血壓在內(nèi)的心腦血管疾病的關(guān)鍵因子[10]。L-精氨酸是一種一氧化氮合成酶抑制劑，能抑制一氧化氮的生成，從而導致實驗性高血壓，常用于誘導實驗動物高血壓[11]。NOS抑制劑能抑制多種血管舒張因子調(diào)控的內(nèi)皮依賴性舒張[12]。大量 NOS抑制劑能在短時間內(nèi)強烈抑制小鼠血管內(nèi)皮細胞中的一氧化氮的生成，改變血管組織結(jié)構(gòu)，導致內(nèi)皮功能受損和動脈血壓升高，從而維持動物持續(xù)高血壓[13]。通過調(diào)控機體內(nèi)的NOS/NO，可以起到預防和干預高血壓的作用[10]。能夠調(diào)控機體內(nèi)的NOS/NO水平的天然食品在維持人體健康，保持血壓平穩(wěn)上具有重要的現(xiàn)實意義。林檎葉對心臟功能的調(diào)節(jié)作用也可能來源于其對NOS/NO的調(diào)節(jié)作用，本研究將對其進一步驗證。

本研究也采用L-NNA誘導小鼠發(fā)生高血壓，建立動物實驗模型，對林檎葉提取物預防實驗性高血壓的效果進行研究。通過測定小鼠的血壓與分析小鼠血液和組織中的相關(guān)指標驗證林檎葉提取物的效果，并結(jié)合林檎葉提取物的成分分析，初步探討了林檎葉對高血壓預防作用的機制，為進一步開發(fā)林檎葉為功能性食品積累理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

林檎葉，重慶市巫山縣峽江茶業(yè)有限公司；一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）和E-選擇素（E-selectin），南京建成生物工程研究所；RNAzol試劑，血紅素加氧酶-1（HO-1）、腎上腺髓質(zhì)素（ADM）、受體活性修飾蛋白 2（RAMP2）、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）引物，美國賽默飛公司；Oligo(dT)18、RNase、dNT和MLV酶，瑞士羅氏公司；異槲皮苷、橙皮苷、楊梅素、新橙皮苷二氫查爾酮、槲皮苷、二氫槲皮素、黃芩苷、槲皮素和金絲桃苷標準品，上海源葉生物科技有限公司；Nω-硝基-L-精氨酸（L-NNA），上海信帆生物科研所；卡托普利，美國Sigma公司；其余試劑為分析純。

雄性昆明（KM）小鼠購于重慶醫(yī)科大學，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2018-0003。

1.2 儀器與設備

Biomate3S光分光光度儀、Sepone Plus定量PCR儀、U3000高效液相色譜儀，均為美國賽默飛公司；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長征儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 林檎葉提取物的制備

稱取干燥的林檎葉 200 g，將其粉碎后按液料比20:1加入70%乙醇，在60 ℃水浴下提取3 h，抽濾，收集粗提取液，然后提取液過FL-3大孔樹脂3次，將最后的提取液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到林檎葉提取物。

1.3.2 林檎葉提取物的高效液相色譜法成分分析

精密稱取干燥的異槲皮苷、橙皮苷、楊梅素、新橙皮苷二氫查爾酮、槲皮苷、二氫槲皮素、黃芩苷、槲皮素、金絲桃苷標準品各2 mg置于5 mL的離心管中，再分別加入2 mL的99%甲醇溶液混勻，作為標準儲備液。按色譜條件測定林檎葉提取物的成分，色譜柱：Thermo Scientific Accucore C18（4.6 mm×150 mm、2.6 μm），梯度洗脫的流動相C為乙腈，流動相B為0.5%冰醋酸水溶液，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長360 nm，進樣量為10 μL。依據(jù)HPLC法對林檎葉提取物用外標峰面積法計算其組成化合物的含量，計算公式如下：

式中：

Mc——樣品中各組成成分的含量，mg/g；

C1——標準品濃度，mg/mL；

AR——標準品峰面積；

A1——樣品峰面積；

C——樣品原液濃度，0.0025 g/mL。

1.3.3 動物實驗

50只7周齡雄性KM小鼠在溫度為25±2 ℃、相對濕度50±5%、2 h/12 h光/暗循環(huán)的環(huán)境下適應性飼養(yǎng)一周后，將小鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組，林檎葉低濃度組，林檎葉高濃度組和卡托普利組（藥物陽性對照組）。所有小鼠自由攝取飲食和飲水，實驗開始后第1 d到第20 d，正常組和模型組小鼠每日每只灌胃0.2 mL蒸餾水，林檎葉低濃度組和高濃度組小鼠每日按濃度50和100 mg/kg灌胃林檎葉提取物，卡托普利組小鼠每日按濃度50 mg/kg灌胃卡托普利溶液。從第21 d開始到第30 d，除正常組外其余各組小鼠按濃度700 mg/kg灌胃L-NNA，同時林檎葉低濃度組和高濃度組小鼠每日繼續(xù)按濃度 50和 100 mg/kg灌胃林檎葉提取物，卡托普利組小鼠也繼續(xù)每日按濃度50 mg/kg灌胃卡托普利溶液[14]。實驗過程中每5 d采用鼠尾袖帶法測定L-NNA處理后45 min的收縮壓（SBP）、平均壓（MBP）和舒張壓（DBP）。實驗30 d后對所有小鼠采用斷頸法處死小鼠，取心、肝、腎、胃組織及血樣。本研究中實驗方案經(jīng)四川大學華西第四醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，倫理審批批準號：Gwll2020028。

1.3.4 小鼠組織中NO和MDA含量的測定

采用生化試劑盒測定心、肝、腎、胃組織中 NO和MDA的含量。

1.3.5 小鼠血清中NO、MDA、ET-1和CGRP的水平的測定

采用試生化試劑盒測定血清NO、MDA、ET-1和CGRP的水平，采用ELISA試劑盒測定血清VEGF水平。

1.3.6 小鼠組織中mRMA表達的測定

使用RNAzol試劑從心肌組織中提取總RNA。測定提取總RNA的濃度后然后調(diào)整濃度到1 μg/μL。然后在總RNA提取液中分別加入1 μL的Oligo(dT)18、RNase、dNT、MLV 酶和 10 μL 的 5×buffer。在 37 ℃持續(xù)120 min、99 ℃持續(xù)4 min和4 ℃持續(xù)3 min條件下合成cDNA。然后再加入上下游引物（表1）各1 μL充分混合后，溶液在95 ℃持續(xù)90 s，40個循環(huán)的95 ℃持續(xù) 30 s、60 ℃持續(xù) 30 s、72 ℃持續(xù) 30 s、95 ℃持續(xù)30 s和55 ℃持續(xù)35 s。按2-ΔΔCt法計算相對于模型組其余各組不同表達的相對基因表達水平，其中GAPDH作為持家基因進行實驗[15]。

表1 本研究使用的qPCR引物Table 1 qPCR primers were used in this study

1.4 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值表示±標準偏差。采用單因素方差分析（ANOVA）和鄧肯多區(qū)間檢驗（Duncan's multiple range tests）評估各組間的平均值在p＜0.05水平下是否具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 林檎葉提取物的成分分析

如圖1所示，樣品峰與雜質(zhì)峰之間分離明顯，基線平穩(wěn)，基本可以對林檎葉中的化合物成分進行定性分析。發(fā)現(xiàn)所測林檎葉中的黃酮類物質(zhì)占主要成分，提取物中有9種物質(zhì)，分別是金絲桃苷、異槲皮苷、二氫槲皮素、槲皮苷、橙皮苷、楊梅素、異黃芩苷、新橙皮苷二氫查爾酮、槲皮素，含量分別為104.92、83.05、15.14、242.83、60.24、13.87、125.53、11.23、28.92 mg/g。金絲桃苷、異槲皮苷、二氫槲皮素、槲皮苷、橙皮苷、楊梅素、異黃芩苷、新橙皮苷二氫查爾酮、槲皮素均具有良好的抗氧化效果，且具有一定的抗炎作用，能夠調(diào)節(jié)機體，發(fā)揮有益作用[16-21]。特別是二氫槲皮素、槲皮苷、橙皮苷、楊梅素和槲皮素已經(jīng)被驗證具有活化血管的作用，通過對心血管活力的增強作用，發(fā)揮干預高血壓的作用[21-25]，特別是含量最高的槲皮苷，已被研究證實具有舒張血管的作用[26]，從而有可能是林檎葉發(fā)揮預防高血壓作用的最關(guān)鍵成分；金絲桃苷在林檎葉提取物中的含量也較高，有研究表明金絲桃苷能夠調(diào)節(jié)血管張力，抑制血管重塑，從而起到降血壓的作用[27]。這9種化合物已經(jīng)被證實具有對人體有利的活性作用，這些有效活性物質(zhì)的聯(lián)合作用可能使林檎葉具有預防高血壓的作用，但是這些化合物的聯(lián)合作用與單獨化合物作用之間的差異有待進一步研究，天然化合物組成的優(yōu)勢也有待深入研究。

2.2 林檎葉提取物對小鼠血壓的影響

研究證實林檎葉用70%乙醇溶液提取得到的提取物無毒性作用，是安全的天然提取物質(zhì)[28]，因此本研究中直接采用林檎葉提取物對高血壓小鼠進行作用。在L-NNA作用前，除卡托普利組外，各組小鼠的收縮壓（SBP）、平均血壓（MBP）和舒張壓（DBP）無顯著差異（p＜0.05），而卡托普利組小鼠的血壓低于其余各組（圖2）。而小鼠經(jīng)過L-NNA作用后，相較未經(jīng)過 L-NNA作用的正常組小鼠，其余各組小鼠的SBP、MBP和DBP均升高。其中模型組小鼠的SBP、MBP和DBP均高于其他各組，林檎葉低濃度組小鼠的SBP、MBP和DBP也高于林檎葉高濃度組和卡托普利組小鼠，林檎葉高濃度組小鼠的SBP（110.35 mm Hg）、MBP（90.35 mm Hg）和 DBP（80.35 mm Hg）僅高于正常組（103.39 mm Hg、83.39 mm Hg、71.39 mm Hg）和卡托普利組（108.97 mm Hg、89.97 mm Hg、79.97 mm Hg），且林檎葉高濃度組和卡托普利組之間無顯著差異，都低于林檎葉低濃度組。血壓測定的結(jié)果顯示在L-NNA作用前，卡托普利已經(jīng)起到降低血壓的作用，對普通小鼠的血壓有一定的副作用。L-NNA建模后小鼠血壓上升，建模成功，林檎葉起到了降血壓作用，且無明顯副作用。

2.3 林檎葉提取物對小鼠NO含量的影響

如表2所示，正常組小鼠的血清及心、肝、腎、胃組織中 NO 含量最高，分別為 6.86 μmol/L、7.99 μmol/g prot、2.67 μmol/g prot、7.59 μmol/g prot和 9.55 μmol/g prot，而模型組小鼠的NO含量最低，分別為3.76 μmol/L、3.01 μmol/g prot、0.41 μmol/g prot、3.27μmol/g prot和 5.26 μmol/g prot。林檎葉高濃度組和卡托普利組小鼠上述組織中NO含量均顯著高于模型組（p＜0.05）和林檎葉低濃度組。而林檎葉高濃度（5.36 μmol/L、5.98 μmol/g prot、2.02 μmol/g prot、3.27 μmol/g prot、8.36 μmol/g prot）和卡托普利（5.40 μmol/L、6.02 μmol/g prot、2.09 μmol/g prot、3.27 μmol/g prot、8.45 μmol/g prot）提升NO含量的能力強于林檎葉低濃度。NO作為體內(nèi)重要的信號分子，能激活血管平滑肌細胞中可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，產(chǎn)生cGMP，激活一系列生理效應，舒張血管平滑肌，降低血壓[29]。當一氧化氮合成受阻時，血管表現(xiàn)為血管舒張功能障礙和小動脈纖維化，從而升高血壓并形成高血壓。林檎葉提取物也與以往的研究[17]得到了相似的結(jié)果，活性成分通過調(diào)控NO含量能發(fā)揮降血壓作用。

2.4 林檎葉提取物對小鼠MDA含量的影響

L-NNA誘導小鼠高血壓后，模型組小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和胃中的 MDA含量最高（11.69 nmol/mL、4.52 nmol/mg prot、1.09 nmol/mg prot、2.96 nmol/mg prot、3.52 nmol/mg prot，表 3）。林檎葉和卡托普利能顯著降低高血壓小鼠的MDA含量（p＜0.05），且林檎葉高濃度（4.92 nmol/mL、2.78 nmol/mg prot、0.50 nmol/mg prot、1.62 nmol/mg prot、2.03 nmol/mg prot）和卡托普利（4.86 nmol/mL、2.75 nmol/mg prot、0.49 nmol/mg prot、1.57 nmol/mg prot、1.96 nmol/mg prot）能使高血壓小鼠的血清和組織MDA含量接近正常小鼠，同時林檎葉高濃度和卡托普利效果相當，均顯著低于林檎葉低濃度組（p＜0.05）。NO含量較低會導致自由基攻擊內(nèi)皮細胞膜[30]。脂質(zhì)過氧化，最終產(chǎn)物為丙二醛。因此，許多研究通過檢測體內(nèi) NO和MDA 水平來判斷高血壓的嚴重程度[31]，林檎葉提取物也得到了類似的結(jié)果，能夠下調(diào)MDA水平起到抑制高血壓造成的機體損傷，體現(xiàn)出預防和干預高血壓的重要作用。

表2 L-NNA致高血壓小鼠血清、心、肝、腎、胃中一氧化氮含量的變化Table 2 The nitric oxide contents in serum, heart, liver, kidney and stomach of L-NNA induced hypertension mice (mean±SD, n=10)

表3 L-NNA致高血壓小鼠血清、心、肝、腎、胃中丙二醛含量的變化Table 3 The malonaldehyde contents in serum, heart, liver, kidney and stomach of L-NNA induced hypertension mice (mean±SD, n=10)

表4 L-NNA致高血壓小鼠血清ET-1、CGRP、VEGF和E-selectin水平的變化Table 4 The ET-1, CGRP, VEGF and E-selectin serum levels of L-NNA induced hypertension mice (mean±SD, n=10)

2.5 林檎葉提取物對小鼠血清ET-1、CGRP、VEGF-A和E-selectin水平的影響

與正常小鼠相比，L-NNA誘導的高血壓小鼠血清的ET-1、VEGF-A和E-selectin（110.57 pg/mL、341.48 pg/mL、855.97 ng/mL）水平顯著升高（p＜0.05），而CGRP水平顯著降低（55.69 pg/mL，p＜0.05，表4）。林檎葉和卡托普利可降低高血壓小鼠血清 ET-1、VEGF-A、E-selectin水平和提升CGRP水平，且林檎葉高濃度（75.17、147.82、202.45、547.63 ng/mL）和卡托普利（72.39、150.68、195.79、539.98 ng/mL）對ET-1、CGRP、VEGF-A和E-selectin水平作用相似，無顯著差異（p＜0.05）。且林檎葉高濃度組和卡托普利調(diào)控小鼠血清ET-1、CGRP、VEGF-A和E-selectin水平能力顯著強于林檎葉低濃度組（p＜0.05）。ET-1是血管收縮活性多肽，能使血管平滑肌肥大，促進血管壁增生和狹窄，保持血管通暢[32]。CGRP也是體內(nèi)重要的血管活性多肽之一，其分泌失衡在血管內(nèi)皮細胞損傷導致高血壓的病理過程中起著重要作用[33]。VEGF-A是一種血管活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血管舒縮和血管重塑中起重要作用，它是血管內(nèi)皮細胞中一種特異的促細胞因子和血管生成因子，能促進血管內(nèi)皮細胞有絲分裂，刺激內(nèi)皮細胞增殖，促進血管生成[34]。血管內(nèi)皮細胞受損后內(nèi)皮細胞變性、壞死、脫落，動脈壁動脈硬化，管腔狹窄變形，從而導致E-selectin水平異常上升，降低E-selectin水平也是抑制高血壓的手段之一[35]。林檎葉提取物也具有對ET-1、CGRP、VEGF-A和E-selectin水平調(diào)節(jié)的作用，也證實了與其他研究一樣可通過調(diào)控ET-1、CGRP、VEGF-A和E-selectin水平能夠起到預防高血壓的作用[32-34]。

2.6 林檎葉提取物對小鼠心肌組織中 HO-1、ADM和RAMP2表達的影響

正常組小鼠心肌組織中HO-1和RAMP2 mRNA表達最強（模型組表達強度的4.02和3.56倍，圖3），而ADM表達最弱（模型組表達強度的0.23倍）；模型組小鼠呈現(xiàn)出與正常組相反的趨勢，HO-1 mRNA表達最低，ADM和RAMP2表達最強。林檎葉和卡托普利可下調(diào)高血壓小鼠的 ADM 表達和上調(diào) HO-1、RAMP2表達，高濃度的林檎葉效果顯著優(yōu)于低濃度的林檎葉（模型組表達強度的0.48、3.45和3.02倍，p＜0.05），且效果與卡托普利接近（模型組表達強度的0.45、3.52和3.11倍）。研究顯示ADM是一種與降鈣素基因相關(guān)的鈦，異常狀態(tài)下心肌組織中存在 ADM及其受體的高表達。高血壓時體內(nèi)ADM代償水平升高，心肌中ADM的表達增加[36]。RAMP2是ADM的特異性受體，因此ADM和RAMP2在心血管系統(tǒng)中的表達具有重要的相互促進作用。控制心臟中 ADM和RAMP2的含量可以有效控制高血壓[37]。林檎葉提取物作用下高血壓小鼠的HO-1、ADM和RAMP2表達均出現(xiàn)顯著變化，由此可以證明林檎葉提取物也具有通過調(diào)控HO-1、ADM和RAMP2表達對實驗性的高血壓有實質(zhì)的影響。

2.7 林檎葉提取物對小鼠心肌組織 nNOS、eNOS和iNOS表達的影響

如圖4所示，正常組小鼠心肌組織中的nNOS和eNOS mRNA表達顯著高于其余各組小鼠（模型組表達強度的5.12和4.89倍，p＜0.05），而iNOS表達則顯著低于其他各組（模型組表達強度的0.23倍，p＜0.05）。相比模型組，林檎葉高濃度組（模型組表達強度的4.32和4.02倍）、林檎葉低濃度組（模型組表達強度的3.10和2.96倍）和卡托普利組（模型組表達強度的4.41和4.10倍）小鼠心肌組織中的nNOS和eNOS表達高于模型組，而iNOS表達低于模型組（模型組表達強度的0.48、0.77和0.45倍）。同時，林檎葉高濃度和卡托普利發(fā)揮的作用相似，能使nNOS、eNOS和iNOS的表達最為接近正常組，效果強于林檎葉低濃度組。內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞都含有一氧化氮合酶（NOS）。在NOS的催化下，L-精氨酸和分子氧可以生成一氧化氮，NOS是一氧化氮生成的限速酶[38]。一氧化氮的含量主要由NOS調(diào)節(jié)，NOS包括nNOS、eNOS和iNOS，在生理條件下，cNOS（nNOS、eNOS）合成 NO，調(diào)節(jié)血管張力和血壓，持續(xù)釋放少量NO，維持血壓[39]。iNOS不依賴鈣離子在正常情況下不表達，但在高血壓情況下表達[40]。實驗結(jié)果顯示林檎葉提取物和相關(guān)研究得到了相同的結(jié)果，能夠通過調(diào)控nNOS、eNOS和iNOS表達能夠發(fā)揮預防高血壓的作用。

3 結(jié)論

本研究利用動物模型測定了林檎葉對高血壓的預防作用。L-NNA能夠誘導小鼠高血壓，林檎葉提取物能降低L-NNA誘導的高血壓，其機制可能與其調(diào)控NOS水平的能力有關(guān)。林檎葉提取物改善血管活力的功能也有助于預防L-NNA引起的高血壓，且高濃度林檎葉對高血壓的影響更大，與藥物卡托普利的效果相近。林檎葉是天然植物，主要由9種具有生物活性作用的化合物組成，這些化合物的聯(lián)合作用形成了林檎葉對高血壓的預防作用，同時研究證實其具有無害的特點[16]，進一步通過本研究驗證其在生活中可能適合于輕度高血壓或血壓異常者，林檎葉可作為保健品進一步開發(fā)利用。