袁先鈴，鄭貽丹，羅燚，林洪斌

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644005）（2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川成都 610039）

自貢冷吃兔是自貢乃至川南地區(qū)的一種特色傳統(tǒng)肉制品，以鮮兔肉為原料，輔以辣椒、花椒、姜等香辛料，經(jīng)預(yù)煮、腌制、炒制等工藝加工而成[1]。目前，自貢冷吃兔的品種有冷吃兔丁、香辣兔頭、兔腿，口味有香辣味、麻辣味、醬香味、無香味等[2]。兔肉質(zhì)地細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，頗受消費者的喜愛[3-5]。兔產(chǎn)業(yè)目前發(fā)展迅速尤其是在發(fā)展中地區(qū)并且世界兔產(chǎn)業(yè)具有巨大的發(fā)展?jié)摿6]。根據(jù)自貢市統(tǒng)計局公布數(shù)據(jù)顯示，2014～2017年，自貢市從事冷吃兔加工企業(yè)數(shù)量10余家增至60余家，以“前店后廠”模式生產(chǎn)加工冷吃兔的小作坊達(dá)100多戶增至1000余戶，其中每年規(guī)模以上加工企業(yè)數(shù)量呈現(xiàn)逐年增加趨勢[7]。2014年自貢市冷吃兔的產(chǎn)值為 2.5億，2018年增至13.5 億[8]。

生產(chǎn)環(huán)境中存在多種致病性、變質(zhì)性微生物造成的微生物污染，可能會損害食品安全和質(zhì)量。食品和生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測相結(jié)合，是提高食品安全和質(zhì)量的杠桿[9]。

自貢冷吃兔屬于高溫肉制品，能夠達(dá)到商業(yè)無菌，但仍會殘存部分細(xì)菌。在熟肉制品中，乳酸菌、葡萄球菌以及腸桿菌常被分離出來[10-11]。Yi等[12]對36種熏肉進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)鞘氨單胞菌（Sphingomonas）、假單胞菌（Pseudomonas）、葡萄球菌（staphycoccus）、明串珠菌（Leuconostoc）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的豐度較高。李冉等[13]對氣調(diào)包裝獅子頭冷藏過程中微生物變化及菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)獅子頭腐敗時期的菌群結(jié)構(gòu)主要由芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、不動桿菌屬（Acinetobaceterspp.）、熱殺索絲菌屬（Brochothrixspp.）、腸桿菌屬（Enterobacterspp.）、乳酸菌屬（Lactobacillusspp.）以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）組成。圖爾蓀阿依·圖爾貢等[14]從腐敗香辣蟹中分離出 15株腐敗菌，其中 3株屬于葡萄球菌屬（Staphylococcussp.)，6株屬于白色桿菌屬（Leucobactersp.)，3 株屬于變形桿菌屬（Proteussp.），2株屬于普羅威登斯菌（Providencia vermicola），1株屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobactersp.）。

本研究通過對自貢冷吃兔生產(chǎn)加工車間、生產(chǎn)器具與設(shè)備、操作人員手的微生物進(jìn)行數(shù)量測定，分離篩選出主要微生物，了解自貢冷吃兔加工生產(chǎn)過程中細(xì)菌污染狀況及其分布情況，為確定關(guān)鍵控制點與污染源、規(guī)范操作流程，構(gòu)建自貢冷吃兔污染微生物數(shù)據(jù)庫提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

采樣于四川省自貢市某冷吃兔工廠。

主要試劑：PCA平板計數(shù)瓊脂、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、MRS培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、LB培養(yǎng)基和亞蹄酸鹽卵黃增菌液，購于青島海博生物技術(shù)有限公司；氯化鈉（分析純）購于上海源葉生物科技有限公司；甘油購于上海麥克林生化科技有限公司；1×TSE101金牌mix、TSINGKE高純度低電滲瓊脂糖、DNA凝膠回收試劑盒和DL5000 Marker購于Tsingke。

主要設(shè)備：HLD-30002電子天平，杭州友恒稱重設(shè)備有限公司；DK-98-11萬用電爐，北京科偉永興儀器有限公司；LS-75HD立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；101-3AB數(shù)顯恒溫鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋，上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；Hws-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市宏諾儀器有限公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QYC-2102雙層小容量全溫恒溫?fù)u床，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；3730XL測序儀，Applied Biosystems；Legend Micro17離心機，Thermo；2720 thermal cyclerPCR儀，Applied Biosystems；JY300C電泳儀、JYDF(定制)電泳槽、JY04S-3C凝膠成像儀，君意東方；DFD-700水浴鍋，北京中興偉業(yè)；L550板式離心機，cence湘儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的采集

1.2.1.1 采樣方法

涂抹采樣：用經(jīng)殺菌后蘸有無菌生理鹽水棉球擦拭取樣框內(nèi)表面（框內(nèi)面積為 50 cm2），擦完后將棉球放入盛有10 mL無菌生理鹽水的試管中，此試管中溶液每1 mL代表5 cm2，密封帶回微生物室備用[15]。

自然沉降法：參考GB/T 18204《公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第3部分：空氣微生物》中自然沉降法進(jìn)行采樣[16]。

1.2.1.2 采樣位置

生產(chǎn)器具：主要針對生產(chǎn)中與冷吃兔半成品、成品有接觸的器具，包括切刀、瀝水器具、盛放器具、轉(zhuǎn)移器具、攤涼器具、預(yù)煮機內(nèi)壁、腌制機內(nèi)壁、炸制機內(nèi)壁、炒制機內(nèi)壁，采用涂抹取樣。

人員：宰切人員、預(yù)煮人員、腌制人員、炸制人員、包裝人員，采用涂抹取樣。

生產(chǎn)車間：原料處理間、輔料處理間、輔料儲存間、炒制間、冷卻間、包裝間，采用自然沉降法。

1.2.2 生產(chǎn)環(huán)境中細(xì)菌數(shù)量測定

參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[17]、GB 4789.35-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》[18]、GB 4789.41-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 腸桿菌科檢驗》[19]和GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[20]對原輔料進(jìn)行菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)量、腸桿菌數(shù)數(shù)量、葡萄球菌數(shù)量測定，在無菌條件下，將取樣與225 mL無菌生理鹽水混合，震蕩混勻5 min，將樣品懸液10倍梯度稀釋，選取3個稀釋度，分別接種至不同培養(yǎng)基，每個稀釋度做2個重復(fù)，各種微生物選擇培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件列于表 1。培養(yǎng)結(jié)束后，記錄各種培養(yǎng)基上菌落數(shù)量。

表1 細(xì)菌的培養(yǎng)條件Table 1 Bacterial culture conditions

表2 冷吃兔生產(chǎn)車間菌落總數(shù)數(shù)量變化Table 2 Changes in the total number of colonies in the cold-eating rabbit production workshop

1.2.3 生產(chǎn)環(huán)境中細(xì)菌的分離純化

挑選菌落數(shù)量測定后菌落數(shù)量在 30～300的培養(yǎng)基，觀察菌落的顏色、大小、形態(tài)、邊緣結(jié)構(gòu)、隆起程度、光澤度及透明度等特征。挑選典型菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，并進(jìn)行劃線分離純化，至少進(jìn)行3次劃線，直至得到純化單菌落。挑取純菌落于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，加入終濃度為20%的甘油，-20 ℃保藏、備用。

1.2.4 細(xì)菌的分子鑒定

1.2.4.1 擴增與測序

取1 mL保藏的菌液轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，4 ℃，8000 r/min離心10 min，棄上清，獲得細(xì)菌菌體沉淀。采用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）提取純化菌株的DNA，以提取的DNA樣品作為模版，采用16S rDNA細(xì)菌通用引物27F：5’-AGT TTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCT TGTTACGACTT-3’為引物，PCR擴增反應(yīng)體系為25 μL：上下游引物各1 μL，模版2 μL，10 μL 2×Tap Master Mix，補ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性2 min，38 個循環(huán)（98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s），72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4.2 序列比對分析

將返回的16S rDNA基因測序結(jié)果通過美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫對各菌株進(jìn)行 Blast相似序列檢索，選取同源性高的菌株序列（≥99%），以確定細(xì)菌種類。

1.2.5 數(shù)據(jù)的處理

每組實驗均進(jìn)行 3次及以上平行測定，采用Microsoft Excel 2016、SPSS Statistics 22和 Oringin 2019對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、統(tǒng)計和制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 生產(chǎn)車間空氣微生物數(shù)量變化

利用自然沉降法對冷吃兔生產(chǎn)車間（輔料處理間、輔料儲存間、原料處理間、炒制間、冷卻間、內(nèi)包裝間）進(jìn)行微生物檢測，結(jié)果如表2所示。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 17093-1997《室內(nèi)空氣中細(xì)菌總數(shù)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[21]，對室內(nèi)空氣細(xì)菌總數(shù)做了限量規(guī)定，采用自然沉降法的標(biāo)準(zhǔn)值為≤45 CFU/皿。在一個生產(chǎn)周期內(nèi)，輔料處理間、輔料儲存間沉降細(xì)菌總數(shù)為1 CFU/皿且基本不變，原料處理間、炒制間、冷卻間、內(nèi)包裝間的微生物數(shù)量變化較大，原料處理間生產(chǎn)前（0 h）微生物沉降數(shù)目為2.5 CFU/皿，在生產(chǎn)1 h后達(dá)到22 CFU/皿，炒制間初始沉降數(shù)目為 2 CFU/皿，最高時為 7 CFU/皿，冷卻間和內(nèi)包裝間微生物數(shù)量在加工中保持低值，各車間細(xì)菌沉降總數(shù)均遠(yuǎn)小于≤45 CFU/皿，清潔程度高符合國家標(biāo)準(zhǔn)。人員的流動是車間微生物變化的重要原因，宰切原料時劇烈震動是原料處理間沉降菌數(shù)目變化的主要原因。

2.2 人員與生產(chǎn)器具細(xì)菌變化

在一個生產(chǎn)周期內(nèi)，對冷吃兔生產(chǎn)工序中與半成品、成品有接觸機會的各器具、設(shè)備和人員進(jìn)行微生物監(jiān)測，結(jié)果如表3所示。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)食品生產(chǎn)通用衛(wèi)生規(guī)范及相關(guān)衛(wèi)生操作程序，對生產(chǎn)過程中與食品接觸的接觸物表面菌落總數(shù)建議標(biāo)準(zhǔn)為：低于 50 CFU/cm2為極滿意水平，在50～104CFU/cm2之間為可接受水平，高于 104CFU/cm2為不可接受水平[22,23]。據(jù)此，在生產(chǎn)加工前各人員和加工器具表面菌落總數(shù)均大于 104CFU/cm2，經(jīng)過生產(chǎn)之前清洗殺菌步驟，與冷吃兔加工過程有接觸的宰切人員1、宰切人員2、預(yù)煮人員、腌制人員、炸制人員、炒制人員和瀝水網(wǎng)的表面微生物菌落總數(shù)分別為5.63 lg(CFU/cm2)、5.09 lg(CFU/cm2)、5.03 lg(CFU/cm2)、5.26 lg(CFU/cm2)、5.03 lg(CFU/cm2)、4.84 lg(CFU/cm2)、4.78 lg(CFU/cm2)，仍處于104CFU/cm2以上，疑似為冷吃兔成品中腐敗細(xì)菌的主要來源。生產(chǎn)前后，冷吃兔生產(chǎn)人員、設(shè)備與器具分別進(jìn)行消毒，能顯著降低接觸物表面細(xì)菌總數(shù)。在生產(chǎn)中，宰切、預(yù)煮、腌制人員手表面細(xì)菌總數(shù)均上升，炒制和炸制人員手表面細(xì)菌總數(shù)稍微下降，包裝人員手表面細(xì)菌總數(shù)保持穩(wěn)定，可能是宰切、預(yù)煮、腌制人員與原料兔肉接觸緊密，炒制和炸制人員生產(chǎn)環(huán)境高，包裝人員生產(chǎn)車間潔凈且經(jīng)過嚴(yán)格消毒環(huán)節(jié)。各生產(chǎn)器具接觸表面細(xì)菌呈上升趨勢，主要是原輔料接觸形成交叉污染；設(shè)備接觸表面細(xì)菌總數(shù)變化與加工溫度變化相關(guān)。孟靜[24]研究發(fā)現(xiàn)，在鴨肉制品生產(chǎn)過程中，車間空氣、解凍水及所用器具接觸面都是鴨肉制品潛在污染源，這與本研究結(jié)果一致。包裝人員、解剖刀、切刀、轉(zhuǎn)移器具、盛放容器和攤涼容器，在冷吃兔生產(chǎn)加工前執(zhí)行嚴(yán)格的清洗或消毒環(huán)節(jié)，表面細(xì)菌總數(shù)均小于 104CFU/cm2，符合清潔作業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。預(yù)煮機內(nèi)壁、鹵制機內(nèi)壁、炸制機內(nèi)壁和炒制機內(nèi)壁經(jīng)清洗消毒，且在加工過程中溫度維持 80 ℃以上，表面細(xì)菌得到良好控制，但其殘存的細(xì)菌具備耐高溫特點，極易成為冷吃兔腐敗細(xì)菌的污染源。加工過程中，操作人員手表面菌落總數(shù)平均最高，可能是在操作過程中與兔肉、兔血等直接接觸造成的，應(yīng)當(dāng)執(zhí)行嚴(yán)格的生產(chǎn)衛(wèi)生操作程序，并佩戴一次性手套，避免手與兔肉交叉污染。

表3 冷吃兔生產(chǎn)操作人員及器具菌落總數(shù)數(shù)量變化Table 3 Changes in total number of colonies of the production operators and utensils of cold-eating rabbits

2.3 細(xì)菌生理形態(tài)特征分析

通過4種選擇培養(yǎng)基對冷吃兔生產(chǎn)車間、人員以及各種加工設(shè)備的細(xì)菌進(jìn)行稀釋涂布篩選，至少3次平板劃線得到單菌落，共分離到59株菌，選取數(shù)量占比大的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)特征描述，見表4。

2.4 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜

對分離純化得到的細(xì)菌單菌落采用試劑盒提取DNA片段，并用通用引物27F/1492R進(jìn)行PCR擴增，通過 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取其中部分菌株電泳圖，如圖1所示。

如圖1所示，均得到大約1500 bp的PCR擴增片段，條帶明亮清晰，滿足后續(xù)測序要求，隨后送往北京擎科生物科技有限公司測序。

2.5 菌種鑒定結(jié)果

用ContigExpress拼接測序結(jié)果，并去除兩端不準(zhǔn)的部分，將拼接好的序列在 NCBI數(shù)據(jù)庫（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行比對，選取同源性最高的菌株序列，結(jié)果如表5、6、7所示。

2.5.1 生產(chǎn)車間空氣中細(xì)菌

通過對車間微生物進(jìn)行菌落總數(shù)測定，從瓊脂平板中篩選特征菌落，分離純化后送檢測序鑒定，結(jié)果如表5所示。輔料儲存與處理間相通，其空氣中菌落組成相同，主要有巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[25]、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[26]兩種菌構(gòu)成。從原料處理間空氣中共鑒定出5株菌，其中Z1、Z5屬于嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila）[27]，Z2屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[28]，Z3屬于法氏沃氏黃桿菌（Wautersiella falsenii）[29]，Z4屬于碘短桿菌（Brevibacterium iodinum）[30]，與酸乳生產(chǎn)車間空氣分離結(jié)果一致[31]。從冷吃兔炒制間空氣中共鑒定出6株菌，其中1株淺綠氣球菌（Aerococcus viridans）[32]，2 株（C5、C6）魯氏不動桿菌（Acinetobacter lwoffii）[33]，3株屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），C2被鑒定為科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii）[34]、C3與C4被鑒定為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）[35]，這與劉衛(wèi)德等的研究結(jié)果相似[36]。冷卻間與內(nèi)包間相通，篩選出2株菌，分別為N1解瓊膠爛泥桿菌（Macrococcus goetzii）[37]和弗氏志賀菌（Shigella flexneri）[38]。考克氏菌屬、不動桿菌屬、葡萄球菌屬普遍存在于肉制品生產(chǎn)車間空氣[24,39-41]。

表4 部分細(xì)菌的菌落特征與形態(tài)Table 4 Colony characteristics and morphology of some bacteria

表5 生產(chǎn)車間空氣中細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 5 Bacteria identification results in the air of the production workshop

表6 生產(chǎn)器具表面細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 6 Identification results of bacteria on the surface of production equipment

2.5.2 生產(chǎn)器具表面細(xì)菌

各生產(chǎn)器具表面細(xì)菌種類組成相似性，可能存在交叉污染，如表6所示，從生產(chǎn)器具表面共分離到17株菌，分布于10個屬，其中不動桿菌屬（Acinetobacter）6株，J2、J4為不動桿菌（Acinetobactersp.）[42]，J3、J10與J12為約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）[43]，J17為包氏不動桿菌（Acinetobacter bouvetii）[44]；2株假單胞菌屬（Pseudomonas），J5為假單胞菌（Pseudomonassp.）[45]、J14為莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）[46]；2株屬于沃氏菌屬（Wautersiella），J6 為沃氏菌（Wautersiellasp.），J7為法氏沃氏黃桿菌（Wautersiella falsenii）[29]；其余7株為別是：J1是菊微小桿菌（Exiguobacterium indicum）[47]、J8 廈門希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）[48]、J9殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）[49]、J11穆氏檸檬酸桿菌（Citrobacter murliniae）[50]、J13成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）[51]、J15溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus）[52]、J16棲冷克品沃爾氏菌（Kluyvera cryocrescens）[53]。主要菌屬為不動桿菌屬，與柴艷兵研究結(jié)果一致[31]，假單胞菌屬、氣單胞菌屬等常見于肉制品加工設(shè)備表面，也是冷卻肉的重要腐敗菌[54-55]。

表7 生產(chǎn)人員手表面細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 7 Identification results of bacteria on the hand surface of production personnel

2.5.3 生產(chǎn)人員手表面細(xì)菌

冷吃兔生產(chǎn)車間人員流動大，生產(chǎn)人員手表面細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)相似，從生產(chǎn)人員手表面共篩選出 29株菌，如表 7所示。其中 8株屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），R9、R16、R18、R20 與 R26 為約氏不動桿菌（Acinetobacter johnsonii）[43]，R12、R25為不動桿菌（Acinetobactersp.）[42]，R27為溶血不動桿菌（Acinetobacter haemolyticus）[56]；5株屬于氣單胞菌屬（Aeromonas），R10、R28為中間氣單胞菌（Aeromonas media）[57]，R3為豚鼠氣單胞菌（Aeromonas caviae）[58]，R6為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）[59]，R19為河流氣單胞菌（Aeromonas rivipollensis）[60]；4株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），R8為耐冷假單胞菌（Pseudomonas psychrotolerans）[61]，R11為喜昆蟲假單胞菌（Pseudomonas entomophila）[62]，R17為隆德假單胞菌（Pseudomonas lundensis）[63]，R22為副黃假單胞菌（Pseudomonas fulva）；3株微小桿菌屬（Exiguobacterium），R14為微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）[64]，R15、R24 為菊微小桿菌（Exiguobacterium indicum）[47]；2株屬于庫特氏菌（Kurthia）[65]，分別為 R7吉氏庫特氏菌（Kurthia gibsonii）[66]、R13 佐氏庫特氏菌（Kurthia zopfii）[67]；2株屬于沙雷氏菌屬（Serratia），分別為R2液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）[68]、R5食奎尼酸沙雷氏菌（Serratia quinivorans）[69]；其余分別為R1廈門希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）[49]、R4溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）[70]、R21非脫羧勒克氏菌（Leclercia adecarboxylata）[71]、R23腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）[72]、R29法氏沃氏黃桿菌（Wautersiella falsenii）[29]。其他研究表明[73-77]，葡萄球菌屬是操作人員手表面的主要微生物，與本文研究差異性較大，可能是由于冷吃兔生產(chǎn)加工人員在生產(chǎn)前消毒不徹底，且加工過程未佩戴手套，與加工器具、原料等交叉污染。

2.5.4 腐敗冷吃兔中的細(xì)菌

從腐敗終點樣品（25 ℃貯藏至產(chǎn)生氣泡、脹袋）共篩選16株菌，分屬于3個屬，11株（FB-1、FB-2、FB-4、FB-6、FB-7、FB-8、FB-9、FB-12、FB-14、FB-15、FB-16）表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）[78]、1株（FB-5）地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[79]、1株（FB-3）Rummeliibacillus stabekisii[80]、2 株（FB-10、FB-11）Bacillus paralicheniformis[81]、1 株（FB-13）蔬菜芽孢桿菌（Bacillus oleronius）[82]。

表8 腐敗冷吃兔中細(xì)菌鑒定結(jié)果Table 8 Bacteria identification results in spoilage Leng-Chi rabbit

2.6 腐敗細(xì)菌與生產(chǎn)環(huán)境細(xì)菌同源性分析

將從腐敗冷吃兔篩選得到的 16株腐敗菌和生產(chǎn)環(huán)境中細(xì)菌進(jìn)行多序列比對，采用 NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，去除低置信度分支，結(jié)果如圖2所示。樣品中葡萄球菌屬細(xì)菌與R4、C2和C3的同源性極高，說明了加工人員與炒制間空氣是葡萄球菌重要的污染源，表皮葡萄球菌是人體皮膚表面的正常菌群，可以推測可能是加工人員的操作和流動，引起了葡萄球菌屬細(xì)菌的污染。腐敗樣品中FB-5、FB-11和FB-13與原料處理間Z2處于一個分支，屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌，表明了原料處理間空氣是樣品中芽孢桿菌屬細(xì)菌的重要來源，可能是由于原料宰切劇烈，與人員、空氣形成交叉污染。由表5、6、7可知，從生產(chǎn)環(huán)境中分離出61株菌，分別屬于21個屬，其中16株為不動桿菌屬（Acinetobactersp.），6株屬于氣單胞菌屬（Aeromonassp.），6株屬于假單胞菌屬（Pseudomonassp.），4株屬于葡萄球菌屬（Staphylococcussp.），4株屬于沃氏菌屬（Wautersiellasp.），4株微小桿菌屬（Exiguobacteriumsp.），2株考克氏菌屬（Kocuriasp.），2株庫特氏菌屬（Kurthiasp.），2株屬于巨大球菌屬（Macrococcussp.），2 株希瓦氏菌（Shewanellasp.），2株沙雷氏菌（Serratiasp.），其余分別為氣球菌屬（Aerococcussp.）、檸檬酸桿菌屬（Citrobactersp.）、泛菌屬（Pantoeasp.）、克呂沃爾氏菌屬（Kluyverasp.）、志賀菌屬（Shigellasp.）、芽孢桿菌屬（Bacillussp.）、短桿菌屬（Brevibacteriumsp.）等。從冷吃兔生產(chǎn)環(huán)境的優(yōu)勢細(xì)菌以不動桿菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬、葡萄球菌屬、沃氏菌屬、微小桿菌屬為主。不動桿菌屬細(xì)菌廣泛存在肉制品加工環(huán)境中，屬于非發(fā)酵條件致病菌，是許多肉及其肉制品的重要腐敗菌[83-86]。假單胞菌屬是肉制品、乳制品、水產(chǎn)品等常見腐敗菌[87-89]，也是肉制品中常見的嗜冷腐敗菌[90]。

3 結(jié)論

3.1 通過對生產(chǎn)加工環(huán)境中微生物進(jìn)行檢測，分析生產(chǎn)車間空氣、生產(chǎn)人員手以及與產(chǎn)品直接接觸的設(shè)備器具表面微生物數(shù)量，篩選分離出主要細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)冷吃兔輔料處理間、輔料儲存間、炒制間、冷卻間、內(nèi)包裝間的菌落總數(shù)在生產(chǎn)過程中變化較小，原料處理間受人員操作影響變化較大。因此，認(rèn)為冷吃兔加工設(shè)備器具表面和人員手部是冷吃兔產(chǎn)品潛在的污染來源。建議在生產(chǎn)之前嚴(yán)格要求生產(chǎn)人員做好消毒步驟，正確佩戴無菌工作服、工作帽與手套，嚴(yán)格做到生產(chǎn)前后對生產(chǎn)設(shè)備器具清洗、殺毒、滅菌。從分離結(jié)果來看，從生產(chǎn)環(huán)境中共分離出61株菌，分別屬于21個屬，其中生產(chǎn)車間空氣、生產(chǎn)人員、設(shè)備與器具均檢出不動桿菌屬細(xì)菌，表明不動桿菌屬在冷吃兔生產(chǎn)環(huán)境中分布廣泛，其次為氣單胞菌屬、假單胞菌屬和葡萄球菌屬。真空包裝冷吃兔腐敗樣品中芽孢桿菌屬細(xì)菌主要來源于各生產(chǎn)車間空氣微生物，葡萄球菌屬細(xì)菌主要來源于炒制人員以及炒制間空氣微生物。

3.2 本研究確定生產(chǎn)環(huán)境中細(xì)菌的主要種屬，建立潛在污染細(xì)菌庫，為完善溯源系統(tǒng)和HACCP體系提供了理論基礎(chǔ)。為健全體系，還需探明原輔料中的食源性致病細(xì)菌、原料庫房的最優(yōu)儲存條件、最優(yōu)防腐工藝和殺菌工藝，來提高自貢冷吃兔的食用安全性，為傳統(tǒng)的冷吃兔生產(chǎn)提供保障。