錢雄鋒，羅怡，張岳玥，李響，魯子銘，劉夢月，梁東武

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530000）

微生物活動是造成食品腐敗的重要原因之一，每年可導致世界四分之一的食物腐敗損失；其中，捕撈后的魚類約有 30%因為微生物腐敗變質(zhì)而喪失食用價值[1]。嗜冷微生物是水產(chǎn)品中常見的腐敗微生物，其生長繁殖常常加速水產(chǎn)品在冷鏈儲運中的品質(zhì)下降。研究表明，冷藏淡水魚類的優(yōu)勢腐敗菌主要是假單胞菌屬細菌[2]，如熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。P. fluorescens是一種革蘭氏陰性菌，是較典型的嗜冷菌，在冷藏水產(chǎn)品常見。P. fluorescens能產(chǎn)生脂肪酸酶，可導致水產(chǎn)品的脂肪氧化酸敗和變質(zhì)。此外，P.fluorescens也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌，常常粘附在魚類體表形成生物被膜，通過生理代謝、基因表達和蛋白質(zhì)表達的改變，以及降低代謝率和細胞分裂率來適應缺氧、營養(yǎng)或抗生素等環(huán)境限制[3,4]。

植物精油是芳香植物合成的次級代謝產(chǎn)物，主要由萜烯化合物、酸、醇、酯、醛、酮等芳香化合物成分組成。目前研究表明，植物精油具有廣泛的抗菌和抗氧化特性，可通過提高細菌細胞內(nèi)外滲透壓差來破壞細胞壁和細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，從而進一步影響脂肪酸、多糖和磷脂雙分子層的構(gòu)象，實現(xiàn)抑制細菌生長繁殖、抑制細菌生物被膜和毒力因子形成等[5]。植物精油來源廣泛，作為抗菌劑是目前抗菌材料研究的熱點和發(fā)展趨勢[6-7]。

乙醛（Acetaldehyde）是近年來研究較多的天然植物精油抗菌劑之一，研究人員已經(jīng)證明己醛是一種抗菌化合物[8]。研究發(fā)現(xiàn)，己醛能夠破壞細胞膜形成和線粒體功能并誘導黃曲霉等真菌凋亡[9]。除了抗菌特性外，乙醛還能阻斷超氧化物歧化酶（SOD）的活性[10]。在適當濃度下乙醛具有青草味，對中國對蝦的整體香氣影響很小，不會改變蝦肉的味道[11]。乙醛在抑制P. fluorescens的生長繁殖尤其是其生物被膜的形成方面的作用逐漸引起了研究者們的關(guān)注。例如，乙醛抑制白色念珠菌中酵母菌向菌絲的轉(zhuǎn)化和生物被膜形成[12]。

大量的研究都表明了乙醛的良好抑菌性，但有關(guān)乙醛抑制P. fluorescens的機理研究尚少。因此，本實驗首先通過測定乙醛的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，制定抑菌生長曲線，評價乙醛對P. fluorescens的抑菌能力；其次，通過P. fluorescens電導率、胞外總蛋白含量和胞內(nèi)Na+K+-ATP酶活性的測定、生物被膜的觀察和二乙酸熒光素染色實驗，深入分析乙醛對P.fluorescens細胞膜完整性、生物被膜的影響，闡明乙醛對P. fluorescens的抑菌機理，為水產(chǎn)品保鮮技術(shù)研究及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

（1）菌種：熒光假單胞菌（P. fluorescens）來源于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，于28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)。

（2）試劑：乙醛（純度 97%）購于上海麥克林生化科技有限公司；信號分子 C6-HSL來源于美國Sigma公司；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）購于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；ATP酶（Na+K+）測試盒購于齊一生物科技（上海）有限公司。

1.2 主要儀器設備

FA系列多功能電子天平，上海力辰儀器科技有限公司；XFS-40M電熱式壓力蒸汽滅菌器，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；BPMJ恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2F超凈臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Agilent 8453紫外-可見光分光光度計，安捷倫科技有限公司；infinite M200 PRO酶標儀，廣西南寧市博美生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

參考 Yang等[13]的方法略作修改，測定乙醛對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度。吸取培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液100 μL加到96孔細胞培養(yǎng)板中，再將溶于50%乙醇的乙醛溶液加入到上述孔中，使乙醛的終濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 和0.125 μL/mL。以等體積的乙醇（50%）為陰性對照，8 μL卡那霉素（濃度為20 μL/mL）為陽性對照。將96孔細胞培養(yǎng)板放在28 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，并使用酶標儀測定OD595nm值。通過對OD595nm測定值比較，選擇與陽性對照無明顯差異的乙醛濃度作為乙醛對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度。

將96孔細胞培養(yǎng)板中清澈的菌液吸取100 μL用PBS稀釋，菌懸液按0.5、1、2 μL/mL接種至無菌的TSA平板均勻涂布后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以平板上無肉眼可見細菌生長的乙醛濃度為乙醛對熒光假單胞菌的最小殺抑菌濃度（MBC）。

1.3.2 生長曲線的測定

吸取100 μL培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液于10 mL TSB培養(yǎng)基中，加入乙醛使其終濃度分別為1×MIC、2×MIC、4×MIC，以無菌去離子水作為空白對照。在 28 ℃生化培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 h，用酶標儀測定595 nm處的吸光值（A）。

1.3.3 乙醛對細菌細胞膜完整性的影響

根據(jù)盧群等[14]二乙酸熒光素（Fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）染色方法略作修改。取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的熒光假單胞菌菌液，離心去上清并用PBS重懸菌體，加入乙醛使其終濃度為 1×MIC、2×MIC、4×MIC，以無菌去離子水做空白對照，于搖床培養(yǎng)。分別取培養(yǎng)3、6、9、12 h的菌懸液各5 mL以8000×g離心10 min，去除上清液，留下的菌體用PBS重懸3次，離心后去除上清液，加入250 μL溶于丙酮的二乙酸熒光素（2 mg/mL），常溫下靜置15 min，PBS重懸洗滌三次，離心棄上清液PBS重懸。使用熒光分光光度測定平均熒光強度（激發(fā)波長為297 nm，發(fā)射波長為527 nm，激發(fā)狹縫與發(fā)射狹縫為5 nm）。

1.3.4 電導率分析

取過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期的熒光假單胞菌液，8000×g離心10 min，去除上清液，留菌體后用PBS重懸菌體，再以8000×g離心10 min，重復兩次。最終菌體重懸于磷酸鹽緩沖液，用酶標儀測定OD595nm值，調(diào)平其吸光度值。加入溶于乙醇的乙醛，使其終濃度分別為1×MIC、2×MIC、4×MIC，以無菌去離子水作為空白對照。于搖床中培養(yǎng)12 h，期間每2 h取樣測電導率。

1.3.5 膜電位的測定

根據(jù)Zhang等[15]的熒光染色法（“羅丹明123”）適當修改。細菌的膜電位（MP）的大小可反映細胞的能量代謝活性，為了研究乙醛對熒光假單胞菌代謝活性變化的影響，將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液中分別加入1×MIC、2×MIC和4×MIC濃度的乙醛，以50%乙醇為空白對照，于28 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)3 h。離心后收集菌體，再用PBS洗滌2次后并溶解。將羅丹明123加入PBS中配置成1 mg/mL母液，加入菌液中使其終濃度為2 μg/mL，在黑暗中靜置30 min后，將樣品洗滌3次并重懸于PBS中，用熒光分光光度計測定平均熒光強度（激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為530 nm）。

1.3.6 乙醛對熒光假單胞菌細胞蛋白含量的影響

將P. fluorescens培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL），吸取上清留下層菌體，加入PBS中重復離心，重懸洗滌兩次，再加入乙醛使其終濃度為1×MIC、2×MIC，以無菌去離子水做空白對照，于搖床中28 ℃培養(yǎng)。分別取0、3、6、9、12 h的10 mL菌懸液離心去上清留菌體，加入PBS。用超聲波細胞粉碎機在300 W功率下冰水浴中破碎菌體，每次超聲時間為5 s，間隔3 s，重復三次并于4 ℃保存。采用總蛋白定量測定試劑盒中的 BCA法得到各組樣品的蛋白濃度，并用紫外-可見光分光光度計于562 nm下測定其吸光度值。

1.3.7 乙醛對Na+K+-ATP 酶活力的影響

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期（107CFU/mL）的熒光假單胞菌菌液，去除上清并于菌體中加入PBS，重懸兩次后置于生理鹽水中，加入終濃度分別為 1×MIC和2×MIC的乙醛，以無菌去離子水做空白對照，放在28 ℃搖床中培養(yǎng)12 h。期間分別取0、3、6、9、12 h菌懸液樣品，離心去除上清液加入PBS重懸三次，用超聲破碎儀破碎細胞。采用超微量Na+K+-ATP酶試劑盒測定熒光假單胞菌內(nèi)Na+K+-ATP酶含量，用紫外-可見光分光光度計于636 nm下測定其吸光度。

1.3.8 乙醛對熒光假單胞菌生物被膜的影響

1.3.8.1 乙醛對熒光假單胞菌生物被膜形成量的影響

參考Lee等[16]的方法并稍加修改。將培養(yǎng)至對數(shù)期的熒光假單胞菌以體積比為1:1000接種于TSB肉湯，加入終濃度為0.016、0.031、0.062、0.125和0.25 μL/mL的乙醛，分別以體積分數(shù)50%的乙醇和信號分子C6-HSL為陰性和陽性對照。取200 μL混合菌液加入96孔板，放入28 ℃生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，然后取出菌液測定菌液密度（波長595 nm）；棄去菌液，用無菌水清洗96孔板3～5次，用無菌風干燥30 min，使生物被膜固定在96孔板內(nèi)壁，同時取200 μL 0.1%（ρ）結(jié)晶紫對其染色15 min。棄去染色液，再用無菌水清洗3～5次至干凈透明，用33%冰乙酸溶解殘留的染色液。用酶標儀測定波長595 nm下溶解液的吸光度，每處理組取3個重復去平均值。生物被膜的相對形成量計算公式如下：

式中：

OD595nm——處理組指乙醛處理后測得的生物被膜；

OD595nm——陰性對照組指添加體積分數(shù)50%的乙醇后測得的生物被膜。

1.3.8.2 乙醛對熒光假單胞菌生物被膜的影響

參考Li等[17]的方法并稍加修改。將鋅片用砂紙除去表面的氧化層，用剪到裁成10 mm×10 mm大小的正方形，置于無水乙醇和去離子水中先、后超聲 30 min，烘干后滅菌備用。后續(xù)操作與酶標儀法測生物被膜形成量相同。培養(yǎng)后取出鋅片用PBS沖洗去除浮游細菌，沖洗3～5次后置于4 ℃預冷的2.5%戊二醛溶液中浸泡4 h，再用50%、70%、90%乙醇進行梯度洗脫，100%無水乙醇脫水2次，乙酸異戊酯置換2次。干燥后進行噴金處理，利用掃描電子顯微鏡來觀察生物被膜的形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)方差分析，顯著性水平p＜0.05。所有樣品均進行3次重復，實驗結(jié)果以“平均值±標準差”顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醛對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）

采用微量稀釋法測定不同濃度乙醛對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），評估其抑菌效果。如圖1所示，不同濃度的乙醛對熒光假單胞菌均有抑制作用，并隨著乙醛濃度增加，其抑菌作用增大。對培養(yǎng)至對數(shù)期的熒光假單胞菌采用0.5 μL/mL的乙醛處理后，菌液密度低于等體積的卡那霉素陽性對照，表明乙醛對熒光假單胞菌的最小抑菌濃度為 0.5 μL/mL。此外，乙醛對熒光單胞菌的最小殺菌濃度為1 μL/mL。與Zhang等[18]研究的沒食子酸對P. fluorescens的抗菌功效相比，乙醛對P.fluorescens具有較好的抑菌效果。

2.2 乙醛對熒光假單胞菌增殖速度的影響

乙醛對熒光假單胞菌增殖速度的影響可說明乙醛對熒光假單胞菌的抑菌能力。從圖2熒光假單胞菌的增殖曲線可知，培養(yǎng)6 h后P. fluorescens達到對數(shù)生長后期，12 h后達到平臺期。與空白對照相比，經(jīng)過濃度分別為1×MIC、2×MIC、4×MIC的乙醛處理后，熒光假單胞菌的生長和繁殖均被顯著抑制。何學文等[19]研究發(fā)現(xiàn)1×MIC和2×MIC濃度的肉桂醛在沙門氏菌生長前期增殖有抑制作用，隨著培養(yǎng)時間增加，抑制作用降低；4×MIC濃度的肉桂醛能完全抑制沙門氏菌的增殖?？梢姡S著培養(yǎng)時間的增加，不同濃度的乙醛對熒光假單胞菌的抑菌能力與其它抑菌劑相比較穩(wěn)定，至少在24 h內(nèi)抑制熒光假單胞菌的增殖。

2.3 乙醛對熒光假單胞菌細胞膜結(jié)構(gòu)完整性的影響

當熒光假單胞菌細胞膜被破壞時可引起熒光的泄漏，并引起二乙酸熒光素（FDA）的熒光強度降低，因此可以用 FDA的熒光強度來表征細胞膜完整性。圖3顯示，不同濃度乙醛處理3 h后，各組的熒光強度與空白對照相近，均為190 AU左右，無顯著性差異（p＞0.05），表明此時細胞膜結(jié)構(gòu)仍然保持完整。乙醛處理6 h、9 h或12 h，F(xiàn)DA熒光強度均有下降，其中4×MIC乙醛在12 h處理FDA降至81 AU，此時樣品下降幅度最大，而不同處理時間空白對照組 FDA熒光強度幾乎不變。由此可見，隨著乙醛濃度的增加，處理時間延長，細胞膜結(jié)構(gòu)受破壞程度越大，這與Wang等[20]的研究相符。

2.4 電導率的變化

細菌細胞膜的電導率的大小與細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性呈正相關(guān)關(guān)系。當細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性被破壞時，其通透性增加，可引起胞內(nèi)K+、Na+、H+等離子經(jīng)細胞膜外泄，進而影響細菌的正常的運動、代謝以及溶質(zhì)轉(zhuǎn)運等[21]生理活動。從圖3可知乙醛處理后熒光假單胞菌細胞膜結(jié)構(gòu)受損，因此，在此基礎(chǔ)上結(jié)合電導率的測得，可以進一步分析乙醛對熒光假單胞菌細胞膜結(jié)構(gòu)的影響。圖4顯示，不同濃度乙醛處理（8 h）內(nèi)均導致熒光假單胞菌細胞膜電導率快速增大，且顯著大于空白對照組；細胞膜電導率增幅隨著乙醛濃度的增加而增大（4×MIC乙醛處理樣品電導率增幅最大），表明乙醛可影響熒光假單胞菌的細胞膜通透性，引起胞內(nèi)離子的外泄。乙醛處理8 h至12 h期間，各樣品電導率變化均趨于平緩，可能與此階段熒光假單胞菌的溶解與死亡有關(guān)。楊勝平等[22]研究牛至精油處理后P. fluorescens培養(yǎng)液電導率上升，細菌失去了原有的細胞形態(tài)，說明牛至精油處理破壞了P.fluorescens細胞膜完整性，使細胞內(nèi)容物泄露，降低了P. fluorescens對細胞膜流動性的調(diào)控能力。

2.5 乙醛對熒光假單胞菌膜電位的影響

膜電位反映細菌細胞代謝活力，作為質(zhì)子動力勢的一部分參與腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的合成[23]。而細胞膜電位的變化可引起熒光光強度變化，因此，可以用熒光強度表征膜電位的變化。如圖5所示，當乙醛濃度為1×MIC時，熒光假單胞菌菌液的平均熒光強度從空白對照的72 AU下降至35.57 AU，隨著乙醛濃度增加，平均熒光強度進一步下降，濃度越大平均熒光強度下降程度越大。舒慧珍等[24]研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌的膜電位下降后,促使細胞代謝失常和去極化。由此可見，乙醛處理降低了熒光假單胞菌的膜電位，可能降低細菌的代謝活力。

2.6 乙醛對熒光假單胞菌細胞蛋白含量的影響

蛋白質(zhì)是生命的重要基礎(chǔ)，蛋白質(zhì)的變化可直接影響細胞的生物活性[25]。如圖6所示，與空白對照組蛋白質(zhì)含量則隨著時間延長而緩慢增加的趨勢不同，不同濃度的乙醛處理（1×MIC、2×MIC和4×MIC）3 h內(nèi)均導致胞內(nèi)蛋白質(zhì)的含量迅速下降，分別下降至0.40、0.35和0.34 mg/mL；乙醛處理3～12 h期間蛋白質(zhì)含量變化呈現(xiàn)平緩、略有下降，其中1×MIC處理后蛋白含量為0.31 mg/mL，2×MIC和4×MIC處理組的蛋白質(zhì)含量變化趨勢基本一致。熒光假單胞菌細胞蛋白質(zhì)的變化與細胞能量代謝等重要生命活動密切相關(guān)，乙醛處理可降低熒光假單胞菌細胞蛋白質(zhì)的含量，影響蛋白質(zhì)的代謝。Shen等[26]研究表明肉桂醛會破壞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，從而影響細胞的生長與代謝，影響了細胞膜的完整性，與本研究結(jié)果相同。

2.7 乙醛對熒光假單胞菌內(nèi) Na+K+-ATP酶活力的影響

腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的合成和分解代謝是細胞維持穩(wěn)態(tài)的重要機制，而Na+K+-ATP酶作為一種位于細胞質(zhì)膜磷脂雙分子層中的蛋白酶，它參與了為細胞代謝直接提供能量的ATP的水解催化過程，在細胞物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)化、膜電位調(diào)節(jié)及信息傳遞等方面均具有重要作用[27,28]。如圖7所示，空白對照組樣品在培養(yǎng)時間內(nèi)胞內(nèi) Na+K+-ATP酶活力呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢，其中活力增強可能是由于前6 h內(nèi)熒光假單胞菌增殖的結(jié)果；而1×MIC、2×MIC乙醛處理6 h菌內(nèi)ATP酶活力降至31.36和28.12 U/mg，隨著培養(yǎng)時間延長Na+K+-ATP酶的活力逐漸下降，12 h降至26.33和22.17 U/mg。Zhang等[29]研究了迷迭香酸會顯著降低大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌胞內(nèi)三磷酸腺苷的釋放。因此，可推測乙醛降低Na+K+-ATP酶活性后胞內(nèi)ATP代謝異常，不能正常為細胞活動供給能量，導致熒光假單胞菌的凋亡。

2.8 乙醛對熒光假單胞菌生物被膜的影響

2.8.1 乙醛對熒光假單胞菌生物被膜形成率的影響

如圖8所示，當乙醛濃度為0.016 μL/mL時，其熒光假單胞菌生物被膜相對形成率為91.20%；而當乙醛濃度為0.25 μL/mL時，其生物被膜相對形成率下降至30.11%；與未加處理對照組相比，不同濃度的乙醛均能抑制熒光假單胞菌生物被膜的形成；而添加外源C6-HSL信號分子可促進該菌生物被膜的形成。信號分子是細菌生物被膜形成的關(guān)鍵影響因素，這提示我們，乙醛有可能通過對信號分子的干擾，進而抑制生物被膜的形成，與 Ahmad等[30]的研究結(jié)果相符合。Topa等[31]研究表明亞抑菌濃度肉桂醛對銅綠假單胞菌的生長不產(chǎn)生影響，破壞了銅綠假單胞菌種間信息交流過程中預先形成的生物被膜；當肉桂醛的濃度為0.5×MIC時，生物被膜的形成率僅為24.40%，抑制率達到 75.60%。因此，可以推測乙醛可以影響P.fluorescens生物被膜的結(jié)構(gòu)，對細菌的擴散式增殖進行抑制。

2.8.2 乙醛對熒光假單胞菌生物被膜的影響

生物被膜的功能與其結(jié)構(gòu)密不可分，通過干擾熒光假單胞菌的聚集能減少細菌增殖[32]。本研究利用掃描電子顯微鏡觀察乙醛處理對P. fluorescens生物被膜結(jié)構(gòu)的影響。由圖9a顯示，相比于陰性對照組，添加信號分子C6-HSL后鋅片表面形成的生物被膜濃厚且致密，這表明P. fluorescens生物被膜的形成可能受到信號分子的調(diào)控。圖9c～9f經(jīng)過不同乙醛濃度處理，細菌數(shù)量隨著乙醛濃度的增加而顯著減少，且菌體呈現(xiàn)出無規(guī)則排列分布狀態(tài)，無法形成聚集的細菌團簇，而且粘附在鋅片表面的細菌數(shù)量也明顯減少，與王碩等[33]的研究結(jié)果相符合。綦國紅等[34]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛在低于MIC濃度下，通過光學顯微鏡進行觀察發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌生物被膜的形成具有抑制作用。因此，推測乙醛可能通過干擾熒光假單胞菌的聚集來減少生物被膜的形成。

3 結(jié)論

本文深入研究乙醛對熒光假單胞菌的抑菌活性及機理，驗證了乙醛在亞抑菌濃度下是具有抑制生物被膜特性。研究發(fā)現(xiàn)，乙醛對熒光假單胞菌的生長于繁殖具有較強的抑制作用，在24 h內(nèi)抑制熒光假單胞菌的增殖。乙醛可通過破壞熒光假單胞菌細胞膜的完整性，增加膜的通透性和電導率，降低胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量和抑制ATP分解代謝相關(guān)酶活性，全面破壞熒光假單胞菌的生命物質(zhì)基礎(chǔ)、正常生理活動及能量代謝。此外，乙醛能夠在低于1×MIC濃度下有效抑制熒光假單胞菌生物被膜形成過程及形態(tài)，可能與熒光假單胞菌分泌的群體感應信號分子有關(guān)，具體機理有待進一步通過轉(zhuǎn)錄組學、分子對接等手段研究探明。