魏婉晴，孔梁宇，胡瑞瑞，陸兆新，周立邦，孟凡強，別小妹

（南京農業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

大腸桿菌（Escherichia coli）是一種條件致病菌，在一定條件下可以引起人和多種動物發(fā)生胃腸道或尿道等多種局部組織器官感染。腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE. coli，EHEC）是大腸桿菌的一個亞型，以O157:H7血清型為代表菌株[1]。感染大腸桿菌O157:H7可導致廣泛的臨床表現，包括無癥狀感染、輕度腹瀉或嚴重疾病，如出血性結腸炎和溶血尿毒癥綜合征等[2-4]。食品和水源中的該病原體的監(jiān)測是一個重要的公共衛(wèi)生問題[5,6]。目前檢測大腸桿菌O157:H7主要依據國標GB 4789.36-2016[7]，雖準確性高、結果可靠，但步驟繁瑣、實驗周期長、難以達到快速檢測目的。而且大腸桿菌O157:H7的最小感染劑量非常低[8]，因此更需要建立具有高靈敏度的、簡單快速且可靠的檢測方法。

使用飽和熒光染料的實時熒光定量 PCR（Quantitative real-time PCR，RT-PCR）可以通過實時監(jiān)測染料和雙鏈DNA結合后發(fā)出熒光信號的改變獲得高分辨熔解曲線（High-resolution melting curves，HRM）[9,10]，通過熔解溫度（Melting temperature, Tm）區(qū)分不同的靶基因[11,12]，同時還可以利用標準曲線對未知模板進行定量分析，具有高通量、高靈敏度、特異性強等特點[13,14]，廣泛應用于食品、生物學、臨床醫(yī)學等領域[15-18]。

同時，在實際檢測中，死菌的存在有可能會導致假陽性檢測結果，在外界應激條件下細菌有可能進入一種可存活但不可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)，在這種狀態(tài)下，細菌可以長時間存活并保持潛在毒性[19]，因此，對食品樣品中致病菌活菌部分的定量區(qū)分是非常關鍵的。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）是對核酸具有高度結合能力的光敏染料，能夠穿透死亡細胞/膜損傷細胞的細胞膜插入核酸，在強光照射下與DNA 形成穩(wěn)定的共價碳氮鍵，不可逆地修飾DNA，從而阻止死菌細胞DNA 進行PCR擴增[20,21]。PMAxx是PMA的升級版，作用方式與PMA相同，可以使活菌與死菌之間的擴增差異增加 3～7個Ct值，在區(qū)分活菌和死菌方面更有效。

本研究旨在組建新型大腸桿菌 O157:H7 HRM-RT-PCR快速檢測試劑盒，探討試劑盒的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性及抗干擾能力，并通過人工污染樣品試驗探究試劑盒的實際應用能力。通過單因素變化試驗對PMAxx處理體系中的曝光時間、暗孵育時間、PMAxx濃度進行優(yōu)化，最后將PMAxx處理體系與HRM-RT-PCR檢測試劑盒相結合，進一步構建能夠有效地定量大腸桿菌O157: H7活菌的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與試劑

實驗菌株共計27株，其中大腸桿菌9株，包括7株 O157:H7血清型（其中 2 株為標準菌株 ATCC 43889、CICC 21530，5株為實驗室自篩菌株，分別為P247、P248、P254、P255、P256），2 株非 O157:H7 血清型（ATCC HG15、ATCC 18683）。非大腸桿菌18株，其中有腸炎沙門菌（CICC21482）、鼠傷寒沙門氏菌（CICC 21483）、阪崎克羅諾桿菌（CICC 21563、CICC 21560）、藤黃微球菌（CMCC 28001）、奇異變形桿菌（CMCC 49005）、短小芽孢桿菌（CMCC 63202）、蠟樣芽孢桿菌（CMCC 63301、CCTCC AB 204038、CCTCC AB 2010134）、單增李斯特菌（CICC 21662、CICC 21633）、金黃色葡萄球菌（CICC 26074、CICC 22942）、熒光假單胞菌（CICC 21620、ASI.55）、副溶血性弧菌（CICC 17802、CICC 21528），以上菌株分別購自美國模式微生物保藏中心、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心、中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心、中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

主要試劑：TaKaRa Ex Taq? Hot Start Version，寶生物工程（大連）有限公司；SYTOTM9綠色熒光核酸染料，Molecular Probes公司；Omega細菌DNA提取試劑盒，Archimedes公司；PMAxxTMdye，Biotium公司。

1.1.2 主要儀器設備

T1300Ⅱ級生物安全柜、實時熒光定量 PCR儀，賽默飛世爾科技公司；Centrifuge 5418R微量離心機，Eppendorf公司；Nanodrop-2000核酸濃度測定儀，基因有限公司；500 W鹵素燈，衢州市柯城華源電子商行。

1.1.3 引物

本研究所用引物如表1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1 HRM-RT-PCR試劑盒反應體系及程序

大腸桿菌O157:H7 HRM-RT-PCR試劑盒反應體系見表2，反應體系擴增程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性 30 s、60 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s，循環(huán)數為30，熔解曲線升溫速度0.1 ℃/s。

表1 實時熒光定量PCR體系引物序列及參數Table 1 Sequences and parameters of the primers of the HRM-RT-PCR system

表2 實時熒光定量PCR反應體系（20 μL/Test）Table 2 The reaction system for HRM-RT-PCR (20 μL/Test)

1.2.2 試劑盒的組裝

商品化試劑盒應盡可能把各種反應物一次性添加、分裝，確保試劑盒的準確與簡便。將兩對引物、10×Ex Taq Buffer、dNTP Mix混合為HRM-RT-PCR反應預混液。Ex Taq HS酶、SYTOTM9綠色熒光核酸染料分別-20 ℃單獨保存。試劑盒的具體組成如表3所示。

表3 實時熒光定量PCR試劑盒組成（48 T）Table 3 Components of the HRM-RT-PCR kit (48 Tests)

1.2.3 靈敏度試驗

將大腸桿菌O157:H7標準菌株菌懸液按照10倍倍比稀釋，提取基因組，使用本研究組建的HRM-RT-PCR試劑盒進行檢測，獲得試劑盒的最低檢測限。

1.2.4 特異性評價試驗

煮沸法提取金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等常見食源性致病菌基因組，應用試劑盒進行各菌種特異性驗證。

1.2.5 試劑盒穩(wěn)定性評價

1.2.5.1 重復性試驗

為驗證試劑盒在檢測同一目標模板時的重復性以及檢測低濃度模板時擴增是否穩(wěn)定，選取中、低濃度的大腸桿菌O157:H7菌液、基因組模板，分別使用試劑盒對同一濃度的陽性核酸樣本進行10次平行擴增。分析比較各重復間Ct值的差異情況，對擴增體系的重復性進行評價。

1.2.5.2 反復凍融試驗

試劑盒中的酶、飽和熒光染料、引物等需要保存在-20 ℃低溫環(huán)境，生化試劑容易受環(huán)境溫度變化的影響，因此反復凍融容易使試劑盒失效，造成假陰性結果。將保存在-20 ℃試劑盒中的試劑取出，置于室溫至液體融化后再置于-20 ℃，如此反復凍融50次，每反復凍融5次用同一份標準陽性模板進行檢測，驗證試劑盒的穩(wěn)定性。

1.2.5.3 模擬運輸環(huán)境試驗

模擬運輸條件下溫度變化對試劑盒穩(wěn)定性的影響，首先將試劑盒在-20 ℃儲存5 d，模擬冷鏈運輸，然后將試劑盒儲存在放置有冰袋的泡沫盒中，每隔12 h更換冰袋，每隔4 h測溫，模擬人工運輸。每12 h應用試劑盒檢測同一份基因組模板，共計檢測3 d，根據Ct值變化判斷運輸環(huán)境對試劑盒的影響。

1.2.6 抗干擾試驗

選取大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889作為目標菌，副溶血性弧菌ATCC 17802、金黃色葡萄球菌CICC 26074、單增李斯特菌CICC 21662、蠟樣芽孢桿菌CCTCC AB 204038作為干擾菌。二次活化培養(yǎng)后進行平板菌落計數。將四種干擾菌按照10倍倍比稀釋9個梯度，1:1:1:1混合得到9組混合菌液，同時將目標菌稀釋至3×103CFU/mL，與不同濃度梯度的混合菌液進行1:1混合，采用水煮法提取混合菌液基因組，試劑盒檢測后觀測其對應的Ct值及Tm值差異，判斷試劑盒在四種常見食源性致病菌干擾下對大腸桿菌O157:H7的檢測能力。

1.2.7 人工污染試驗

使用大腸桿菌O157:H7污染食品樣品，驗證試劑盒的實際應用能力。取新鮮無菌牛奶4 mL 6份、生鮮牛肉10 g 6份，各取1份經GB 4789.36-2016驗證無大腸桿菌O157:H7污染后，將已知初始濃度的大腸桿菌O157:H7用無菌生理鹽水以10倍倍比進行稀釋，獲得濃度分別為7.97×105CFU/mL～7.97×101CFU/mL的5份菌液，將每份菌液取1 mL分別添加到準備好的牛奶及牛肉樣品中，均質后獲得人工污染食品樣品，取1 mL人工污染牛奶樣品于1.5 mL離心管中，12000 r/min離心10 min[22]，棄上清、留下底部沉淀物，分別將牛奶樣品沉淀物、牛肉污染樣品轉置到有9 mL mEC+n肉湯的均質袋中[7]，在拍擊式均質器上連續(xù)均質1 min～2 min，菌濃度稀釋10倍，37 ℃增菌培養(yǎng)0 h、6 h、8 h后，分別取1 mL菌液提取基因組并采用試劑盒進行檢測，通過分析擴增曲線判斷實驗結果。

1.2.8 PMAxx處理條件優(yōu)化

1.2.8.1 細菌培養(yǎng)及熱滅活菌的制備

將大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889培養(yǎng)至細胞懸液OD600≈1.0。吸取處于對數期的細菌培養(yǎng)液于離心管中，100 ℃水浴10 min，獲得熱滅活菌細胞懸液[23]。將10 μL的熱滅活細胞懸液置于TSA培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h后觀察是否有菌落長出。

1.2.8.2 曝光時間優(yōu)化

取500 μL活菌菌懸液及熱滅活菌菌懸液各7份，1份活菌菌懸液和熱滅活菌菌懸液為1組，向其中6組菌懸液中分別添加PMAxx充分混勻，使其終濃度為25 μmol/L。室溫避光孵育10 min后，將樣品置于冰上，在距光源20 cm、500 W鹵素燈下，分別均勻曝光0、5、7、9、11、13 min后，12000 r/min離心5 min，PBS清洗三次，所得沉淀加入100 μL無菌蒸餾水混勻，100 ℃煮沸10 min，4 ℃冷卻5 min，12000 r/min離心3 min，上清用作DNA模板。未經PMAxx處理的1組為對照組。最后進行HRM-RT-PCR試劑盒檢測，探究最優(yōu)曝光時間。

1.2.8.3 暗孵育時間優(yōu)化

前處理工作同1.2.8.2。蓋上鋁箔紙置于搖床暗孵育不同時間（分別為0、5、10、15、20、25 min）。樣品置于冰上、鹵素燈下曝光11 min，DNA提取步驟同1.2.8.2。未經PMAxx處理組為對照組。試劑盒擴增后探究最佳暗孵育時間。

1.2.8.4 PMAxx濃度的優(yōu)化

取6組500 μL活菌菌懸液和熱滅活菌菌懸液，向其中分別添加不同濃度的PMAxx使其終濃度分別為0、10、30、50、70、90 μmol/L，充分混勻。室溫避光暗孵育20 min、鹵素燈下曝光11 min，其后操作步驟同1.2.8.2。未經PMAxx處理組為對照組。試劑盒擴增后探究PMAxx最優(yōu)濃度。

1.2.9 PMAxx對與活/死細胞的選擇性

將活菌和熱滅活菌兩種菌懸液按照不同比例0%、5%、25%、50%、75%、100%進行混合，每個比例混合菌液取500 μL各2份作為待測樣品，一份使用PMAxx處理，另一份不使用PMAxx處理作為對照組，試劑盒檢測后判斷PMAxx處理體系對與活/死細胞的選擇性。

1.2.10 大腸桿菌O157:H7 PMAxx-qPCR標準曲線的制備

將大腸桿菌O157:H7菌液按照10倍倍比進行稀釋，經PMAxx處理體系處理后，分別提取基因組作為模板，使用本研究組建的試劑盒進行檢測，根據相應的動力學曲線繪制標準曲線，建立PMAxx-qPCR活菌定量檢測技術。

1.2.11 數據統(tǒng)計分析

運用IBM SPSS Statistics軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析。實驗數據為三次測定平均值，以平均值±標準偏差（Mean±SD）呈現。多組間比較采用單因素ANOVA檢驗，顯著水平p＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。圖表采用Microsoft Excel、GraphPad Prism軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 試劑盒結果判定

每反應管中取HRM-RT-PCR預混液6 μL、飽和熒光染料 2 μL，Ex Taq HS 酶 0.1 μL，dd H2O 9.9 μL，并加入2 μL待測樣品基因組DNA。設置空白對照（dd H2O）、陽性對照（大腸桿菌O157:H7 DNA）、陰性對照（沙門氏菌 DNA）[24]。根據擴增曲線、熔解峰曲線判斷實驗結果，如圖1所示，在30循環(huán)內有擴增曲線（即Ct值＜30）和熔解峰曲線（G1、G10的Tm值分別為79.1±0.5 ℃、83.6±0.5 ℃）為陽性，判定為檢出，在 30循環(huán)內無特異性擴增曲線（即 Ct值為undetected）、無熔解峰曲線為陰性，判定為未檢出。

2.2 試劑盒靈敏度試驗

初始濃度為8.4×107～8.4×100CFU/mL的大腸桿菌O157:H7菌懸液分別提取基因組作為梯度模板進行靈敏度評價。如圖1a、1b所示，84 CFU/mL的大腸桿菌O157:H7菌懸液在30個循環(huán)內仍有擴增曲線（Ct值=29.403）和熔解峰曲線（79.1±0.5 ℃、83.6±0.5 ℃），即試劑盒最低檢測限為84 CFU/mL。

表4 試劑盒可重復性評價結果Table 4 Results of repeatability evaluation of the HRM-RT-PCR kit

2.3 試劑盒特異性評價

檢測結果特異性良好，試驗中的9株大腸桿菌中，僅7株O157:H7血清型出現擴增曲線及相應的熔解峰曲線，2株非O157:H7血清型未出現特異性擴增；其他18株常見食源性致病菌檢測結果均為陰性。

2.4 試劑盒穩(wěn)定性評價

2.4.1 重復性試驗

重復性試驗結果如表 4所示，因大腸桿菌O157:H7的實際污染劑量非常低，選取中、低濃度的菌液和基因組（1.02×104CFU/mL、1.02×102CFU/mL、3.99 ng/μL、3.99 pg/μL），使用試劑盒對其進行檢測。同一模板的10次平行擴增Ct值標準偏差SD值＜0.5，在可接受范圍之內，說明該試劑盒擴增重復性好。

2.4.2 反復凍融對試劑盒的影響

在實際操作過程中，較大容積的 HRM-RT-PCR預混液通常不會一次性消耗完畢，在使用過程中會反復凍結與融化，使生化試劑效用降低。如表5所示，雖實驗結果有顯著性差異但數值差異較小，Ct值相差約1.482個循環(huán)，本研究驗證試劑盒經過50次反復凍融后，仍能有效地檢測出大腸桿菌O157:H7。

表5 反復凍融對HRM-RT-PCR試劑盒的影響Table 5 Effects of repeated freeze-thaw cycles on the HRM-RT-PCR kit

2.4.3 運輸環(huán)境對試劑盒的影響

試驗結果如圖2所示，隨著時間推移，泡沫盒中的溫度開始逐漸上升，冰袋的更換使得泡沫盒內溫度起伏較大，在0.7～14.3 ℃溫度范圍內波動。8 d模擬運輸實驗后，該試劑盒仍可有效檢測出大腸桿菌O157:H7，24 h后Ct值無差異顯著性，72 h的Ct值與0 h相差約0.75個循環(huán)，表明短期運輸對其無不良影響。

表6 大腸桿菌O157:H7人工污染試驗試劑盒檢測結果Table 6 Detection results of artificial contamination with E. coli O157:H7

2.5 試劑盒抗干擾試驗

平板菌落計數結果：大腸桿菌 O157:H7 ATCC 43889為3×108CFU/mL、副溶血性弧菌ATCC 17802為1.14×108CFU/mL、金黃色葡萄球菌CICC 26074為3.9×109CFU/mL、單增李斯特菌CICC 21662為8×106CFU/mL、蠟樣芽孢桿菌CCTCC AB 204038為7.3×107CFU/mL。如圖 3a，9組不同濃度梯度干擾菌的混合菌液，都能準確地檢測出3×103CFU/mL的目標菌大腸桿菌O157:H7 ATCC 43889，擴增曲線幾乎重疊；如圖3b，熔解峰曲線Tm值均在79.1±0.5 ℃、83.6±0.5 ℃范圍內，試劑盒抗干擾性能良好。

2.6 人工污染試驗

如表6所示，大腸桿菌O157:H7人工污染試驗結束后，未增菌培養(yǎng)即可檢測到初始污染量為7.97×101CFU/mL的人工污染食品樣品，增菌培養(yǎng)至 6 h，7.97×100CFU/mL初始污染量的食品樣品可被檢測到，試劑盒實際應用效果好。

2.7 PMAxx處理條件優(yōu)化

2.7.1 PMAxx曝光時間優(yōu)化

接種熱滅活細胞懸液的平板培養(yǎng)后未有菌落長出。PMAxx曝光時間的長短影響其與DNA共價交聯的效果。如圖4，熱滅活菌檢測結果顯示，0～5 min時間范圍內，Ct值迅速升高，這是由于PMAxx逐漸與死菌DNA相結合對其擴增產生抑制；曝光5～9 min內，Ct值在較小范圍內波動，說明隨著曝光時間增加，殘留PMAxx的光解率升高，對死菌DNA擴增的抑制作用不穩(wěn)定；9 min后PMAxx與死菌DNA結合逐漸穩(wěn)定，11 min時Ct值達到最高點，此時PMAxx處理熱滅活菌組與活菌組Ct值相差最大，即PMAxx對熱滅活菌DNA擴增的抑制程度最大；使用PMAxx處理活菌菌懸液后，Ct值數值波動較小，PMAxx對活菌DNA擴增幾乎沒有影響，隨著曝光時間的增加，活菌菌懸液Ct值微小的降低可能是由于PMAxx光解，對活菌僅有的一點抑制作用也消失了。綜上，選擇11 min作為PMAxx處理的最優(yōu)曝光時間。

2.7.2 PMAxx暗孵育時間的優(yōu)化

如圖5，PMAxx不能進入到活細胞內與DNA分子結合，因此隨著暗孵育時間延長，活菌擴增的 Ct值折線變化平緩；使用PMAxx對熱滅活菌菌懸液進行處理時，隨著暗孵育時間的延長，Ct值顯著增加，這是因為在暗孵育過程中，PMAxx與死菌DNA逐漸結合，對其擴增的抑制作用增強，暗孵育 20 min后Ct值達到峰值，說明此時 PMAxx與熱滅活細胞的DNA最大程度相結合，有效抑制了死菌DNA的擴增。因此，20 min確定為最佳暗孵育時間。

2.7.3 PMAxx濃度優(yōu)化

由圖6可知，活菌組Ct值在0、10、50、90 μmol/L PMAxx處理時無差異顯著性，總體來看折線平緩，Ct值基本不變，PMAxx濃度變化對活菌DNA的擴增影響很??；而使用 PMAxx對熱滅活菌組進行理時，其Ct值隨PMAxx質量濃度增加顯著增大：70 μmol/L后隨著PMAxx濃度的增大Ct值不存在差異顯著性。當質量濃度為30 μmol/L時，PMAxx對熱滅活菌抑制作用達到最大，可最大限度地抑制死菌細胞DNA的擴增。因此，選擇30 μmol/L作為PMAxx處理的最優(yōu)濃度。

2.8 PMAxx對與活/死細胞的選擇性

由圖7可知，當PMAxx處理組活菌數為0%時，Ct值達到最高28.603，而未經PMAxx處理的對照組樣本 Ct值為 12.225，說明 PMAxx處理后熱滅活菌DNA擴增受到顯著抑制。當活菌比例逐漸上升，處理組Ct值逐漸下降，但仍明顯高于對照組，且對照組折線變化不大，說明 PMAxx處理可對樣本中的死菌DNA擴增進行抑制而對活菌的抑制作用較小，使處理組可擴增的DNA數量小于對照組，在一定程度上消除了因死菌DNA擴增造成的信號干擾，降低了假陽性結果產生的概率。隨著活菌比例的上升，ΔCt值逐漸減小，活菌數100%時處理組與對照組Ct值幾乎重合。綜上，PMAxx處理組結果更接近樣本中活菌真實的定量值，可實現對樣本中活菌的準確檢測。

表7 大腸桿菌O157:H7傳統(tǒng)靶點與自篩靶點對比Table 7 Comparison of traditional targets with self-screening targets of E. coli O157: H7

2.9 大腸桿菌O157:H7 PMAxx-qPCR標準曲線的制備

如圖8，在濃度范圍3.4×107～3.4×102CFU/mL 內Ct值與菌液濃度線性關系良好，R2為0.9895，建立起了一種大腸桿菌O157:H7活菌定量檢測的方法。

3 討論

HRM-RT-PCR試劑盒的準確性受到酶活性、反應體系中各組分濃度的差異等多種因素的影響，反應體系中各組分含量、比例的微量差異都有可能造成較大的結果偏差，這就對加樣的精確性提出了更高的要求，因此，標準化加樣步驟成為組建檢測試劑盒必不可少的先決條件。試劑盒在商業(yè)化過程中應盡可能簡化操作步驟，將不同組分如Ex Taq酶緩沖液、dNTP Mix、引物預先混合，減少加樣步驟，縮短檢測時間，在一定程度上有效消除加樣誤差，最大程度地保證了試劑盒操作的簡便性與精確性。

使用HRM-RT-PCR檢測病原體，通常使用帶有高分辨熔解曲線分析的飽和熒光染料和多色熒光標記的探針[14]，飽和熒光染料如SYBR Green、Eva Green和SYTO 9在HRM-RT-PCR中的使用，不僅大大優(yōu)化了其分辨率及檢出限，而且相對來說比使用探針成本更低，并且可采用一種核酸染料同時對多種病原微生物或多種目標基因同時進行檢測。本研究使用的飽和熒光染料SYTO 9具有較好的生物兼容性和較高的熒光信號值；高濃度SYTO 9可以降低擴增Ct值，從而降低檢出限，且不會影響PCR擴增程序；在形成高分辨熔解曲線過程中分布均勻，進一步提高熔解峰曲線的精確度。Singh等[25]采用飽和熒光染料 SYTO 9，對HRM-RT-PCR檢測技術進行了優(yōu)化，設計了一種低成本的多重RT-PCR檢測STEC的stx1、stx2基因和沙門氏菌的方法。

根據前期 Blast 比對及電泳實驗，發(fā)現傳統(tǒng)靶點檢測大腸桿菌 O157:H7血清型菌株時存在較多假陽性，無法準確檢測該血清型。如表7所示，傳統(tǒng)靶點fliC、rfbE、rrsH不僅在大腸桿菌O157:H7菌株中有特異性擴增，還在多株非大腸桿菌O157:H7菌株中出現特異性擴增，stx2靶點也會在少數非大腸桿菌O157:H7菌株擴增中出現假陽性結果。

本研究中發(fā)掘的特異性靶點G1是一種編碼假定蛋白的基因，假定蛋白質是一種已經預測到其存在的蛋白質，通過當前分子生物學技術難以預測該類蛋白功能；G10編碼 GDP-L-巖藻糖合酶，這種酶屬于氧化還原酶家族，這種酶參與果糖和甘露糖代謝。經驗證，本研究中篩選的靶點具有較好的特異性，所選菌株中只有O157:H7血清型的大腸桿菌能擴增出G1、G10基因，而非大腸桿菌O157:H7菌株均不能檢測到該靶點。

本研究組建試劑盒采用實驗室自篩靶點 G1、G10，因為一般單個基因無法準確檢測O157:H7血清型，單個自篩靶點的檢測特異性雖有所提高，但仍存在個別漏檢現象，即僅有G1擴增仍不能完全確定是該血清型。因此，本研究組建雙重檢測體系，引入另一個基因G10進行輔助檢測，使得檢測特異性大幅度提高。

4 結論

本研究旨在組建新型大腸桿菌 O157:H7 HRM-RT-PCR快速檢測試劑盒。試劑盒使用實驗室自篩靶點，特異性強，研究使用的27株菌株中，僅大腸桿菌O157:H7血清型檢測呈陽性結果；采用飽和熒光染料SYTO 9，具有較高的熒光信號值，不僅進一步提高了熔解峰曲線的精確度，同時降低了檢出限，最低可檢測到84 CFU/mL的大腸桿菌O157:H7。操作簡便快捷，無需繁瑣的電泳操作；檢測結果精準、快速。在重復性實驗、反復凍融實驗、模擬運輸實驗中表現出較強的穩(wěn)定性；在四種其他種類常見食源性致病菌同時存在的情況下能準確檢測出大腸桿菌O157:H7，抗干擾能力強；最低可檢測到初始污染量為7.97×100CFU/mL的人工污染食品樣品，為大腸桿菌O157:H7的檢測提供了有價值的工具。最后，本研究進一步將PMAxx與 HRM-RT-PCR檢測試劑盒相結合，用PMAxx處理活菌懸液后再提取基因組，可以去除死菌、VBNC狀態(tài)細菌等的存在對大腸桿菌O157:H7活菌檢測的干擾，降低假陽性檢測結果出現的可能性，進一步建立了一種大腸桿菌O157:H7活菌定量檢測的方法。