劉楠，澹臺瑋，王芳，徐秦峰

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

2019年12月以來，由新型冠狀病毒SARS-CoV-2感染引發(fā)的疫情已經(jīng)在全球大面積流行[1,2]。隨著疫情的蔓延，許多冷鏈?zhǔn)称吠獍b檢測出病毒陽性并成為關(guān)注的焦點(diǎn)[3,4]。據(jù)報(bào)道自2020年7月以來，國內(nèi)新冠肺炎病毒呈陽性事件與食品外包裝相關(guān)的至少已有10件[5]。各市從境外進(jìn)口的各種海鮮產(chǎn)品、禽肉等冷凍食品外包裝攜帶新冠肺炎病毒[6]成為了疾病傳播新途徑，給食品質(zhì)量安全保障帶來了新挑戰(zhàn)。同時(shí)相關(guān)專家證明了新冠肺炎病毒可在冷鏈外包裝上長時(shí)間存活，一般冰鮮水產(chǎn)品的運(yùn)輸溫度在0～4 ℃、冷凍水產(chǎn)品和冷凍畜禽肉的運(yùn)輸溫度在零下18 ℃以下[7,8]，這種運(yùn)輸條件為新冠病毒提供了生存環(huán)境。海關(guān)總署要求部分海關(guān)在不影響正常貿(mào)易的情況下，對部分冷鏈?zhǔn)称烽_展新冠病毒核酸抽樣檢驗(yàn)工作。因此快速、高效的現(xiàn)場檢驗(yàn)可為抽檢工作提供便利。

實(shí)時(shí)熒光 PCR法是目前各醫(yī)療檢測機(jī)構(gòu)對新型冠狀病毒感染檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[9,10]，但該方法需要較為昂貴的設(shè)備，且對人員操作技術(shù)要求較高，因此該方法適用于實(shí)驗(yàn)室的檢測，不適用于現(xiàn)場快速檢測[11]。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)因其恒溫操作而具有現(xiàn)場檢測的條件，同時(shí)也具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為檢測病原微生物的重要分子工具。已有文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，采用鈣黃綠素檢測LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了1 h內(nèi)的新冠病毒的肉眼可視化檢測，無需大型儀器設(shè)備。但由于鈣黃綠素分子不穩(wěn)定，并且其stoke’s位移較小，藍(lán)光激發(fā)時(shí)顯示綠色熒光，存在顏色變化不夠明顯等問題。20世紀(jì)90年代初期，Barton課題組[15]發(fā)現(xiàn)了[Ru(phen)2dppz]2+對雙鏈 DNA 的分子的“光開關(guān)”效應(yīng)，Ru(II)配合物水溶液本身不發(fā)光，當(dāng)加入 dsDNA分子時(shí)會發(fā)光，具有優(yōu)良的水溶性和穩(wěn)定性，Stoke’s位移大，通過藍(lán)光激發(fā)光觀察，呈現(xiàn)紅色熒光，相較于傳統(tǒng)LAMP染料的綠色熒光，顏色區(qū)分更明顯，結(jié)果更易判定[16-27]。

本研究建立了一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 LAMP技術(shù)和金屬 Ru(II)配合物染料相結(jié)合的新型冠狀病毒可視化閉管檢測方法。通過保溫杯和藍(lán)光手電代替實(shí)驗(yàn)室用電的恒溫水浴鍋和藍(lán)光透射儀，開發(fā)了一種現(xiàn)場快速可視化LAMP檢測試劑盒。該方法可為新型冠狀病毒的食品現(xiàn)場檢驗(yàn)工作提供一種快速、經(jīng)濟(jì)、便捷的工具，同時(shí)也可應(yīng)用于醫(yī)療、環(huán)境、食品衛(wèi)生等其他領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

MyGo Pro熒光定量PCR儀，IT-IS Life Science；PowerPacTM Basic瓊脂糖水平電泳儀，BIO-RAD；保溫杯，HUAWEI HiLink；藍(lán)光手電筒，AloneFire；MYSPIN12微型離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

釕(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+試劑，Jena Bioscience公司；dNTP混合液、Solution Mix、MgSO4、Bst 2.0 WarmStar? DNA 聚合酶、100×TE Buffer均來自New England Biolabs；甜菜堿，Sigma公司；(20×)EvaGreen，Biotium公司；PCR反應(yīng)mix（KT201）、DNA MarkerII、TRNzol Universal總RNA提取試劑盒、FastKing RT Kit（KR116），天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖（Biotech Grade）、新冠病毒N基因質(zhì)粒、MERS病毒質(zhì)粒、金黃色葡萄球菌質(zhì)粒、阪崎腸桿菌質(zhì)粒以及新冠病毒假病毒，均來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

本研究針對新型冠狀病毒基因在NCBI網(wǎng)站中登記號為MN908947的信息，選定新冠N基因?qū)?yīng)序列，同時(shí)依據(jù)引物設(shè)計(jì)原則使用PrimerExplorerV5在線設(shè)計(jì)LAMP引物，包括外引物F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP。根據(jù)T/CAQI 159-2020食品及食品包裝表面中新型冠狀病毒采樣與實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測方法選取PCR引物序列，包括正向引物（F）、反向引物（R）和雙標(biāo)記熒光探針（P）。選引物序列見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及探針序列Table 1 Primers and probe used in the experiment

1.4 LAMP體系的建立

LAMP 反應(yīng)體系為 10 μL，包括：1 μL 10× Thermol Pol buffer，外引物 F3 和 B3（4 μmol/L）各 0.25 μL，內(nèi)引物FIP和BIP（50 μmol/L）各0.16 μL，1.4 μL dNTPs（10 mmol/L），1.6 μL 甜菜堿（0.8 mol/L），0.45 μL MgSO4（100 mmol/L），0.4 μL BstDNA 聚合酶（8 U/μL）。陽性體系添加DNA模板1.2 μL，以雙蒸水代替DNA作為陰性對照，最后用水補(bǔ)齊到10 μL。釕(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+添加至反應(yīng)管內(nèi)的吸頭內(nèi)[28]。將反應(yīng)管密封，放置于保溫杯中，調(diào)節(jié)保溫杯溫度至65 ℃，恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)40 min，反應(yīng)結(jié)束后倒置混勻，使反應(yīng)產(chǎn)物與[Ru(phen)2dppz]2+結(jié)合并混勻，最后在藍(lán)光手電下進(jìn)行目視觀察比色、分析。陽性結(jié)果在藍(lán)光激發(fā)下顯示紅色，陰性結(jié)果無色。具體步驟見圖1。

1.5 可視化現(xiàn)場檢測試劑盒的可行性

添加0.25 μL Eva Green（20×）至反應(yīng)體系中，使用MyGo儀進(jìn)行實(shí)時(shí)恒溫LAMP反應(yīng)觀察實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線，驗(yàn)證引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的可行性。將在保溫杯中65 ℃下進(jìn)行LAMP恒溫反應(yīng)40 min擴(kuò)增的反應(yīng)管取出，通過藍(lán)光手電觀察離心管熒光顏色，用手機(jī)拍取熒光照片，并使用熒光光譜儀掃描光譜，最后采用 2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行確認(rèn)在保溫杯中進(jìn)行了LAMP反應(yīng)。

1.6 可視化LAMP方法的靈敏度與特異性

將 1.79×106copies/μL的新型冠狀病毒質(zhì)粒按照10 倍濃度梯度依次稀釋為 1.79×106、1.79×105、1.79×104、1.79×103、1.79×102、1.79×101、1.79×100copies/μL并設(shè)置空白對照，每個(gè)梯度均取1.2 μL為模板，驗(yàn)證方法的靈敏度。

應(yīng)用構(gòu)建好的LAMP可視化檢測方法，以目標(biāo)病毒（新型冠狀病毒質(zhì)粒）為陽性模板，以非目標(biāo)（MERS病毒、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌）的質(zhì)粒，分別作為待測樣品模板，雙蒸水作為陰性對照（NTC）進(jìn)行特異性驗(yàn)證。反應(yīng)結(jié)束后，通過藍(lán)光激發(fā)光觀察顏色變化。

1.7 人工污染冷鏈?zhǔn)称分行鹿诓《镜臋z測

以新冠病毒假病毒人工污染冰淇淋，作為模擬冷鏈?zhǔn)称窐悠?。然后通過TRNzol Universal總RNA提取試劑盒提取RNA，再通過FastKing RT Kit（KR116）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為DNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行人工污染冷鏈?zhǔn)称分行滦凸跔畈《镜目梢暬?LAMP和實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測。熒光定量 PCR：5 μL KT201，正向引物（4 μmol/L）、反向引物（4 μmol/L）、熒光探針（4 μmol/L）各1 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)齊到10 μL。采用兩步擴(kuò)增，95 ℃-5 min，95 ℃-10 s，55 ℃-45 s，共35個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與討論

2.1 可視化LAMP檢測方法的可行性

采用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，進(jìn)行恒溫LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖2a所示，在模板存在時(shí)能夠觀察到明顯的擴(kuò)增曲線，證明引物能夠進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。同時(shí)在保溫杯中進(jìn)行的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，其擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，可清晰顯示出LAMP擴(kuò)增條帶（圖2a），表明在保溫杯中可以進(jìn)行LAMP反應(yīng)。同時(shí)在藍(lán)光手電照射下，陽性反應(yīng)管發(fā)射出明顯的紅色熒光信號，如圖2b所示；無模板存在時(shí)，無熒光發(fā)射，所觀察到的反應(yīng)管的熒光顏色與熒光光譜信號強(qiáng)度保持一致。表明釕(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+可用于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的可視化檢測。相比于常見的鈣黃綠素stoke’s位移約為40 nm[13]，本實(shí)驗(yàn)中的[Ru(phen)2dppz]2+試劑的stoke’s位移則大于150 nm，采用藍(lán)光激發(fā)時(shí)發(fā)射處于紅色熒光區(qū)，顏色區(qū)分更為明顯，可減少目視觀察的主觀性誤差。

2.2 可視化 LAMP檢測方法的靈敏度與特異性檢驗(yàn)

新型冠狀病毒質(zhì)粒的靈敏度檢驗(yàn)結(jié)果如圖 3a所示，通過使用緩沖液對質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，在8號反應(yīng)管空白對照顯示陰性的情況下，新冠病毒濃度在1.79×106copies/μL 至1.79×100copies/μL中檢測結(jié)果均為陽性。因此LAMP可視化檢測方法對新型冠狀病毒的檢測靈敏度為單個(gè)拷貝數(shù)。

針對新型冠狀病毒質(zhì)粒、MERS病毒質(zhì)粒、金黃色葡萄球菌質(zhì)粒、阪崎腸桿菌質(zhì)粒DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，采用超純水作為空白對照。檢測結(jié)果如圖 3b所示，含有新冠病毒質(zhì)粒的可視化LAMP檢測結(jié)果為陽性，而對于其他病毒和食源性病原菌以及空白對照的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。因此證明該LAMP可視化檢測方法對新冠病毒有引物特異性。

2.3 人工污染冷鏈?zhǔn)称分行鹿诓《镜臋z測結(jié)果

以新冠假病毒人工污染冷鏈?zhǔn)称?，同時(shí)進(jìn)行可視化LAMP擴(kuò)增檢測與實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，驗(yàn)證方法的實(shí)用性。如圖4a和4b所示，新冠假病毒陽性對照和新冠假病毒人工污染的冰淇淋樣品，均在Ct值24左右出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，同時(shí)反應(yīng)管中出現(xiàn)明顯的紅色熒光，冰淇淋陰性對照則無明顯的擴(kuò)增曲線和紅色熒光出現(xiàn)，證明該方法可應(yīng)用于冷鏈?zhǔn)称分行鹿诓《镜臋z測。

3 結(jié)論

本研究建立的基于Ru(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+染料的閉管可視化檢測LAMP擴(kuò)增新冠病毒的方法，反應(yīng)溫度為62 ℃，反應(yīng)時(shí)間僅需40 min，其檢出性能與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法相持平，可檢測到模板濃度為單個(gè)拷貝數(shù)，并與MERS病毒、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌之間無交叉反應(yīng)，具有較高的特異性。無需實(shí)驗(yàn)室的精密操作與儀器，僅利用保溫杯和藍(lán)光手電筒可進(jìn)行現(xiàn)場可視化目視檢測，成本低、高效快速。該方法可以為食品新冠檢測篩查提供支持，適合在資源有限場所開展核酸檢測或者家庭自檢。