金龍 田琦 張寶慶 邢海冬 高明霞 張秀英 王利華 張曉磊

氟喹諾酮類藥物是治療耐藥結(jié)核病的重要藥物，然而近年來(lái)，結(jié)核分枝桿菌對(duì)這類藥物的耐藥率逐漸增加[1]。因此，氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測(cè)已成為結(jié)核病臨床治療方案制定中不可或缺的依據(jù)。依賴于培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)的傳統(tǒng)耐藥性檢測(cè)方法至少需要6～8周才能得到結(jié)果，極易延誤病情。分子藥敏試驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展克服了傳統(tǒng)表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)[2]。其中，熒光PCR熔解曲線法通過(guò)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)計(jì)特異探針檢測(cè)氟喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(gyrA88～94密碼子)，可以在2.5 h內(nèi)得出氟喹諾酮類藥物耐藥信息，是目前快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性的新型分子生物學(xué)方法之一[3]。目前，關(guān)于熒光PCR探針熔解曲線法檢測(cè)氟喹諾酮類藥物耐藥的臨床研究較少，特別是同時(shí)針對(duì)左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)的研究數(shù)據(jù)較為匱乏。本研究就2018年11月至2019年12月在黑龍江省傳染病防治院經(jīng)熒光PCR熔解曲線法，以及BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)兩種方法臨床確診的耐多藥肺結(jié)核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)患者進(jìn)行分析，探討熒光PCR熔解曲線法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx和Mfx耐藥性的臨床價(jià)值。

資料和方法

一、資料收集

收集2018年11月至2019年12月黑龍江省傳染病防治院經(jīng)過(guò)熒光PCR熔解曲線法篩查，并經(jīng)BACTEC MGIT 960全自動(dòng)分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)確診為MDR-PTB患者的痰液樣本。研究期間本院收治符合條件的患者共計(jì)195例，均為復(fù)治患者，其中男性112例，女性83例；年齡17～78歲，平均年齡(45.0±11.5)歲。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提?。菏占降奶狄簶颖揪捎脧B門(mén)致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的Lab-Aid 824S核酸自動(dòng)提取儀進(jìn)行基因組DNA的提取，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

2. 熒光PCR熔解曲線法：(1)操作方法：嚴(yán)格按照廈門(mén)致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測(cè)試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。(2)結(jié)果判定方法：通過(guò)比較所檢測(cè)樣本與陽(yáng)性對(duì)照樣本之間熔解曲線的熔點(diǎn)(Tm值)的差異判斷樣本是否發(fā)生突變：樣本的熔點(diǎn)與陽(yáng)性對(duì)照的熔點(diǎn)一致(誤差不超過(guò)1 ℃)時(shí)判定為野生型，待檢樣本對(duì)氟喹諾酮類藥物敏感；樣本的熔點(diǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照2 ℃及以上時(shí)(△Tm≥2 ℃)判定為突變型，待檢樣本對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥。

3. 分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)方法：應(yīng)用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)對(duì)收集的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行快速培養(yǎng)，再對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)，包括Lfx和Mfx兩種藥品。藥物敏感性檢測(cè)試劑購(gòu)于珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，臨界濃度分別為2.0 μg/ml和0.25 μg/ml。所有操作均嚴(yán)格按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[4]和試劑或設(shè)備說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需要2～3個(gè)月。

三、質(zhì)量控制

本課題組人員均進(jìn)行過(guò)嚴(yán)格的項(xiàng)目啟動(dòng)培訓(xùn)，掌握實(shí)施方案。項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中嚴(yán)格按照實(shí)施方案標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行患者納入、表格登記、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果判斷等。結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室每天做好相關(guān)儀器設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中嚴(yán)格做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熒光PCR熔解曲線法的敏感度、特異度、一致率和Kappa值。Kappa值在0.00～0.20為極低一致；Kappa值在0.21～0.40為一般一致；Kappa值在0.41～0.60為中等一致；Kappa值在0.61～0.80為高度一致；Kappa值在0.81～1.00為完全一致。

結(jié) 果

一、熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果

195株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)，有114株發(fā)生gyrA基因突變，81株未發(fā)生突變。

二、比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果

195株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)，Lfx耐藥90株，敏感105株，Lfx總耐藥率為46.15%(90/195)；Mfx耐藥95株，敏感100株，Mfx總耐藥率為48.72%(95/195)。

三、熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)效能評(píng)價(jià)

以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx耐藥性的敏感度為95.56%，特異度為73.33%，一致率為83.59%，Kappa值為0.83；檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)Mfx耐藥性的敏感度為95.79%，特異度為77.00%，一致率為86.15%，Kappa值為0.85。見(jiàn)表1。

表1 熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)195株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)左氧氟沙星和莫西沙星耐藥性的效能

熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果與比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果不一致的樣本共有32株，其中，28株藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為耐藥突變，4株藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為無(wú)耐藥突變。對(duì)于藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為耐藥突變的28例患者，均已根據(jù)分子診斷結(jié)果進(jìn)行個(gè)體化用藥，均已臨床治愈；另外4例藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為無(wú)耐藥突變的患者，已按照敏感肺結(jié)核進(jìn)行治療，均已臨床治愈。

討 論

耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)是結(jié)核病防治領(lǐng)域的兩大難題[5-7]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的推薦意見(jiàn)，以及藥物的有效性、安全性和可及性，二線抗結(jié)核藥物氟喹諾酮類藥物中的Lfx和Mfx可以作為耐藥結(jié)核病治療的首選藥物[8]。傳統(tǒng)的表型藥敏試驗(yàn)檢測(cè)方法需要進(jìn)行痰培養(yǎng)，周期往往長(zhǎng)達(dá)4～8周，無(wú)法及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥[4]?；诖耍裟軐?shí)現(xiàn)痰液直接檢測(cè)，快速診斷出氟喹諾酮類藥物耐藥的患者，將有助于醫(yī)生選擇用藥方案，可以成為減少耐藥結(jié)核病流行和提高M(jìn)DR-TB和XDR-TB治療成功率的可靠保證[9]。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的分子檢測(cè)方法被廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的臨床診斷中[10]。目前市面上大多數(shù)商業(yè)試劑盒只能檢測(cè)一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，如賽沛公司的GeneXpert MTB/RIF試劑盒只能檢測(cè)利福平一種藥品的耐藥情況[11]，成都博奧晶芯生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒(DNA微陣列芯片法)只能檢測(cè)利福平和異煙肼兩種一線抗結(jié)核藥品的耐藥情況[12]；德國(guó)Hain Lifescience GmbH公司的GenoType MTBDRsl試劑盒雖然可以對(duì)MDR-TB患者進(jìn)行氟喹諾酮類藥物和二線注射類藥物的耐藥突變檢測(cè)[13]，但是該試劑需要PCR后進(jìn)行處理，操作復(fù)雜，極易造成污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性。與以上這些試劑盒相比，熒光PCR熔解曲線法能同時(shí)檢測(cè)4種一線抗結(jié)核藥物(包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素)和氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)的耐藥情況，并有多項(xiàng)研究表明，其具有敏感度高、特異度強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速、閉管檢測(cè)(無(wú)需PCR后處理)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于臨床結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)[14-17]。

本研究結(jié)果顯示，以比例法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx耐藥性的敏感度為95.56%，特異度為73.33%，一致率為83.59%；檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)Mfx耐藥性的敏感度為95.79%，特異度為77.00%，一致率為86.15%。采用相同的檢測(cè)方法，李國(guó)利等[14]研究檢測(cè)Lfx的敏感度為97.01%，特異度為99.55%，一致率為99.21%；曹志華等[17]研究檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的敏感度為93.75%，特異度為96.35%，一致率為96.08%；蔚鳴等[18]研究檢測(cè)Lfx的敏感度為92.65%，特異度為95.81%，一致率為94.89%；檢測(cè)Mfx的敏感度為87.50%，特異度為76.78%，一致率為77.87%。本研究檢測(cè)Mfx的特異度與蔚鳴等[18]的研究一致，但低于曹志華等[17]的研究；檢測(cè)Lfx的特異度均低于上述研究，分析其原因，可能包括以下幾點(diǎn)。

1. 痰液樣本在培養(yǎng)后的細(xì)菌比例可能會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致檢測(cè)不同樣本類型的特異度存在差異。李國(guó)利等[14]和曹志華等[17]的研究中，熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)的樣本類型均為結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，而本研究檢測(cè)的是痰液樣本。已有研究報(bào)道，在發(fā)生氟喹諾酮類藥物耐藥突變的樣本中，同時(shí)含有敏感菌和耐藥菌的樣本比例高達(dá)23%[19]，痰液樣本在液化處理的過(guò)程中，部分細(xì)菌失去活性，在同時(shí)含有敏感菌和低比例耐藥菌的樣本中，少量耐藥菌的活性進(jìn)一步下降，導(dǎo)致在培養(yǎng)的過(guò)程中耐藥菌沒(méi)有被培養(yǎng)出來(lái)，該樣本被錯(cuò)誤地判定為敏感。熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)的是結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA序列，與細(xì)菌的活性無(wú)關(guān)。因此，在上述這種情況下，樣本的耐藥突變菌株會(huì)被檢測(cè)出來(lái)，判讀為耐藥突變。此外，樣本經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后細(xì)菌含量及比例可能會(huì)發(fā)生變化，影響藥敏試驗(yàn)結(jié)果。而以上2個(gè)研究檢測(cè)的是菌株樣本，不存在直接檢測(cè)痰液樣本所導(dǎo)致的問(wèn)題。

2. 培養(yǎng)方法的不同可能會(huì)導(dǎo)致比例法藥敏試驗(yàn)的結(jié)果存在差異。本研究與李國(guó)利等[14]和曹志華等[17]的研究在培養(yǎng)方法和比例法藥敏試驗(yàn)的操作方面有所差異，導(dǎo)致特異度偏低。以上2個(gè)研究的培養(yǎng)方法為固體培養(yǎng)法，而本研究采用的是BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法，對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果判定會(huì)有一定的影響。gyrA基因中的部分突變類型，例如G88A、D89N、A90V、S91P、D94A等僅能引起較低的耐藥水平[20-21]，當(dāng)菌株處于耐藥與敏感的臨界水平時(shí)，在進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中，若采用的培養(yǎng)方法有所差異、操作人員存在實(shí)驗(yàn)操作上的偏差，或者藥物濃度稍有偏差，有可能造成原本低度耐藥的菌株被判定為敏感，而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為耐藥突變。因此，以藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)，以上的差異會(huì)導(dǎo)致本研究中熒光PCR熔解曲線法的特異度偏低。

3. 臨界藥物濃度選擇可能會(huì)影響臨界菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果。處于耐藥與敏感臨界水平的菌株，對(duì)其藥物敏感性的判斷，往往與藥物的臨界濃度相關(guān)。本研究所采用的兩種藥物的臨界濃度不一定為最佳臨界濃度，這可能也是導(dǎo)致本研究中熒光PCR熔解曲線法相比以上3個(gè)研究特異度偏低的原因之一，尤其是與蔚鳴等[18]的研究相比，本研究與其在上述兩個(gè)原因方面均不存在明顯差異，臨界濃度的差異可能是兩者特異度相差較大的主要原因。

但總體上看，即使本研究檢測(cè)的樣本為痰液樣本，熒光PCR熔解曲線法依然具備良好的檢測(cè)效果，與培養(yǎng)結(jié)果有極高的一致性，為該方法直接檢測(cè)痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況提供了科學(xué)依據(jù)。

本次研究共發(fā)現(xiàn)32份兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，經(jīng)過(guò)病歷信息查詢，對(duì)于藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為耐藥突變的28例患者，均已根據(jù)分子診斷結(jié)果進(jìn)行了個(gè)體化用藥，并且均已臨床治愈；而另外4例藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為無(wú)耐藥突變的患者，由于對(duì)利福平和異煙肼的分子診斷結(jié)果也均為無(wú)耐藥突變，已按照敏感肺結(jié)核進(jìn)行治療，并取得了理想的治療效果，這進(jìn)一步體現(xiàn)了熒光PCR熔解曲線法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)耐藥性的重要臨床價(jià)值。

本研究尚存在一些不足之處。沒(méi)有將納入研究的樣本進(jìn)行測(cè)序，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)一步證實(shí)熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)為耐藥突變，而比例法藥敏試驗(yàn)檢測(cè)為敏感的樣本是否發(fā)生低度耐藥突變。此外，本研究為回顧性研究，在患者選擇方面存在一定偏倚，排除了某些因含菌量少而無(wú)法獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的患者，從而對(duì)評(píng)價(jià)結(jié)果造成一定的影響。

綜上所述，本研究通過(guò)直接檢測(cè)痰液樣本，并與藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，證明熒光PCR熔解曲線法可以快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)Lfx和Mfx的耐藥性，且其檢測(cè)結(jié)果與藥敏試驗(yàn)結(jié)果高度一致，對(duì)臨床判斷結(jié)核分枝桿菌耐藥類型和制定合理的化療方案具有重要價(jià)值。