金龍 田琦 張寶慶 邢海冬 高明霞 張秀英 王利華 張曉磊

氟喹諾酮類藥物是治療耐藥結(jié)核病的重要藥物，然而近年來，結(jié)核分枝桿菌對這類藥物的耐藥率逐漸增加[1]。因此，氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測已成為結(jié)核病臨床治療方案制定中不可或缺的依據(jù)。依賴于培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的傳統(tǒng)耐藥性檢測方法至少需要6～8周才能得到結(jié)果，極易延誤病情。分子藥敏試驗技術(shù)的發(fā)展克服了傳統(tǒng)表型藥敏試驗檢測時間長的缺點(diǎn)[2]。其中，熒光PCR熔解曲線法通過對結(jié)核分枝桿菌的gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增，并設(shè)計特異探針檢測氟喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(gyrA88～94密碼子)，可以在2.5 h內(nèi)得出氟喹諾酮類藥物耐藥信息，是目前快速檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的新型分子生物學(xué)方法之一[3]。目前，關(guān)于熒光PCR探針熔解曲線法檢測氟喹諾酮類藥物耐藥的臨床研究較少，特別是同時針對左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin，Mfx)的研究數(shù)據(jù)較為匱乏。本研究就2018年11月至2019年12月在黑龍江省傳染病防治院經(jīng)熒光PCR熔解曲線法，以及BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)聯(lián)合藥敏試驗兩種方法臨床確診的耐多藥肺結(jié)核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis，MDR-PTB)患者進(jìn)行分析，探討熒光PCR熔解曲線法快速檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx和Mfx耐藥性的臨床價值。

資料和方法

一、資料收集

收集2018年11月至2019年12月黑龍江省傳染病防治院經(jīng)過熒光PCR熔解曲線法篩查，并經(jīng)BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗確診為MDR-PTB患者的痰液樣本。研究期間本院收治符合條件的患者共計195例，均為復(fù)治患者，其中男性112例，女性83例；年齡17～78歲，平均年齡(45.0±11.5)歲。

二、實驗方法

1. 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提?。菏占降奶狄簶颖揪捎脧B門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的Lab-Aid 824S核酸自動提取儀進(jìn)行基因組DNA的提取，嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。

2. 熒光PCR熔解曲線法：(1)操作方法：嚴(yán)格按照廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)說明書進(jìn)行實驗操作。(2)結(jié)果判定方法：通過比較所檢測樣本與陽性對照樣本之間熔解曲線的熔點(diǎn)(Tm值)的差異判斷樣本是否發(fā)生突變：樣本的熔點(diǎn)與陽性對照的熔點(diǎn)一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型，待檢樣本對氟喹諾酮類藥物敏感；樣本的熔點(diǎn)低于陽性對照2 ℃及以上時(△Tm≥2 ℃)判定為突變型，待檢樣本對氟喹諾酮類藥物耐藥。

3. 分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗方法：應(yīng)用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)對收集的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行快速培養(yǎng)，再對培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗，包括Lfx和Mfx兩種藥品。藥物敏感性檢測試劑購于珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司，臨界濃度分別為2.0 μg/ml和0.25 μg/ml。所有操作均嚴(yán)格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[4]和試劑或設(shè)備說明書進(jìn)行。整個檢測過程需要2～3個月。

三、質(zhì)量控制

本課題組人員均進(jìn)行過嚴(yán)格的項目啟動培訓(xùn)，掌握實施方案。項目實施過程中嚴(yán)格按照實施方案標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行患者納入、表格登記、實驗操作、結(jié)果判斷等。結(jié)核病實驗室每天做好相關(guān)儀器設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng)，在實驗操作過程中嚴(yán)格做好實驗室質(zhì)量控制。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。以比例法藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，計算熒光PCR熔解曲線法的敏感度、特異度、一致率和Kappa值。Kappa值在0.00～0.20為極低一致；Kappa值在0.21～0.40為一般一致；Kappa值在0.41～0.60為中等一致；Kappa值在0.61～0.80為高度一致；Kappa值在0.81～1.00為完全一致。

結(jié) 果

一、熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)果

195株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)熒光PCR熔解曲線法檢測，有114株發(fā)生gyrA基因突變，81株未發(fā)生突變。

二、比例法藥敏試驗結(jié)果

195株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)比例法藥敏試驗檢測，Lfx耐藥90株，敏感105株，Lfx總耐藥率為46.15%(90/195)；Mfx耐藥95株，敏感100株，Mfx總耐藥率為48.72%(95/195)。

三、熒光PCR熔解曲線法檢測效能評價

以比例法藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度為95.56%，特異度為73.33%，一致率為83.59%，Kappa值為0.83；檢測結(jié)核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度為95.79%，特異度為77.00%，一致率為86.15%，Kappa值為0.85。見表1。

表1 熒光PCR熔解曲線法檢測195株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星和莫西沙星耐藥性的效能

熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)果與比例法藥敏試驗結(jié)果不一致的樣本共有32株，其中，28株藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變，4株藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變。對于藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變的28例患者，均已根據(jù)分子診斷結(jié)果進(jìn)行個體化用藥，均已臨床治愈；另外4例藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變的患者，已按照敏感肺結(jié)核進(jìn)行治療，均已臨床治愈。

討 論

耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)是結(jié)核病防治領(lǐng)域的兩大難題[5-7]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的推薦意見，以及藥物的有效性、安全性和可及性，二線抗結(jié)核藥物氟喹諾酮類藥物中的Lfx和Mfx可以作為耐藥結(jié)核病治療的首選藥物[8]。傳統(tǒng)的表型藥敏試驗檢測方法需要進(jìn)行痰培養(yǎng)，周期往往長達(dá)4～8周，無法及時指導(dǎo)臨床用藥[4]?；诖?，若能實現(xiàn)痰液直接檢測，快速診斷出氟喹諾酮類藥物耐藥的患者，將有助于醫(yī)生選擇用藥方案，可以成為減少耐藥結(jié)核病流行和提高M(jìn)DR-TB和XDR-TB治療成功率的可靠保證[9]。

近年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展，結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的分子檢測方法被廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的臨床診斷中[10]。目前市面上大多數(shù)商業(yè)試劑盒只能檢測一線抗結(jié)核藥物的耐藥性，如賽沛公司的GeneXpert MTB/RIF試劑盒只能檢測利福平一種藥品的耐藥情況[11]，成都博奧晶芯生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)只能檢測利福平和異煙肼兩種一線抗結(jié)核藥品的耐藥情況[12]；德國Hain Lifescience GmbH公司的GenoType MTBDRsl試劑盒雖然可以對MDR-TB患者進(jìn)行氟喹諾酮類藥物和二線注射類藥物的耐藥突變檢測[13]，但是該試劑需要PCR后進(jìn)行處理，操作復(fù)雜，極易造成污染，導(dǎo)致假陽性。與以上這些試劑盒相比，熒光PCR熔解曲線法能同時檢測4種一線抗結(jié)核藥物(包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素)和氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)的耐藥情況，并有多項研究表明，其具有敏感度高、特異度強(qiáng)、簡便快速、閉管檢測(無需PCR后處理)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于臨床結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測[14-17]。

本研究結(jié)果顯示，以比例法藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度為95.56%，特異度為73.33%，一致率為83.59%；檢測結(jié)核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度為95.79%，特異度為77.00%，一致率為86.15%。采用相同的檢測方法，李國利等[14]研究檢測Lfx的敏感度為97.01%，特異度為99.55%，一致率為99.21%；曹志華等[17]研究檢測氟喹諾酮類藥物的敏感度為93.75%，特異度為96.35%，一致率為96.08%；蔚鳴等[18]研究檢測Lfx的敏感度為92.65%，特異度為95.81%，一致率為94.89%；檢測Mfx的敏感度為87.50%，特異度為76.78%，一致率為77.87%。本研究檢測Mfx的特異度與蔚鳴等[18]的研究一致，但低于曹志華等[17]的研究；檢測Lfx的特異度均低于上述研究，分析其原因，可能包括以下幾點(diǎn)。

1. 痰液樣本在培養(yǎng)后的細(xì)菌比例可能會發(fā)生變化，導(dǎo)致檢測不同樣本類型的特異度存在差異。李國利等[14]和曹志華等[17]的研究中，熒光PCR熔解曲線法檢測的樣本類型均為結(jié)核分枝桿菌臨床分離株，而本研究檢測的是痰液樣本。已有研究報道，在發(fā)生氟喹諾酮類藥物耐藥突變的樣本中，同時含有敏感菌和耐藥菌的樣本比例高達(dá)23%[19]，痰液樣本在液化處理的過程中，部分細(xì)菌失去活性，在同時含有敏感菌和低比例耐藥菌的樣本中，少量耐藥菌的活性進(jìn)一步下降，導(dǎo)致在培養(yǎng)的過程中耐藥菌沒有被培養(yǎng)出來，該樣本被錯誤地判定為敏感。熒光PCR熔解曲線法檢測的是結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA序列，與細(xì)菌的活性無關(guān)。因此，在上述這種情況下，樣本的耐藥突變菌株會被檢測出來，判讀為耐藥突變。此外，樣本經(jīng)過培養(yǎng)后細(xì)菌含量及比例可能會發(fā)生變化，影響藥敏試驗結(jié)果。而以上2個研究檢測的是菌株樣本，不存在直接檢測痰液樣本所導(dǎo)致的問題。

2. 培養(yǎng)方法的不同可能會導(dǎo)致比例法藥敏試驗的結(jié)果存在差異。本研究與李國利等[14]和曹志華等[17]的研究在培養(yǎng)方法和比例法藥敏試驗的操作方面有所差異，導(dǎo)致特異度偏低。以上2個研究的培養(yǎng)方法為固體培養(yǎng)法，而本研究采用的是BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法，對藥敏試驗結(jié)果判定會有一定的影響。gyrA基因中的部分突變類型，例如G88A、D89N、A90V、S91P、D94A等僅能引起較低的耐藥水平[20-21]，當(dāng)菌株處于耐藥與敏感的臨界水平時，在進(jìn)行比例法藥敏試驗過程當(dāng)中，若采用的培養(yǎng)方法有所差異、操作人員存在實驗操作上的偏差，或者藥物濃度稍有偏差，有可能造成原本低度耐藥的菌株被判定為敏感，而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變。因此，以藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn)，以上的差異會導(dǎo)致本研究中熒光PCR熔解曲線法的特異度偏低。

3. 臨界藥物濃度選擇可能會影響臨界菌株的藥敏試驗結(jié)果。處于耐藥與敏感臨界水平的菌株，對其藥物敏感性的判斷，往往與藥物的臨界濃度相關(guān)。本研究所采用的兩種藥物的臨界濃度不一定為最佳臨界濃度，這可能也是導(dǎo)致本研究中熒光PCR熔解曲線法相比以上3個研究特異度偏低的原因之一，尤其是與蔚鳴等[18]的研究相比，本研究與其在上述兩個原因方面均不存在明顯差異，臨界濃度的差異可能是兩者特異度相差較大的主要原因。

但總體上看，即使本研究檢測的樣本為痰液樣本，熒光PCR熔解曲線法依然具備良好的檢測效果，與培養(yǎng)結(jié)果有極高的一致性，為該方法直接檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況提供了科學(xué)依據(jù)。

本次研究共發(fā)現(xiàn)32份兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣本，經(jīng)過病歷信息查詢，對于藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變的28例患者，均已根據(jù)分子診斷結(jié)果進(jìn)行了個體化用藥，并且均已臨床治愈；而另外4例藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變的患者，由于對利福平和異煙肼的分子診斷結(jié)果也均為無耐藥突變，已按照敏感肺結(jié)核進(jìn)行治療，并取得了理想的治療效果，這進(jìn)一步體現(xiàn)了熒光PCR熔解曲線法快速檢測結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)耐藥性的重要臨床價值。

本研究尚存在一些不足之處。沒有將納入研究的樣本進(jìn)行測序，導(dǎo)致無法進(jìn)一步證實熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變，而比例法藥敏試驗檢測為敏感的樣本是否發(fā)生低度耐藥突變。此外，本研究為回顧性研究，在患者選擇方面存在一定偏倚，排除了某些因含菌量少而無法獲得實驗結(jié)果的患者，從而對評價結(jié)果造成一定的影響。

綜上所述，本研究通過直接檢測痰液樣本，并與藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，證明熒光PCR熔解曲線法可以快速檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx和Mfx的耐藥性，且其檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果高度一致，對臨床判斷結(jié)核分枝桿菌耐藥類型和制定合理的化療方案具有重要價值。