金龍 田琦 張寶慶 邢海冬 高明霞 張秀英 王利華 張曉磊
氟喹諾酮類藥物是治療耐藥結(jié)核病的重要藥物,然而近年來,結(jié)核分枝桿菌對這類藥物的耐藥率逐漸增加[1]。因此,氟喹諾酮類藥物耐藥性檢測已成為結(jié)核病臨床治療方案制定中不可或缺的依據(jù)。依賴于培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)的傳統(tǒng)耐藥性檢測方法至少需要6~8周才能得到結(jié)果,極易延誤病情。分子藥敏試驗技術(shù)的發(fā)展克服了傳統(tǒng)表型藥敏試驗檢測時間長的缺點(diǎn)[2]。其中,熒光PCR熔解曲線法通過對結(jié)核分枝桿菌的gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增,并設(shè)計特異探針檢測氟喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(gyrA88~94密碼子),可以在2.5 h內(nèi)得出氟喹諾酮類藥物耐藥信息,是目前快速檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥性的新型分子生物學(xué)方法之一[3]。目前,關(guān)于熒光PCR探針熔解曲線法檢測氟喹諾酮類藥物耐藥的臨床研究較少,特別是同時針對左氧氟沙星(levofloxacin,Lfx)和莫西沙星(moxifloxacin,Mfx)的研究數(shù)據(jù)較為匱乏。本研究就2018年11月至2019年12月在黑龍江省傳染病防治院經(jīng)熒光PCR熔解曲線法,以及BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)聯(lián)合藥敏試驗兩種方法臨床確診的耐多藥肺結(jié)核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis,MDR-PTB)患者進(jìn)行分析,探討熒光PCR熔解曲線法快速檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx和Mfx耐藥性的臨床價值。
收集2018年11月至2019年12月黑龍江省傳染病防治院經(jīng)過熒光PCR熔解曲線法篩查,并經(jīng)BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗確診為MDR-PTB患者的痰液樣本。研究期間本院收治符合條件的患者共計195例,均為復(fù)治患者,其中男性112例,女性83例;年齡17~78歲,平均年齡(45.0±11.5)歲。
1. 結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提?。菏占降奶狄簶颖揪捎脧B門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的Lab-Aid 824S核酸自動提取儀進(jìn)行基因組DNA的提取,嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作。
2. 熒光PCR熔解曲線法:(1)操作方法:嚴(yán)格按照廈門致善生物科技股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥突變檢測試劑盒(熒光PCR熔解曲線法)說明書進(jìn)行實驗操作。(2)結(jié)果判定方法:通過比較所檢測樣本與陽性對照樣本之間熔解曲線的熔點(diǎn)(Tm值)的差異判斷樣本是否發(fā)生突變:樣本的熔點(diǎn)與陽性對照的熔點(diǎn)一致(誤差不超過1 ℃)時判定為野生型,待檢樣本對氟喹諾酮類藥物敏感;樣本的熔點(diǎn)低于陽性對照2 ℃及以上時(△Tm≥2 ℃)判定為突變型,待檢樣本對氟喹諾酮類藥物耐藥。
3. 分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏試驗方法:應(yīng)用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)對收集的肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本進(jìn)行快速培養(yǎng),再對培養(yǎng)陽性的標(biāo)本進(jìn)行比例法藥敏試驗,包括Lfx和Mfx兩種藥品。藥物敏感性檢測試劑購于珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司,臨界濃度分別為2.0 μg/ml和0.25 μg/ml。所有操作均嚴(yán)格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[4]和試劑或設(shè)備說明書進(jìn)行。整個檢測過程需要2~3個月。
本課題組人員均進(jìn)行過嚴(yán)格的項目啟動培訓(xùn),掌握實施方案。項目實施過程中嚴(yán)格按照實施方案標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行患者納入、表格登記、實驗操作、結(jié)果判斷等。結(jié)核病實驗室每天做好相關(guān)儀器設(shè)備的維護(hù)保養(yǎng),在實驗操作過程中嚴(yán)格做好實驗室質(zhì)量控制。
采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。以比例法藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn),計算熒光PCR熔解曲線法的敏感度、特異度、一致率和Kappa值。Kappa值在0.00~0.20為極低一致;Kappa值在0.21~0.40為一般一致;Kappa值在0.41~0.60為中等一致;Kappa值在0.61~0.80為高度一致;Kappa值在0.81~1.00為完全一致。
195株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)熒光PCR熔解曲線法檢測,有114株發(fā)生gyrA基因突變,81株未發(fā)生突變。
195株結(jié)核分枝桿菌經(jīng)比例法藥敏試驗檢測,Lfx耐藥90株,敏感105株,Lfx總耐藥率為46.15%(90/195);Mfx耐藥95株,敏感100株,Mfx總耐藥率為48.72%(95/195)。
以比例法藥敏試驗結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度為95.56%,特異度為73.33%,一致率為83.59%,Kappa值為0.83;檢測結(jié)核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度為95.79%,特異度為77.00%,一致率為86.15%,Kappa值為0.85。見表1。
表1 熒光PCR熔解曲線法檢測195株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星和莫西沙星耐藥性的效能
熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)果與比例法藥敏試驗結(jié)果不一致的樣本共有32株,其中,28株藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變,4株藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變。對于藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變的28例患者,均已根據(jù)分子診斷結(jié)果進(jìn)行個體化用藥,均已臨床治愈;另外4例藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變的患者,已按照敏感肺結(jié)核進(jìn)行治療,均已臨床治愈。
耐藥結(jié)核病,尤其是耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)是結(jié)核病防治領(lǐng)域的兩大難題[5-7]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的推薦意見,以及藥物的有效性、安全性和可及性,二線抗結(jié)核藥物氟喹諾酮類藥物中的Lfx和Mfx可以作為耐藥結(jié)核病治療的首選藥物[8]。傳統(tǒng)的表型藥敏試驗檢測方法需要進(jìn)行痰培養(yǎng),周期往往長達(dá)4~8周,無法及時指導(dǎo)臨床用藥[4]?;诖?,若能實現(xiàn)痰液直接檢測,快速診斷出氟喹諾酮類藥物耐藥的患者,將有助于醫(yī)生選擇用藥方案,可以成為減少耐藥結(jié)核病流行和提高M(jìn)DR-TB和XDR-TB治療成功率的可靠保證[9]。
近年來,隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的發(fā)展,結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因的分子檢測方法被廣泛應(yīng)用于耐藥結(jié)核病的臨床診斷中[10]。目前市面上大多數(shù)商業(yè)試劑盒只能檢測一線抗結(jié)核藥物的耐藥性,如賽沛公司的GeneXpert MTB/RIF試劑盒只能檢測利福平一種藥品的耐藥情況[11],成都博奧晶芯生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒(DNA微陣列芯片法)只能檢測利福平和異煙肼兩種一線抗結(jié)核藥品的耐藥情況[12];德國Hain Lifescience GmbH公司的GenoType MTBDRsl試劑盒雖然可以對MDR-TB患者進(jìn)行氟喹諾酮類藥物和二線注射類藥物的耐藥突變檢測[13],但是該試劑需要PCR后進(jìn)行處理,操作復(fù)雜,極易造成污染,導(dǎo)致假陽性。與以上這些試劑盒相比,熒光PCR熔解曲線法能同時檢測4種一線抗結(jié)核藥物(包括利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素)和氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)的耐藥情況,并有多項研究表明,其具有敏感度高、特異度強(qiáng)、簡便快速、閉管檢測(無需PCR后處理)等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于臨床結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測[14-17]。
本研究結(jié)果顯示,以比例法藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn),熒光PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx耐藥性的敏感度為95.56%,特異度為73.33%,一致率為83.59%;檢測結(jié)核分枝桿菌對Mfx耐藥性的敏感度為95.79%,特異度為77.00%,一致率為86.15%。采用相同的檢測方法,李國利等[14]研究檢測Lfx的敏感度為97.01%,特異度為99.55%,一致率為99.21%;曹志華等[17]研究檢測氟喹諾酮類藥物的敏感度為93.75%,特異度為96.35%,一致率為96.08%;蔚鳴等[18]研究檢測Lfx的敏感度為92.65%,特異度為95.81%,一致率為94.89%;檢測Mfx的敏感度為87.50%,特異度為76.78%,一致率為77.87%。本研究檢測Mfx的特異度與蔚鳴等[18]的研究一致,但低于曹志華等[17]的研究;檢測Lfx的特異度均低于上述研究,分析其原因,可能包括以下幾點(diǎn)。
1. 痰液樣本在培養(yǎng)后的細(xì)菌比例可能會發(fā)生變化,導(dǎo)致檢測不同樣本類型的特異度存在差異。李國利等[14]和曹志華等[17]的研究中,熒光PCR熔解曲線法檢測的樣本類型均為結(jié)核分枝桿菌臨床分離株,而本研究檢測的是痰液樣本。已有研究報道,在發(fā)生氟喹諾酮類藥物耐藥突變的樣本中,同時含有敏感菌和耐藥菌的樣本比例高達(dá)23%[19],痰液樣本在液化處理的過程中,部分細(xì)菌失去活性,在同時含有敏感菌和低比例耐藥菌的樣本中,少量耐藥菌的活性進(jìn)一步下降,導(dǎo)致在培養(yǎng)的過程中耐藥菌沒有被培養(yǎng)出來,該樣本被錯誤地判定為敏感。熒光PCR熔解曲線法檢測的是結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA序列,與細(xì)菌的活性無關(guān)。因此,在上述這種情況下,樣本的耐藥突變菌株會被檢測出來,判讀為耐藥突變。此外,樣本經(jīng)過培養(yǎng)后細(xì)菌含量及比例可能會發(fā)生變化,影響藥敏試驗結(jié)果。而以上2個研究檢測的是菌株樣本,不存在直接檢測痰液樣本所導(dǎo)致的問題。
2. 培養(yǎng)方法的不同可能會導(dǎo)致比例法藥敏試驗的結(jié)果存在差異。本研究與李國利等[14]和曹志華等[17]的研究在培養(yǎng)方法和比例法藥敏試驗的操作方面有所差異,導(dǎo)致特異度偏低。以上2個研究的培養(yǎng)方法為固體培養(yǎng)法,而本研究采用的是BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)法,對藥敏試驗結(jié)果判定會有一定的影響。gyrA基因中的部分突變類型,例如G88A、D89N、A90V、S91P、D94A等僅能引起較低的耐藥水平[20-21],當(dāng)菌株處于耐藥與敏感的臨界水平時,在進(jìn)行比例法藥敏試驗過程當(dāng)中,若采用的培養(yǎng)方法有所差異、操作人員存在實驗操作上的偏差,或者藥物濃度稍有偏差,有可能造成原本低度耐藥的菌株被判定為敏感,而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變。因此,以藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn),以上的差異會導(dǎo)致本研究中熒光PCR熔解曲線法的特異度偏低。
3. 臨界藥物濃度選擇可能會影響臨界菌株的藥敏試驗結(jié)果。處于耐藥與敏感臨界水平的菌株,對其藥物敏感性的判斷,往往與藥物的臨界濃度相關(guān)。本研究所采用的兩種藥物的臨界濃度不一定為最佳臨界濃度,這可能也是導(dǎo)致本研究中熒光PCR熔解曲線法相比以上3個研究特異度偏低的原因之一,尤其是與蔚鳴等[18]的研究相比,本研究與其在上述兩個原因方面均不存在明顯差異,臨界濃度的差異可能是兩者特異度相差較大的主要原因。
但總體上看,即使本研究檢測的樣本為痰液樣本,熒光PCR熔解曲線法依然具備良好的檢測效果,與培養(yǎng)結(jié)果有極高的一致性,為該方法直接檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況提供了科學(xué)依據(jù)。
本次研究共發(fā)現(xiàn)32份兩種方法檢測結(jié)果不一致的樣本,經(jīng)過病歷信息查詢,對于藥敏試驗檢測為敏感而熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變的28例患者,均已根據(jù)分子診斷結(jié)果進(jìn)行了個體化用藥,并且均已臨床治愈;而另外4例藥敏試驗檢測為耐藥而熒光PCR熔解曲線法檢測為無耐藥突變的患者,由于對利福平和異煙肼的分子診斷結(jié)果也均為無耐藥突變,已按照敏感肺結(jié)核進(jìn)行治療,并取得了理想的治療效果,這進(jìn)一步體現(xiàn)了熒光PCR熔解曲線法快速檢測結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物(Lfx和Mfx)耐藥性的重要臨床價值。
本研究尚存在一些不足之處。沒有將納入研究的樣本進(jìn)行測序,導(dǎo)致無法進(jìn)一步證實熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥突變,而比例法藥敏試驗檢測為敏感的樣本是否發(fā)生低度耐藥突變。此外,本研究為回顧性研究,在患者選擇方面存在一定偏倚,排除了某些因含菌量少而無法獲得實驗結(jié)果的患者,從而對評價結(jié)果造成一定的影響。
綜上所述,本研究通過直接檢測痰液樣本,并與藥敏試驗標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比,證明熒光PCR熔解曲線法可以快速檢測結(jié)核分枝桿菌對Lfx和Mfx的耐藥性,且其檢測結(jié)果與藥敏試驗結(jié)果高度一致,對臨床判斷結(jié)核分枝桿菌耐藥類型和制定合理的化療方案具有重要價值。