劉媛 陳潔 孫輝 劉幸 劉夢醒 李池川 楊柏榮 楊敏

肺結(jié)核屬于中醫(yī)“肺癆”“癆瘵”范疇，中醫(yī)治療肺結(jié)核歷史悠久，目前應用廣泛的有八珍散、血府逐瘀湯、芩桂術(shù)甘湯、結(jié)核丸等經(jīng)典方及多個驗方[1]。中藥在肺結(jié)核的治療上有著顯著的臨床療效，積累了大量的臨床數(shù)據(jù)。但中醫(yī)治療肺結(jié)核至今仍缺乏大規(guī)模的數(shù)據(jù)整理，沒有充足的現(xiàn)代科學理論支撐。此外，中藥復方由君臣佐使多種藥物構(gòu)成，配伍靈活，且中藥成分復雜，使得中藥治療肺結(jié)核的機制十分復雜，有待進行更深入的探究。

數(shù)據(jù)挖掘是運用現(xiàn)代信息技術(shù)對已有數(shù)據(jù)進行處理，探索用藥規(guī)律，最終反饋于臨床，幫助靶向治療疾病，目前已有諸多學者將其應用于中藥領(lǐng)域[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學可為中藥多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)、整體網(wǎng)絡(luò)等多角度的研究提供技術(shù)支撐，有利于從分子生物學網(wǎng)絡(luò)視角揭示中藥的作用機制，闡明其科學內(nèi)涵[3-5]。中國在肺結(jié)核防治等方面的臨床數(shù)據(jù)呈幾何級數(shù)增長，借助數(shù)據(jù)技術(shù)手段能有效利用這些臨床數(shù)據(jù)。本研究通過數(shù)據(jù)挖掘歸納治療肺結(jié)核的中藥復方，分析用藥規(guī)律，尋找治療肺結(jié)核的核心藥對。并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學的方法，篩選核心藥對治療肺結(jié)核的潛在靶點，通過基因本體論(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)通路富集分析，探究核心藥對治療肺結(jié)核的關(guān)鍵靶點及作用機制，為臨床應用及后期組方用藥提供新的思路及理論依據(jù)。

資料和方法

一、數(shù)據(jù)挖掘

1. 數(shù)據(jù)來源：檢索萬方、中國知網(wǎng)、維普、PubMed等數(shù)據(jù)庫2014年1月至2021年2月的文獻，以“肺結(jié)核”“肺癆”“臨床”“中藥”“中醫(yī)”“pulmonary tuberculosis” “pulmonary” “medicine” “traditional Chinese medicine”等為關(guān)鍵詞，排除綜述文獻、重復文獻、干預措施不符合的文獻，由雙人負責數(shù)據(jù)的審核，確保數(shù)據(jù)的準確性。最終納入文獻156篇，處方206個。

2. 數(shù)據(jù)收集：采用雙人核對模式錄入原始數(shù)據(jù)，參照《中華人民共和國藥典》[6]和《中藥學》[7]將文獻中出現(xiàn)的藥物名稱進行規(guī)范，同時對數(shù)據(jù)進行預處理，建立原始數(shù)據(jù)庫。

3. 數(shù)據(jù)分析：應用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行頻次分析，統(tǒng)計高頻藥物，初步分析肺結(jié)核的用藥規(guī)律。運用IBM SPSS Modeler 14.1軟件進行藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最低支持度為10%，最小規(guī)則置信度為60%，最大前項數(shù)為5，挖掘核心藥物群。

二、網(wǎng)絡(luò)藥理學

通過中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選核心藥對的化學成分，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選建立核心藥對的化學成分及其作用靶點蛋白數(shù)據(jù)庫。使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“pulmonary tuberculosis”為關(guān)鍵詞，檢索出肺結(jié)核的潛在靶點，并利用Venny 2.1軟件將藥物靶點與疾病靶點進行映射，獲得核心藥對治療肺結(jié)核的潛在作用靶點。利用String 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。將String 11.0數(shù)據(jù)庫中的保留節(jié)點(node1和node2)和結(jié)合率評分(combine score)信息，并導入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點相關(guān)的拓撲參數(shù)。通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)將潛在作用靶點進行GO功能富集分析，分析包括生物過程(biological process)、細胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)，以錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate)≤0.05為閾值，將其按-log(P)值升序進行排序，對排名前15的結(jié)果進行可視化處理。將潛在作用靶點導入Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html)進行KEGG通路富集分析?；谒幬?成分-靶點-信號通路，將上述得到的核心靶點和KEGG通路富集分析的結(jié)果所選取的主要信號通路建立聯(lián)系，并與“成分-靶點”間相互作用關(guān)系整合并導入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié) 果

一、基于用藥頻數(shù)的組分規(guī)律分析

經(jīng)過整理，共納入206個處方，涉及中藥272味，總頻次為2657次。頻次排名前5位的中藥為百部、麥冬、黃芪、白及、地黃，涉及化痰止咳平喘藥、補虛藥、止血藥、清熱藥等，符合肺結(jié)核中醫(yī)常見證候(肺陰虛、陰虛火旺、氣陰兩虛)的治法[8]。詳見表1。

二、基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組分規(guī)律分析

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示，白及-百部關(guān)聯(lián)性支持度最高，與其他高頻藥物的關(guān)聯(lián)均較為緊密，且用藥頻率最高，提示“白及-百部”為治療肺結(jié)核的核心藥對。詳見表2，圖1。

表2 治療肺結(jié)核頻數(shù)前20位中藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則

圖1 治療肺結(jié)核頻數(shù)前20位中藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則圖

三、白及-百部藥對所含化學成分篩選及靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索核心藥對“白及-百部”的化學成分，篩選得到41個化學成分，其中白及9個化學成分，百部32個化學成分。共預測到靶基因113個。各有效成分的口服生物利用度和類藥性值見表3。

表3 白及-百部有效化學成分

續(xù)表3

四、肺結(jié)核相關(guān)靶點的篩選

從數(shù)據(jù)庫中檢索獲得治療肺結(jié)核的靶點1675個。根據(jù)經(jīng)驗設(shè)定評分大于中位數(shù)的目標靶點為肺結(jié)核的潛在靶點，評分最大值為66.73，最小值為0.17，中位數(shù)為2.78，故設(shè)定評分>2.78的靶點為肺結(jié)核的潛在靶點，最終得到837個相關(guān)靶點。

五、白及-百部藥對治療肺結(jié)核潛在靶點預測

通過VENNY2.1軟件將白及-百部化學成分靶點與肺結(jié)核靶點進行映射，獲得核心藥對治療肺結(jié)核的潛在作用靶點30個。見圖2。

注 左側(cè)代表白及-百部化學成分靶點；右側(cè)代表肺結(jié)核靶點；重疊部分為共同靶點圖2 白及-百部藥對靶點與肺結(jié)核靶點韋恩圖

六、白及-百部藥對治療肺結(jié)核的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用String數(shù)據(jù)庫對白及-百部治療肺結(jié)核潛在靶點進行靶標蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見圖3。有6個靶點因為沒有與網(wǎng)絡(luò)相聯(lián)系，故剔除。其中得分前10位的靶點基因分別為CASP8、FAS、CASP3、BCL2、MAPK14、JUN、CASP9、NR3C1、PPARG、SIRT1，表明這些靶點在白及-百部藥對治療肺結(jié)核的作用機制中具有重要意義。

圖3 白及-百部藥對治療肺結(jié)核的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

七、白及-百部藥對治療肺結(jié)核靶點的GO和KEGG通路富集分析

GO分析結(jié)果顯示，生物過程主要涉及缺乏配體的外源性凋亡信號通路(extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)、對藥物的反應(response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、凋亡過程(apoptotic process)等。細胞組成主要包括死亡誘導信號復合體(death-inducing signaling complex)、細胞核(nucleus)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、細胞質(zhì)(cytosol)等。分子功能主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)、參與細胞凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)等。見圖4。

圖4 白及-百部藥對治療肺結(jié)核作用靶點的GO分析結(jié)果

為進一步探究白及-百部藥對治療肺結(jié)核在生物信號通路層面的機制，將潛在作用靶點與KEGG通路進行映射，根據(jù)P值篩選出排名前20的通路，分別為癌癥相關(guān)通路(pathways in cancer，14個靶點)、乙型肝炎(hepatitis B，10個靶點)、結(jié)核病(tuberculosis，10個靶點)、大腸癌(colorectal cancer，7個靶點)、凋亡(apoptosis，6個靶點)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway，8個靶點)、TNF信號通路(TNF signaling pathway，6個靶點)等。具體分析結(jié)果見圖5。

圖5 白及-百部藥對治療肺結(jié)核作用靶點的KEGG富集分析結(jié)果

由上述KEGG富集結(jié)果分析可知，白及-百部藥對在結(jié)核病通路上的主要作用靶點為CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1、TGFB1，這表明白及-百部藥對可能通過影響細胞凋亡、宿主免疫等發(fā)揮治療肺結(jié)核的作用。見圖6。

注 粉色代表白及-百部活性靶點；綠色代表白及-百部非活性靶點圖6 結(jié)核病信號通路

八、白及-百部藥對成分-靶點-信號通路構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7軟件構(gòu)建“白及-百部”藥對成分-作用靶點-代謝通路網(wǎng)絡(luò)。圖中包括白及和百部化學成分41種；白及-百部治療肺結(jié)核潛在靶點24個；信號通路20條。篩選出白及-百部化學成分的作用靶點分布在不同的信號通路，相互協(xié)調(diào)，通過調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮治療肺結(jié)核的作用，結(jié)果見圖7。成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)顯示，預測出白及-百部治療肺結(jié)核的41種潛在活性成分與CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1及TGFB1等靶點存在較強的相互作用，通過KEGG富集分析顯示這些靶點主要集中在癌癥、乙型肝炎、結(jié)核病、凋亡、MAPK、TNF等相關(guān)信號通路(P值均<0.01)。白及-百部藥對成分-靶點-信號通路圖體現(xiàn)了中藥通過多成分-多靶點-多途徑治療疾病的特點。

注 左側(cè)圖內(nèi)側(cè)為白及-百部有效成分，外側(cè)為靶點；右側(cè)圖為通路圖7 白及-百部治療肺結(jié)核成分-靶點-信號通路

討 論

肺結(jié)核屬于中醫(yī)學“肺癆”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》記載：“大骨枯槁，大肉陷下，胸中氣滿，喘息不便，內(nèi)痛引肩頸，身熱”。華佗《中藏經(jīng)·傳尸》記載“鐘此病死之氣，染而為疾，故曰傳尸也”[9]。中醫(yī)治療肺結(jié)核歷史悠久，具有顯著優(yōu)勢。中藥治療肺結(jié)核具有增強機體抗病能力、調(diào)節(jié)免疫功能、減毒增效等優(yōu)勢，但鮮有研究報道治療肺結(jié)核的中藥組方用藥規(guī)律分析。其次，中藥的有效成分及中藥作用的“靶點”研究不甚明確，中藥治療耐藥肺結(jié)核的作用機制需要進一步深入研究。

本研究檢索自2014年以來中藥治療肺結(jié)核的臨床文獻，通過對使用中藥進行頻數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)使用頻數(shù)較高的中藥為百部、麥冬、黃芪、白及、地黃，涉及化痰止咳平喘藥、補虛藥、止血藥、清熱藥等。中醫(yī)認為肺結(jié)核的病位為肺，肺主宣發(fā)與肅降，肺的功能失常，則水濕內(nèi)停，聚而成痰，配伍化痰止咳藥以化痰降氣益肺。肺結(jié)核的病機多為陰虛、氣虛、血虛，兼有內(nèi)燥、痰咳，因而運用補益氣血、養(yǎng)陰生津，兼用疏風清熱、宣肺止咳之藥。通過關(guān)聯(lián)規(guī)則分析以期尋找關(guān)聯(lián)性最高的核心藥對，綜合各項指標后選擇“白及-百部”為中藥治療肺結(jié)核的核心藥對。其次為“地黃-麥冬”“百部-麥冬”“百部-黃芪”“麥冬-黃芪”，提示臨床用藥時應注重白及、百部、地黃、麥冬、黃芪等藥物之間的配伍。臨床常用白及、百部治療咳喘、慢性支氣管炎、肺結(jié)核等疾病。研究顯示，白及、百部對肺結(jié)核患者肺空洞及痰菌陰轉(zhuǎn)具有顯著療效，特別是咯血患者，能明顯縮短咯血時間[10-12]。

運用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法進一步探究核心藥對“白及-百部”治療肺結(jié)核的作用機制。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出41個活性成分及113個靶點，與肺結(jié)核疾病靶點映射后，得到交集靶點30個。KEGG通路富集結(jié)果表明，白及-百部治療肺結(jié)核預測靶點主要富集在結(jié)核病、癌癥、乙型肝炎、大腸癌、凋亡、MAPK、TNF等相關(guān)信號通路上，這些通路與肺結(jié)核的其他相關(guān)研究相似，側(cè)面證明了本研究的可靠性[13]。通過以上分析，本研究預測“白及-百部”治療肺結(jié)核的作用機制可能是通過作用于結(jié)核病通路上的Caspase-8(CASP8)、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1、TGFB1等關(guān)鍵靶點發(fā)揮療效。

Caspase家族作為一種半胱天冬蛋白酶，在凋亡的信號轉(zhuǎn)導和效應過程中起重要作用。在肺結(jié)核的關(guān)鍵通路巨噬細胞/樹突狀細胞通路中，CASP8通過特異性Caspase裂解位點處裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活。CASP8還參與了Bcl-2家族成員Bid的切割。切割后的Bid易位到線粒體，在那里它與Bcl-2家族成員Bcl-2(一種抗凋亡蛋白)和Bax(一種促凋亡蛋白)相互作用，介導細胞色素C(cytochrome c)的釋放和Caspase-9的激活。通過以上兩條途徑作用于Caspase-3蛋白，執(zhí)行剪切細胞結(jié)構(gòu)蛋白的作用，直接使細胞發(fā)生凋亡[14-16]。T細胞介導的免疫應答也是結(jié)核分枝桿菌感染的重要因素，IL-10作為Th2型細胞因子，與肺結(jié)核的易感性相關(guān)。IL-10的存在導致了抗原呈遞替代處理途徑的缺失，并下調(diào)來自健康個體的單核細胞和巨噬細胞的共刺激分子表達，從而損害細菌清除和誘導長期的肺結(jié)核感染[17-18]。結(jié)核分枝桿菌誘導的肺泡巨噬細胞能夠產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，這些細胞因子與T細胞產(chǎn)生的IFN-γ可以通過一氧化氮合酶的作用誘導產(chǎn)生一氧化氮[19-20]。有研究表明，結(jié)核病患者肺泡巨噬細胞表達的NOS2具有潛在的殺死結(jié)核分枝桿菌的能力，而且這種NOS2在體外可以殺死結(jié)核分枝桿菌[21]。中性多形核白細胞是宿主抵御外界病原體的第一道防線，TLR 2參與了結(jié)核病患者外周血中性粒細胞PMN凋亡，P38(又名MAPK14)蛋白激酶與可作用于Toll樣受體的信號傳導[22]。Raf-1是一組異質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與正常細胞生長和致癌轉(zhuǎn)化的許多信號通路的核心成分。Raf-1磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(MEK)，進而激活絲裂原活化的蛋白激酶/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERKs)，導致信號的傳播。Raf-1-MEK-ERK級聯(lián)調(diào)節(jié)多種細胞過程，如增殖、分化和凋亡[23]。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌與樹突狀細胞相互作用以激活Raf-1-乙?；蕾囆孕盘杺鲗緩剑瑥亩{(diào)節(jié)不同TLR的信號傳導，參與結(jié)核分枝桿菌的適應性調(diào)節(jié)[24]。另有研究表明，小兒肺結(jié)核患者的外周血單個核細胞中RAF1的mRNA和蛋白水平上調(diào)[25]。轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β是免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的重要促進因子。肺結(jié)核治療后肺纖維化患者TGF-β水平明顯升高[26]，抗TGF-β抗體與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相結(jié)合可能增強T細胞功能，促進免疫系統(tǒng)有效清除結(jié)核分枝桿菌[27]。

本研究將數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學方法相結(jié)合，整合中藥治療肺結(jié)核的臨床大數(shù)據(jù)規(guī)律，挖掘出核心藥對“白及-百部”，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學手段揭示核心藥對潛在關(guān)鍵靶點、通路及它們的相互作用。本研究將有助于揭示中醫(yī)藥治療肺結(jié)核的科學內(nèi)涵，為結(jié)核病的治療機制提供思路。