劉媛 陳潔 孫輝 劉幸 劉夢(mèng)醒 李池川 楊柏榮 楊敏

肺結(jié)核屬于中醫(yī)“肺癆”“癆瘵”范疇，中醫(yī)治療肺結(jié)核歷史悠久，目前應(yīng)用廣泛的有八珍散、血府逐瘀湯、芩桂術(shù)甘湯、結(jié)核丸等經(jīng)典方及多個(gè)驗(yàn)方[1]。中藥在肺結(jié)核的治療上有著顯著的臨床療效，積累了大量的臨床數(shù)據(jù)。但中醫(yī)治療肺結(jié)核至今仍缺乏大規(guī)模的數(shù)據(jù)整理，沒(méi)有充足的現(xiàn)代科學(xué)理論支撐。此外，中藥復(fù)方由君臣佐使多種藥物構(gòu)成，配伍靈活，且中藥成分復(fù)雜，使得中藥治療肺結(jié)核的機(jī)制十分復(fù)雜，有待進(jìn)行更深入的探究。

數(shù)據(jù)挖掘是運(yùn)用現(xiàn)代信息技術(shù)對(duì)已有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，探索用藥規(guī)律，最終反饋于臨床，幫助靶向治療疾病，目前已有諸多學(xué)者將其應(yīng)用于中藥領(lǐng)域[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可為中藥多成分、多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、整體網(wǎng)絡(luò)等多角度的研究提供技術(shù)支撐，有利于從分子生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)視角揭示中藥的作用機(jī)制，闡明其科學(xué)內(nèi)涵[3-5]。中國(guó)在肺結(jié)核防治等方面的臨床數(shù)據(jù)呈幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)，借助數(shù)據(jù)技術(shù)手段能有效利用這些臨床數(shù)據(jù)。本研究通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘歸納治療肺結(jié)核的中藥復(fù)方，分析用藥規(guī)律，尋找治療肺結(jié)核的核心藥對(duì)。并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選核心藥對(duì)治療肺結(jié)核的潛在靶點(diǎn)，通過(guò)基因本體論(gene ontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopediaof genes and genomes，KEGG)通路富集分析，探究核心藥對(duì)治療肺結(jié)核的關(guān)鍵靶點(diǎn)及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用及后期組方用藥提供新的思路及理論依據(jù)。

資料和方法

一、數(shù)據(jù)挖掘

1. 數(shù)據(jù)來(lái)源：檢索萬(wàn)方、中國(guó)知網(wǎng)、維普、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)2014年1月至2021年2月的文獻(xiàn)，以“肺結(jié)核”“肺癆”“臨床”“中藥”“中醫(yī)”“pulmonary tuberculosis” “pulmonary” “medicine” “traditional Chinese medicine”等為關(guān)鍵詞，排除綜述文獻(xiàn)、重復(fù)文獻(xiàn)、干預(yù)措施不符合的文獻(xiàn)，由雙人負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的審核，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。最終納入文獻(xiàn)156篇，處方206個(gè)。

2. 數(shù)據(jù)收集：采用雙人核對(duì)模式錄入原始數(shù)據(jù)，參照《中華人民共和國(guó)藥典》[6]和《中藥學(xué)》[7]將文獻(xiàn)中出現(xiàn)的藥物名稱進(jìn)行規(guī)范，同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，建立原始數(shù)據(jù)庫(kù)。

3. 數(shù)據(jù)分析：應(yīng)用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行頻次分析，統(tǒng)計(jì)高頻藥物，初步分析肺結(jié)核的用藥規(guī)律。運(yùn)用IBM SPSS Modeler 14.1軟件進(jìn)行藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最低支持度為10%，最小規(guī)則置信度為60%，最大前項(xiàng)數(shù)為5，挖掘核心藥物群。

二、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選核心藥對(duì)的化學(xué)成分，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選建立核心藥對(duì)的化學(xué)成分及其作用靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)。使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)以“pulmonary tuberculosis”為關(guān)鍵詞，檢索出肺結(jié)核的潛在靶點(diǎn)，并利用Venny 2.1軟件將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得核心藥對(duì)治療肺結(jié)核的潛在作用靶點(diǎn)。利用String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。將String 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)中的保留節(jié)點(diǎn)(node1和node2)和結(jié)合率評(píng)分(combine score)信息，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.0軟件，分析靶點(diǎn)相關(guān)的拓?fù)鋮?shù)。通過(guò)DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov)將潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，分析包括生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)、分子功能(molecular function)，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate)≤0.05為閾值，將其按-log(P)值升序進(jìn)行排序，對(duì)排名前15的結(jié)果進(jìn)行可視化處理。將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index.html)進(jìn)行KEGG通路富集分析?；谒幬?成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路，將上述得到的核心靶點(diǎn)和KEGG通路富集分析的結(jié)果所選取的主要信號(hào)通路建立聯(lián)系，并與“成分-靶點(diǎn)”間相互作用關(guān)系整合并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，從而得到成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

結(jié) 果

一、基于用藥頻數(shù)的組分規(guī)律分析

經(jīng)過(guò)整理，共納入206個(gè)處方，涉及中藥272味，總頻次為2657次。頻次排名前5位的中藥為百部、麥冬、黃芪、白及、地黃，涉及化痰止咳平喘藥、補(bǔ)虛藥、止血藥、清熱藥等，符合肺結(jié)核中醫(yī)常見(jiàn)證候(肺陰虛、陰虛火旺、氣陰兩虛)的治法[8]。詳見(jiàn)表1。

二、基于關(guān)聯(lián)規(guī)則的組分規(guī)律分析

關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果顯示，白及-百部關(guān)聯(lián)性支持度最高，與其他高頻藥物的關(guān)聯(lián)均較為緊密，且用藥頻率最高，提示“白及-百部”為治療肺結(jié)核的核心藥對(duì)。詳見(jiàn)表2，圖1。

表2 治療肺結(jié)核頻數(shù)前20位中藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則

圖1 治療肺結(jié)核頻數(shù)前20位中藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則圖

三、白及-百部藥對(duì)所含化學(xué)成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索核心藥對(duì)“白及-百部”的化學(xué)成分，篩選得到41個(gè)化學(xué)成分，其中白及9個(gè)化學(xué)成分，百部32個(gè)化學(xué)成分。共預(yù)測(cè)到靶基因113個(gè)。各有效成分的口服生物利用度和類藥性值見(jiàn)表3。

表3 白及-百部有效化學(xué)成分

續(xù)表3

四、肺結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲得治療肺結(jié)核的靶點(diǎn)1675個(gè)。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)定評(píng)分大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為肺結(jié)核的潛在靶點(diǎn)，評(píng)分最大值為66.73，最小值為0.17，中位數(shù)為2.78，故設(shè)定評(píng)分>2.78的靶點(diǎn)為肺結(jié)核的潛在靶點(diǎn)，最終得到837個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

五、白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)VENNY2.1軟件將白及-百部化學(xué)成分靶點(diǎn)與肺結(jié)核靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得核心藥對(duì)治療肺結(jié)核的潛在作用靶點(diǎn)30個(gè)。見(jiàn)圖2。

注 左側(cè)代表白及-百部化學(xué)成分靶點(diǎn)；右側(cè)代表肺結(jié)核靶點(diǎn)；重疊部分為共同靶點(diǎn)圖2 白及-百部藥對(duì)靶點(diǎn)與肺結(jié)核靶點(diǎn)韋恩圖

六、白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)白及-百部治療肺結(jié)核潛在靶點(diǎn)進(jìn)行靶標(biāo)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見(jiàn)圖3。有6個(gè)靶點(diǎn)因?yàn)闆](méi)有與網(wǎng)絡(luò)相聯(lián)系，故剔除。其中得分前10位的靶點(diǎn)基因分別為CASP8、FAS、CASP3、BCL2、MAPK14、JUN、CASP9、NR3C1、PPARG、SIRT1，表明這些靶點(diǎn)在白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核的作用機(jī)制中具有重要意義。

圖3 白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

七、白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核靶點(diǎn)的GO和KEGG通路富集分析

GO分析結(jié)果顯示，生物過(guò)程主要涉及缺乏配體的外源性凋亡信號(hào)通路(extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)、對(duì)藥物的反應(yīng)(response to drug)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、凋亡過(guò)程(apoptotic process)等。細(xì)胞組成主要包括死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(death-inducing signaling complex)、細(xì)胞核(nucleus)、線粒體外膜(mitochondrial outer membrane)、細(xì)胞質(zhì)(cytosol)等。分子功能主要涉及酶結(jié)合(enzyme binding)、蛋白結(jié)合(protein binding)、參與細(xì)胞凋亡過(guò)程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)等。見(jiàn)圖4。

圖4 白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核作用靶點(diǎn)的GO分析結(jié)果

為進(jìn)一步探究白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核在生物信號(hào)通路層面的機(jī)制，將潛在作用靶點(diǎn)與KEGG通路進(jìn)行映射，根據(jù)P值篩選出排名前20的通路，分別為癌癥相關(guān)通路(pathways in cancer，14個(gè)靶點(diǎn))、乙型肝炎(hepatitis B，10個(gè)靶點(diǎn))、結(jié)核病(tuberculosis，10個(gè)靶點(diǎn))、大腸癌(colorectal cancer，7個(gè)靶點(diǎn))、凋亡(apoptosis，6個(gè)靶點(diǎn))、MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway，8個(gè)靶點(diǎn))、TNF信號(hào)通路(TNF signaling pathway，6個(gè)靶點(diǎn))等。具體分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 白及-百部藥對(duì)治療肺結(jié)核作用靶點(diǎn)的KEGG富集分析結(jié)果

由上述KEGG富集結(jié)果分析可知，白及-百部藥對(duì)在結(jié)核病通路上的主要作用靶點(diǎn)為CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1、TGFB1，這表明白及-百部藥對(duì)可能通過(guò)影響細(xì)胞凋亡、宿主免疫等發(fā)揮治療肺結(jié)核的作用。見(jiàn)圖6。

注 粉色代表白及-百部活性靶點(diǎn)；綠色代表白及-百部非活性靶點(diǎn)圖6 結(jié)核病信號(hào)通路

八、白及-百部藥對(duì)成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.7軟件構(gòu)建“白及-百部”藥對(duì)成分-作用靶點(diǎn)-代謝通路網(wǎng)絡(luò)。圖中包括白及和百部化學(xué)成分41種；白及-百部治療肺結(jié)核潛在靶點(diǎn)24個(gè)；信號(hào)通路20條。篩選出白及-百部化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)分布在不同的信號(hào)通路，相互協(xié)調(diào)，通過(guò)調(diào)控不同的信號(hào)通路發(fā)揮治療肺結(jié)核的作用，結(jié)果見(jiàn)圖7。成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)顯示，預(yù)測(cè)出白及-百部治療肺結(jié)核的41種潛在活性成分與CASP8、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1及TGFB1等靶點(diǎn)存在較強(qiáng)的相互作用，通過(guò)KEGG富集分析顯示這些靶點(diǎn)主要集中在癌癥、乙型肝炎、結(jié)核病、凋亡、MAPK、TNF等相關(guān)信號(hào)通路(P值均<0.01)。白及-百部藥對(duì)成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖體現(xiàn)了中藥通過(guò)多成分-多靶點(diǎn)-多途徑治療疾病的特點(diǎn)。

注 左側(cè)圖內(nèi)側(cè)為白及-百部有效成分，外側(cè)為靶點(diǎn)；右側(cè)圖為通路圖7 白及-百部治療肺結(jié)核成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路

討 論

肺結(jié)核屬于中醫(yī)學(xué)“肺癆”范疇，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)》記載：“大骨枯槁，大肉陷下，胸中氣滿，喘息不便，內(nèi)痛引肩頸，身熱”。華佗《中藏經(jīng)·傳尸》記載“鐘此病死之氣，染而為疾，故曰傳尸也”[9]。中醫(yī)治療肺結(jié)核歷史悠久，具有顯著優(yōu)勢(shì)。中藥治療肺結(jié)核具有增強(qiáng)機(jī)體抗病能力、調(diào)節(jié)免疫功能、減毒增效等優(yōu)勢(shì)，但鮮有研究報(bào)道治療肺結(jié)核的中藥組方用藥規(guī)律分析。其次，中藥的有效成分及中藥作用的“靶點(diǎn)”研究不甚明確，中藥治療耐藥肺結(jié)核的作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

本研究檢索自2014年以來(lái)中藥治療肺結(jié)核的臨床文獻(xiàn)，通過(guò)對(duì)使用中藥進(jìn)行頻數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)使用頻數(shù)較高的中藥為百部、麥冬、黃芪、白及、地黃，涉及化痰止咳平喘藥、補(bǔ)虛藥、止血藥、清熱藥等。中醫(yī)認(rèn)為肺結(jié)核的病位為肺，肺主宣發(fā)與肅降，肺的功能失常，則水濕內(nèi)停，聚而成痰，配伍化痰止咳藥以化痰降氣益肺。肺結(jié)核的病機(jī)多為陰虛、氣虛、血虛，兼有內(nèi)燥、痰咳，因而運(yùn)用補(bǔ)益氣血、養(yǎng)陰生津，兼用疏風(fēng)清熱、宣肺止咳之藥。通過(guò)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析以期尋找關(guān)聯(lián)性最高的核心藥對(duì)，綜合各項(xiàng)指標(biāo)后選擇“白及-百部”為中藥治療肺結(jié)核的核心藥對(duì)。其次為“地黃-麥冬”“百部-麥冬”“百部-黃芪”“麥冬-黃芪”，提示臨床用藥時(shí)應(yīng)注重白及、百部、地黃、麥冬、黃芪等藥物之間的配伍。臨床常用白及、百部治療咳喘、慢性支氣管炎、肺結(jié)核等疾病。研究顯示，白及、百部對(duì)肺結(jié)核患者肺空洞及痰菌陰轉(zhuǎn)具有顯著療效，特別是咯血患者，能明顯縮短咯血時(shí)間[10-12]。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)一步探究核心藥對(duì)“白及-百部”治療肺結(jié)核的作用機(jī)制。通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩選出41個(gè)活性成分及113個(gè)靶點(diǎn)，與肺結(jié)核疾病靶點(diǎn)映射后，得到交集靶點(diǎn)30個(gè)。KEGG通路富集結(jié)果表明，白及-百部治療肺結(jié)核預(yù)測(cè)靶點(diǎn)主要富集在結(jié)核病、癌癥、乙型肝炎、大腸癌、凋亡、MAPK、TNF等相關(guān)信號(hào)通路上，這些通路與肺結(jié)核的其他相關(guān)研究相似，側(cè)面證明了本研究的可靠性[13]。通過(guò)以上分析，本研究預(yù)測(cè)“白及-百部”治療肺結(jié)核的作用機(jī)制可能是通過(guò)作用于結(jié)核病通路上的Caspase-8(CASP8)、BAX、BCL2、CASP9、CASP3、IL10、NOS2、MAPK14、RAF1、TGFB1等關(guān)鍵靶點(diǎn)發(fā)揮療效。

Caspase家族作為一種半胱天冬蛋白酶，在凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和效應(yīng)過(guò)程中起重要作用。在肺結(jié)核的關(guān)鍵通路巨噬細(xì)胞/樹(shù)突狀細(xì)胞通路中，CASP8通過(guò)特異性Caspase裂解位點(diǎn)處裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活。CASP8還參與了Bcl-2家族成員Bid的切割。切割后的Bid易位到線粒體，在那里它與Bcl-2家族成員Bcl-2(一種抗凋亡蛋白)和Bax(一種促凋亡蛋白)相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C(cytochrome c)的釋放和Caspase-9的激活。通過(guò)以上兩條途徑作用于Caspase-3蛋白，執(zhí)行剪切細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的作用，直接使細(xì)胞發(fā)生凋亡[14-16]。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答也是結(jié)核分枝桿菌感染的重要因素，IL-10作為Th2型細(xì)胞因子，與肺結(jié)核的易感性相關(guān)。IL-10的存在導(dǎo)致了抗原呈遞替代處理途徑的缺失，并下調(diào)來(lái)自健康個(gè)體的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的共刺激分子表達(dá)，從而損害細(xì)菌清除和誘導(dǎo)長(zhǎng)期的肺結(jié)核感染[17-18]。結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞能夠產(chǎn)生TNF-α和IL-1β，這些細(xì)胞因子與T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ可以通過(guò)一氧化氮合酶的作用誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮[19-20]。有研究表明，結(jié)核病患者肺泡巨噬細(xì)胞表達(dá)的NOS2具有潛在的殺死結(jié)核分枝桿菌的能力，而且這種NOS2在體外可以殺死結(jié)核分枝桿菌[21]。中性多形核白細(xì)胞是宿主抵御外界病原體的第一道防線，TLR 2參與了結(jié)核病患者外周血中性粒細(xì)胞PMN凋亡，P38(又名MAPK14)蛋白激酶與可作用于Toll樣受體的信號(hào)傳導(dǎo)[22]。Raf-1是一組異質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與正常細(xì)胞生長(zhǎng)和致癌轉(zhuǎn)化的許多信號(hào)通路的核心成分。Raf-1磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(MEK)，進(jìn)而激活絲裂原活化的蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERKs)，導(dǎo)致信號(hào)的傳播。Raf-1-MEK-ERK級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，如增殖、分化和凋亡[23]。有研究表明，結(jié)核分枝桿菌與樹(shù)突狀細(xì)胞相互作用以激活Raf-1-乙?；蕾囆孕盘?hào)傳導(dǎo)途徑，從而調(diào)節(jié)不同TLR的信號(hào)傳導(dǎo)，參與結(jié)核分枝桿菌的適應(yīng)性調(diào)節(jié)[24]。另有研究表明，小兒肺結(jié)核患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞中RAF1的mRNA和蛋白水平上調(diào)[25]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β是免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的重要促進(jìn)因子。肺結(jié)核治療后肺纖維化患者TGF-β水平明顯升高[26]，抗TGF-β抗體與抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療相結(jié)合可能增強(qiáng)T細(xì)胞功能，促進(jìn)免疫系統(tǒng)有效清除結(jié)核分枝桿菌[27]。

本研究將數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法相結(jié)合，整合中藥治療肺結(jié)核的臨床大數(shù)據(jù)規(guī)律，挖掘出核心藥對(duì)“白及-百部”，借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段揭示核心藥對(duì)潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路及它們的相互作用。本研究將有助于揭示中醫(yī)藥治療肺結(jié)核的科學(xué)內(nèi)涵，為結(jié)核病的治療機(jī)制提供思路。