王艮梅，陳 捷，范之馨，張煥朝①，項(xiàng) 劍

(1.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

鹽堿土是鹽土和堿土的統(tǒng)稱，具有鹽堿含量較高、理化性質(zhì)差(土壤層結(jié)構(gòu)緊實(shí)，孔隙度低，土壤有機(jī)質(zhì)含量和肥力低)等特點(diǎn)，嚴(yán)重制約了鹽堿土的利用[1]。我國(guó)鹽堿地總面積達(dá)3 600萬(wàn)hm2，占全國(guó)可利用土地面積的4.88%，而濱海地區(qū)又是鹽堿土集中分布地區(qū)之一。據(jù)估計(jì)，我國(guó)15 m等深線內(nèi)的淺海與灘涂有0.14億hm2[2]。鹽堿土是我國(guó)重要的后備土地資源，如何改良和合理開發(fā)利用一直是土壤學(xué)及農(nóng)林學(xué)科的研究熱點(diǎn)[3]。目前，常用的改良措施有物理改良、化學(xué)改良、生物改良以及多種改良措施的綜合，其中，添加有機(jī)物料作為綜合性改良措施，得到較多研究，如施用秸稈、有機(jī)肥和生物炭等措施，并取得了較好效果，在降低土壤鹽分、pH的同時(shí)，能夠提高土壤肥力、有機(jī)質(zhì)含量，增加土壤孔隙度，改善土壤理化性質(zhì)[4-5]。

土壤微生物在土壤有機(jī)物降解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、碳氮循環(huán)以及維系土壤結(jié)構(gòu)、抗干擾能力等方面均發(fā)揮著重要作用[6-7]。有研究表明，受鹽離子濃度高、水熱條件差、碳氮源不足等因素的制約，濱海鹽堿土土壤微生物總量低于同生態(tài)區(qū)域非鹽堿土；在微生物結(jié)構(gòu)組成上，細(xì)菌是鹽堿土壤中的優(yōu)勢(shì)微生物，豐度顯著高于真菌和放線菌[8-9]。一般而言，有機(jī)物料在土壤中的分解轉(zhuǎn)化主要依賴于土壤中的不同微生物群落，且轉(zhuǎn)化過(guò)程及參與的微生物受到土壤環(huán)境條件的影響。因此，針對(duì)土壤鹽堿化程度高、理化性質(zhì)較差的濱海鹽堿土壤，添加外源有機(jī)物的改良過(guò)程極可能改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

目前，有機(jī)物料改良濱海鹽堿土壤的研究主要針對(duì)土壤理化性質(zhì)[4,10]，雖有涉及不同有機(jī)物料添加對(duì)土壤微生物的影響研究，但研究材料多為單一的有機(jī)物料，研究對(duì)象鹽堿土壤也存在地域差異[11-13]，所獲得的研究結(jié)果可比性較差。

因此，以江蘇省鹽城市濱海鹽堿土為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息分析相結(jié)合的方法，研究秸稈、生物炭和牛糞有機(jī)肥添加后土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性變化，揭示細(xì)菌群落對(duì)不同有機(jī)物料改良濱海鹽堿土的響應(yīng)，可為濱海鹽堿地的改良和鹽堿地土壤生態(tài)學(xué)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于江蘇省鹽城市東川墾區(qū)(33°0′～33°01′ N， 120°48′～120°49′ E)的金海農(nóng)場(chǎng)。該地區(qū)圍墾于1999年，圍墾后主要種植小麥、水稻和油菜等經(jīng)濟(jì)作物，是江蘇省沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所下屬的沿海農(nóng)業(yè)科技示范基地。研究區(qū)位于北亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，具有明顯的海洋性、季風(fēng)性氣候，四季分明，寒暑顯著，日照充足，雨水充沛，多年平均氣溫為14.6 ℃，無(wú)霜期為220 d，日照時(shí)間為2 169.6 h，多年平均降水量為1 051.0 mm，主要集中在6—8月的雨季，多年平均蒸發(fā)量為827.5 mm。

大豐區(qū)為典型的淤積平原，有大面積沿海灘涂資源，是我國(guó)重要的后備土地資源。土壤為沖積鹽土類潮鹽土亞類，質(zhì)地為由海相沉積物發(fā)育而成的砂質(zhì)壤土，屬輕、中度鹽漬化土壤。試驗(yàn)開展前測(cè)得供試土壤平均pH為8.53，EC為862.5 μS·cm-1，w(總有機(jī)碳)為9.35 g·kg-1，w(全氮)為1.03 mg·kg-1，w(有效磷)為19.56 mg·kg-1，w(速效鉀)為177.67 mg·kg-1，供試樣地曾于試驗(yàn)開展前1 a種植田菁。

1.2 供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1供試材料

供試有機(jī)物料包括小麥秸稈、生物炭和牛糞有機(jī)肥。小麥秸稈為農(nóng)場(chǎng)當(dāng)年種植小麥的籽粒收獲后的地上部分，有機(jī)碳含量為 4.02 g·kg-1，全氮含量為 0.072 g·kg-1，pH為 7.2，C/N比為 55.8，全磷、全鉀含量小于0.1 g·kg-1，小麥秸稈曬干、切碎至2～5 cm小段備用；生物炭為小麥秸稈在400 ℃條件下高溫裂解制成，購(gòu)自湖北金日生態(tài)能源股份有限公司，有機(jī)碳含量為 5.51 g·kg-1，全氮含量為0.112 g·kg-1，pH 為 9.96，C/N 比為49.2，全磷、全鉀含量小于0.1 g·kg-1；牛糞有機(jī)肥購(gòu)自東臺(tái)田娘農(nóng)業(yè)生態(tài)有機(jī)肥有限公司，有機(jī)碳含量為3.04 g·kg-1，全氮含量為0.204 g·kg-1，pH 為 7.87，C/N比為14.9，全磷含量為0.168 g·kg-1，全鉀含量為0.134 g·kg-1。供試土壤為海相沉積物發(fā)育而成的砂質(zhì)壤土。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在研究區(qū)選擇土壤性質(zhì)基本一致的約800 m2樣地用于布置試驗(yàn)小區(qū)。試驗(yàn)共設(shè)牛糞有機(jī)肥處理(C)、生物炭處理(B)、小麥秸稈處理(S)和空白對(duì)照(CK)4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，共12個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為32 m2(4 m×8 m)。試驗(yàn)小區(qū)之間用寬100 cm、深30 cm的隔離帶隔開，以減少不同處理樣地間的干擾。有機(jī)物料添加量為30 t·hm-2，即每個(gè)小區(qū)添加96 kg物料。

2019年7月6日按照預(yù)先設(shè)計(jì)好的處理布置田間試驗(yàn)。供試有機(jī)物料均勻地覆蓋在試驗(yàn)小區(qū)土壤表面，然后使用旋耕機(jī)將其與耕層(0～20 cm)土壤混勻。試驗(yàn)樣地上不種植任何植物。

1.3 土壤樣品采集與分析

1.3.1土壤樣品采集

有機(jī)物料施用3個(gè)月后(2019年10月6日)在各試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)按照S形進(jìn)行布點(diǎn)，采集0～20 cm表層土壤樣品，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)采集6個(gè)點(diǎn)(采集過(guò)程注意無(wú)菌操作，防止樣品污染)，混勻，去除根系、礫石等雜物后，分成兩份。一份土壤樣品立即裝入無(wú)菌管，置于冷藏箱中帶回實(shí)驗(yàn)室，存放于-80 ℃冰柜中，并盡快用干冰保存送至廣州基迪奧生物科技有限公司，用于PCR擴(kuò)增測(cè)序；另一份土壤樣品置于自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干、研磨、過(guò)篩，用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)。

1.3.2土壤理化性質(zhì)分析

土壤pH采用電位法(雷磁PHSJ-3F)測(cè)定；土壤鹽分采用電導(dǎo)法(雷磁DDS-307A)測(cè)定；土壤全氮(TN)含量采用半微量凱氏定氮法測(cè)定；土壤有效磷(AP)含量采用碳酸氫鈉浸提法測(cè)定；土壤有效鉀(AK)含量采用乙酸銨浸提-火焰光度法測(cè)定；土壤總有機(jī)碳(TOC)含量采用重鉻酸鉀氧化外加熱法測(cè)定。土壤理化性質(zhì)各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定的具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)[14]。

1.3.3土壤微生物分析

用土壤DNA提取試劑盒(HiPure Soil DNA Kits，Magen，中國(guó))提取土壤樣品的微生物DNA，并用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，USA)檢測(cè)核酸純度和1 g·mL-1瓊脂凝膠電泳檢測(cè)DNA的提取質(zhì)量，使用引物341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)對(duì)V3和V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后使用AMPure XP Beads(BeckmanCoulter，USA)進(jìn)行 PCR 產(chǎn)物純化，純化后用 Qubit 3.0 (ThermoFischer Scientific，USA)定量，進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。對(duì)第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物用 AMPure XP Beads進(jìn)行純化后，用 ABI StepOnePlus RealTime PCR System(Life Technologies，USA) 進(jìn)行定量。按照Novaseq 6000(Illumina，USA) 的樣品要求規(guī)范化操作后，采用 PE250 模式上機(jī)測(cè)序。土壤樣品微生物多樣性具體測(cè)定過(guò)程由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)(raw data)后進(jìn)行數(shù)據(jù)過(guò)濾；之后對(duì)tags進(jìn)行拼接、過(guò)濾、去嵌合體和去冗余處理，得到effective tags。使用 Uparse 軟件對(duì)所有樣品的全部 effective tags 序列進(jìn)行聚類，以97%的一致性(identity)將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)，并以最小序列數(shù)進(jìn)行抽平處理，對(duì)比SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)以70%置信度進(jìn)行物種注釋。

采用Excel 2016對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計(jì)，采用IBM SPSS Statistics 21和R語(yǔ)言對(duì)微生物和土壤理化數(shù)據(jù)作進(jìn)一步分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)物料添加對(duì)濱海鹽堿土壤理化性質(zhì)的影響

不同有機(jī)物料添加3個(gè)月后土壤理化性質(zhì)見(jiàn)表1。與對(duì)照相比，添加牛糞有機(jī)肥顯著降低土壤pH(P<0.05)，添加秸稈使土壤pH略有升高，但與對(duì)照之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。添加秸稈處理土壤電導(dǎo)率(EC)降低，與其他3種處理之間差異顯著(P<0.05)。添加有機(jī)物料可提高土壤有機(jī)碳(TOC)和全氮(TN)含量，其中，生物炭處理有機(jī)碳含量與對(duì)照處理的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；牛糞有機(jī)肥和秸稈兩種處理全氮含量與對(duì)照處理間差異顯著(P<0.05)。添加牛糞有機(jī)肥和生物炭后，土壤速效磷(AP)、速效鉀(AK)含量均顯著高于對(duì)照處理(P<0.05)。

表1 不同有機(jī)物料添加對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響Table 1 Effect of the addition of different organic materials on soil physical and chemical properties

2.2 土壤樣品微生物測(cè)序結(jié)果分析

16S rRNA高通量測(cè)序和序列質(zhì)檢結(jié)果表明，4種處理土壤微生物共歸類為37門108綱213目286科444屬?？傂蛄袟l數(shù)為1 061 987條，總堿基數(shù)為484 312 434 bp，序列長(zhǎng)度在306～478 bp之間。按最小樣本序列數(shù)抽平后，根據(jù)處理進(jìn)行分組，當(dāng)1個(gè)分組內(nèi)OTU tag數(shù)均值大于1時(shí)，認(rèn)為該分組存在該OTU，并繪制Venn圖(圖1)。

S為秸稈處理，B為生物炭處理，C為牛糞有機(jī)肥處理，CK為對(duì)照。

如圖1所示，4種處理總計(jì)有4 949個(gè)OTU，共有OTU為2 258個(gè)。牛糞有機(jī)肥處理共有3 348個(gè)OTU，秸稈處理共有3 620個(gè)，生物炭處理共有3 406個(gè)，CK共有3 342個(gè)。此外，不同有機(jī)物料添加的特有OTU個(gè)數(shù)在不同處理間由多到少依次為S、B、CK和C，即添加秸稈處理土壤具有最多的特有OTU。

2.3 不同有機(jī)物料添加后土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

2.3.1不同有機(jī)物料添加后土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群變化

為研究不同有機(jī)物料添加對(duì)土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，對(duì)每種處理相對(duì)豐度排名前十位的菌門(屬)進(jìn)行比較分析，將相對(duì)豐度位列前十名之外的其他已知物種歸類為others，未知物種歸類為unclassified。由圖2(a)可知，4種處理土壤中優(yōu)勢(shì)菌門相同，但相對(duì)豐度存在差異。排名前十位的優(yōu)勢(shì)菌門有：變形菌門(Proteobacteria，23.33%～29.23%)、酸桿菌門(Acidobacteria，19.8%～24.2%)、浮霉菌門(Planctomycetes，13.62%～25.07%)、綠彎菌門(Chloroflexi，7.55%～10.27%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，5.96%～7.22%)、放線菌門(Actinobacteria，4.79%～5.93)、擬桿菌門(Bacteroidetes，3%～4.25%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，1.6%～2.05%)、棒狀桿菌門(Rokubacteria，0.89%～1.27%)及相對(duì)豐度較小的硝化螺旋菌門(Nitrospirae，0.46%～0.55%)。不同處理土壤中相對(duì)豐度排名前3位的優(yōu)勢(shì)菌門排序存在明顯差異，牛糞有機(jī)肥處理和對(duì)照處理排序一致，均為變形菌門、酸桿菌門、浮霉菌門；生物炭處理為浮霉菌門、變形菌門、酸桿菌門；而秸稈處理為變形菌門、浮霉菌門、酸桿菌門。其他優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度在4個(gè)處理中的排序一致。

CK為對(duì)照，C為牛糞有機(jī)肥處理，B為生物炭處理，S為秸稈處理。

為進(jìn)一步了解不同有機(jī)物料添加的土壤細(xì)菌組成差異，基于門和屬水平選擇單因素方差分析來(lái)檢驗(yàn)不同有機(jī)物料添加的細(xì)菌豐度差異。由圖2(c)可知，4種處理中生物炭處理變形菌門相對(duì)豐度(23.33%)最低，與對(duì)照處理(29.23%)相比顯著降低5.90個(gè)百分點(diǎn)(P<0.05)；添加生物炭和秸稈的土壤中浮霉菌門相對(duì)豐度較高，分別為25.07%和22.86%，顯著高于牛糞有機(jī)肥處理(13.82%)和CK處理(13.62%)。牛糞有機(jī)肥處理綠彎菌門相對(duì)豐度最高，達(dá)10.27%，并顯著高于秸稈處理(7.55%)。不同處理其他優(yōu)勢(shì)菌門相對(duì)豐度雖有一定差異，但均未達(dá)顯著水平。

由圖2(b)可知，4種處理樣地土壤中高相對(duì)豐度菌屬包括鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、不可培養(yǎng)細(xì)菌RB41 (uncultured bacterium RB41)、溶桿菌屬(Lysobacter)、小梨形菌屬(Pirellula)、Subgroup_10、Pir4_lineage、SH-PL14、芽小梨形菌屬(Blastopirellula)、浮霉菌門某屬(SM1A02)、MND1等。從屬水平來(lái)看〔圖2(d)〕，生物炭處理鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度(2.57%)顯著低于其他處理；秸稈處理不可培養(yǎng)細(xì)菌RB41相對(duì)豐度(2.03%)顯著低于其他3種處理；牛糞有機(jī)肥處理和對(duì)照處理土壤中小梨形菌屬(Pirellula)相對(duì)豐度顯著低于生物炭處理(2.11%)，同時(shí)這兩種處理SH-PL14相對(duì)豐度顯著低于生物炭處理和秸稈處理。4種處理相對(duì)豐度均低于1% 的菌屬有芽小梨形菌屬、浮霉菌門某屬(SM1A02)、MND1，其中，添加生物炭土壤中芽小梨形菌屬和添加秸稈土壤中浮霉菌門某屬(SM1A02)相對(duì)豐度顯著高于牛糞有機(jī)肥處理和對(duì)照處理。

2.3.2不同有機(jī)物料添加后土壤細(xì)菌組間差異物種分析

對(duì)不同有機(jī)物料添加后鹽堿土土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群落的組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，部分細(xì)菌相對(duì)豐度有較大差異，但細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌門(屬)組成比較相似。鹽堿土壤中添加不同有機(jī)物料后，細(xì)菌相對(duì)豐度發(fā)生變化，但不同處理間細(xì)菌種類組成是否一致尚不確定，故采用LEfSe(LDA EffectSize)分析方法研究土壤細(xì)菌在不同有機(jī)物料添加后的特征物種。此次試驗(yàn)檢測(cè)出的所有物種LEfSe分析結(jié)果見(jiàn)圖3。為簡(jiǎn)化圖形，圖3僅展示差異物種(LDA得分>2.0，P<0.05)。

圖3 不同處理土壤細(xì)菌LEfSe分析

進(jìn)化分支圖3(a)中，由內(nèi)到外的圓形代表由界至種的分類級(jí)別，在不同分類級(jí)別上的每一個(gè)小圓圈代表該分類水平下的一個(gè)物種，其直徑大小與相對(duì)豐度呈正比。由圖3(a)可知，與其他3種處理相比，生物炭處理土壤中未出現(xiàn)差異物種。秸稈處理具有顯著區(qū)分于其他處理的差異物種種類最多，這也對(duì)應(yīng)了OUT Venn圖分析中秸稈處理土壤具有最多的特有OTU的結(jié)果，這些物種主要包括變形菌門α變形菌綱(Caulobacterales、Altererythrobacter、Hyphomonadaceae)、δ變形菌綱粘球菌目(Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2、Haliangium、0319_6G20、Haliangiaceae、BIrii41)和γ變形菌綱(R7C24、CCD24)等；牛糞有機(jī)肥處理土壤中差異物種為變形菌門α變形菌綱(Rhizobiales、Tagaea_marina)和厚壁菌門鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)；對(duì)照處理差異物種為芽單胞菌門某綱(AKAU4049)。由圖3(b)可知，牛糞有機(jī)肥處理得分最高的物種為變形菌門根瘤菌目(Rhizobiales)，對(duì)照處理得分最高的為芽單胞菌門某綱(AKAU4049)，秸稈處理得分最高的為粘球菌目(Myxococcales)。這些差異物種的產(chǎn)生，可能是細(xì)菌對(duì)不同有機(jī)物料添加后土壤理化性質(zhì)變化的響應(yīng)結(jié)果。因此，不同處理間差異物種也在一定程度上說(shuō)明不同有機(jī)物料對(duì)濱海鹽堿土的改良效果存在差異。

2.4 有機(jī)物料添加對(duì)濱海鹽堿土土壤細(xì)菌多樣性的影響

2.4.1有機(jī)物料添加對(duì)濱海鹽堿土土壤細(xì)菌α多樣性的影響

α多樣性指生境或系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，多采用物種豐富度(即種類情況)和均勻度(即分布情況)來(lái)衡量。常用的微生物群落α多樣性指標(biāo)有表征物種豐富度的Ace和Chao指數(shù)，表征群落多樣性的Simpson指數(shù)，以及說(shuō)明測(cè)序結(jié)果是否合理的覆蓋率Coverage指數(shù)(表2)。此次測(cè)序的Coverage指數(shù)值均在96%以上，表明測(cè)序基本飽和，已覆蓋大部分物種。Simpson指數(shù)綜合考慮了物種豐富度和均勻度，在不同處理間的排序由大到小依次為B、S、C和CK。群落多樣性最高的為生物炭處理，最低的為對(duì)照處理，表明有機(jī)物料添加能使土壤細(xì)菌群落多樣性提高，改善鹽堿地土壤細(xì)菌群落組成，提高物種豐度并使物種分布更均勻。不同處理Ace和Chao指數(shù)由大到小依次均為C、S、B和CK，牛糞有機(jī)肥處理2種指數(shù)最高，表明添加牛糞有機(jī)肥的土壤中細(xì)菌豐度最大，其次為秸稈處理和生物炭處理。這可能是由于牛糞有機(jī)肥中豐富的養(yǎng)分和有機(jī)碳為微生物生長(zhǎng)提供了良好條件，改變了鹽堿地土壤養(yǎng)分不足的狀況，導(dǎo)致豐度提高。

表2 不同處理土壤細(xì)菌群落α多樣性分析Table 2 Analysis of α diversity of soil bacterial communities in different treatments

2.4.2有機(jī)物料添加對(duì)濱海鹽堿土土壤細(xì)菌β多樣性的影響

β多樣性重在關(guān)注樣本間多樣性，用來(lái)反映不同處理間是否具有顯著的微生物群落差異。采用基于Bary-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(principal co-ordinate analysis，PCoA)方法作圖比較群落差異(圖4)。

圖4 不同處理土壤細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析(門水平)

如圖4所示，PCoA1軸和PCoA2軸總計(jì)解釋了群落結(jié)構(gòu)總變異的87.91%。在PCoA1軸上，不同處理樣本分布較為分散，牛糞有機(jī)肥處理和對(duì)照處理樣本主要分布在正半軸，而秸稈處理和生物炭處理樣本主要分布在負(fù)半軸；在PCoA2軸上，秸稈處理和CK處理樣本正負(fù)軸均有分布，生物炭處理和牛糞有機(jī)肥處理樣本則全部落在負(fù)半軸。由圖4還可知，牛糞有機(jī)肥處理樣本分布最為集中，顯示出較好的重復(fù)性。不同處理間群落分布顯示出一定差異，通過(guò)Adonis檢驗(yàn)(R2=0.60，P<0.05)發(fā)現(xiàn)，組間距離大于組內(nèi)，因此，差異主要來(lái)自不同分組處理，即不同處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。

2.5 土壤細(xì)菌群落與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析

外源有機(jī)物料添加對(duì)濱海鹽堿土基本理化性質(zhì)產(chǎn)生一定影響(表1)，而土壤中微生物群落分布又與土壤環(huán)境條件密切相關(guān)[15]。上述分析結(jié)果顯示，添加不同有機(jī)物料土壤中微生物群落存在明顯差異，因此，對(duì)土壤基本理化性質(zhì)指標(biāo)(土壤環(huán)境因子)與細(xì)菌群落的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析。首先，基于消除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)選擇冗余分析(redundancy analysis，RDA)和典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis, CCA)模型，由于DCA結(jié)果中l(wèi)engths of gradient的第1軸大小為0.625<3，因而更適合采用RDA。RDA結(jié)果(圖5)表明，在屬水平上RDA1軸和RDA2軸分別解釋了細(xì)菌群落變異的64.33%和19.98%，所選土壤理化指標(biāo)已能較好地解釋細(xì)菌群落變化。RDA1軸主要由pH(R2=0.366)、TOC(R2=0.475)和TN(R2=0.09)貢獻(xiàn)，RDA2軸主要由EC(R2=0.357)貢獻(xiàn)，其中，TOC對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著(P<0.05)。

環(huán)境因子箭頭長(zhǎng)度表示對(duì)物種分布影響大小，環(huán)境因子箭頭線與坐標(biāo)軸夾角表示對(duì)該軸的貢獻(xiàn)大?。粯悠吩诩^上的投影到原點(diǎn)的距離表示該組樣品中環(huán)境因子豐度。

通過(guò)方差分解分析(variance partitioning analysis，VPA)，對(duì)不同環(huán)境因子的差異貢獻(xiàn)度量化，結(jié)果表明pH與TOC是影響群落結(jié)構(gòu)的主要因素，分別解釋了9.32%和8.97%的物種分布總變異，EC和AK分別解釋了5.53%和5.00%的總變異。

為進(jìn)一步研究不同細(xì)菌對(duì)土壤環(huán)境因子的響應(yīng)情況，采用相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖展示環(huán)境因子與物種的Pearson相關(guān)性(圖6)。由圖6可知，EC是聯(lián)通性最大的環(huán)境因子，表明EC的變化影響更多的物種，pH和TOC次之， TN、AP和AK連通性較低，但AK與高豐度的優(yōu)勢(shì)菌屬小梨形菌屬(Pirellula)呈顯著正相關(guān)，這與RDA分析結(jié)果基本吻合。與EC呈顯著負(fù)相關(guān)的細(xì)菌包括變形菌門的紅螺菌目?jī)蓪?Dongia、Reyranella)、粘細(xì)菌目?jī)蓪?Haliangium、Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)、生絲單胞菌科某屬(Hirschia)、γ變形菌綱某屬(Acidibacter)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)和酸桿菌門一屬(Bryobacter)， 呈顯著正相關(guān)的只有紅螺菌目某屬(Azoarcus)。可以發(fā)現(xiàn)，與EC呈顯著相關(guān)的物種以變形菌門為主。優(yōu)勢(shì)菌屬中溶桿菌屬(Lysobacter)與TOC呈顯著負(fù)相關(guān)，小梨形菌屬與AK呈顯著正相關(guān)，Pir4_lineage、SH-PL14與pH呈顯著正相關(guān)。

圖6 土壤細(xì)菌與土壤理化性質(zhì)Pearson相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖(屬水平)

由上述分析可知，受EC影響的菌種和秸稈處理組的差異菌群高度重合(圖3)，秸稈處理LDA得分最高的粘球菌目(Myxococcales)兩屬(Haliangium、Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2)、酸桿菌門一屬(Bryobacter)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)等與EC呈顯著負(fù)相關(guān)，這意味著EC可能是產(chǎn)生差異菌群的重要因素。

同時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌與土壤理化因子的顯著相關(guān)性也解釋了不同處理間的豐度差異，如溶桿菌屬與TOC呈顯著負(fù)相關(guān)，因此，有機(jī)物料添加處理溶桿菌屬相對(duì)豐度均低于對(duì)照(圖2)，與pH呈顯著正相關(guān)的Pir4_lineage、SH-PL14在秸稈處理和生物炭處理中的相對(duì)豐度均高于牛糞有機(jī)肥處理和對(duì)照(圖2)，原因在于添加秸稈和生物炭的土壤pH高于牛糞有機(jī)肥處理和對(duì)照(表1)。

3 討論

3.1 不同有機(jī)物料添加對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

不同有機(jī)物料添加后土壤中相對(duì)豐度位居前3位的菌門為變形菌門、酸桿菌門和浮霉菌門，除生物炭處理外，其他處理相對(duì)豐度最大的菌門都是變形菌門。以往研究認(rèn)為在濱海鹽堿土中，細(xì)菌豐度占據(jù)較大優(yōu)勢(shì)，而變形菌門常成為優(yōu)勢(shì)菌門[16-17]，其數(shù)量、種類眾多，包括多種代謝類型，參與多種土壤生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程[18]。筆者試驗(yàn)中，牛糞有機(jī)肥的施用增加了酸桿菌門相對(duì)豐度，酸桿菌門在土壤中大量存在，相對(duì)豐度甚至可達(dá)50%以上[19]。目前，發(fā)現(xiàn)該菌門微生物具有降解動(dòng)植物殘?bào)w[20]、參與鐵循環(huán)和單碳化合物代謝等生態(tài)功能[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌門與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)[23]，而牛糞有機(jī)肥處理土壤pH比其他處理顯著降低，筆者研究結(jié)果與之一致。浮霉菌門是生物炭處理組相對(duì)豐度最大的菌門，生物炭和秸稈的施用顯著增加浮霉菌門相對(duì)豐度。浮霉菌門微生物多數(shù)屬于專性好氧菌，并與土壤中反硝化過(guò)程有關(guān)[24]。牛糞有機(jī)肥處理土壤綠彎菌門相對(duì)豐度最高，該細(xì)菌門中大多數(shù)微生物可以將糖和多糖發(fā)酵成有機(jī)酸和氫[25]，加快土壤有機(jī)物的分解。

不同添加物土壤中優(yōu)勢(shì)菌屬以鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬等變形菌門和小梨形菌屬、芽小梨形菌屬、SM1A02等浮霉菌門的菌屬為主。鞘氨醇單胞菌屬是能夠分解大分子化合物，如芳香族化合物，降解土壤有毒物質(zhì)并參與氮循環(huán)的一類異養(yǎng)、好氧的革蘭陰性菌。秸稈處理土壤中鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度最高，這與秸稈中大分子物質(zhì)的分解和有機(jī)氮的礦化密不可分。在LEfSe分析中，粘球菌目是秸稈處理LDA得分最高的物種。有研究表明粘細(xì)菌與纖維素分解相關(guān)，其中，堆囊菌屬(Sorangium)、多囊菌屬(Polyangium)等屬于噬纖維素型粘細(xì)菌[26]。在物種與土壤理化性質(zhì)相關(guān)性分析中，粘球菌目?jī)蓪?Haliangium、Sorangiineae_bacterium_NIC37A_2)、酸桿菌門一屬(Bryobacter)、交替赤桿菌屬(Altererythrobacter)等與EC呈顯著負(fù)相關(guān)，這解釋了秸稈處理粘球菌目為何高于其他處理。鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)是一類中等嗜鹽、嚴(yán)格好氧的化能異養(yǎng)菌，對(duì)土壤鹽分條件有一定要求[27]，其在牛糞有機(jī)肥處理中分布最多，這可能是由于相比其他處理牛糞有機(jī)肥處理土壤鹽分降低到一個(gè)最適條件。

3.2 土壤理化因子對(duì)細(xì)菌群落的影響

通過(guò)RDA分析發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致不同處理間群落差異的主要因素有pH、TOC、EC和AK，其中，通過(guò)方差分解分析得到pH、TOC和EC對(duì)群落總變異的解釋度更高，同時(shí)在網(wǎng)絡(luò)圖中的連通性更大，影響了更多的物種，可以認(rèn)為pH、TOC和EC是導(dǎo)致群落差異的主要因素。鹽堿地土壤環(huán)境惡劣，微生物會(huì)受到多種條件制約，包括pH、鹽度、碳源、氧氣等[15-16]。 pH可以直接對(duì)土壤中微生物進(jìn)行選擇，強(qiáng)大的生境壓力將會(huì)保留那些更加適應(yīng)此pH的物種[28]，在鹽堿土土壤微生物受到的脅迫中，pH和鹽分常常同時(shí)出現(xiàn)[29]。有研究顯示，在鹽堿土中，鹽度是微生物群落變化的主要影響因素[30]；但也有研究表明微生物群落變化與含水量、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和pH高度相關(guān)，鹽度并不是主要因素[31]。這些結(jié)果的差異可能與分析尺度有關(guān)，在鹽度梯度變化大的研究中，鹽度的影響往往更大，而在不同分類水平上的研究也會(huì)得出有差異的結(jié)果。WONG等[32]向鹽堿土中加入粉碎的菅草，顯著提高了土壤的累積呼吸率和土壤微生物生物量，結(jié)果顯示這是由于有機(jī)碳的輸入和土壤鹽分的降低，筆者試驗(yàn)中秸稈處理土壤鹽度顯著降低是該處理產(chǎn)生較多差異物種的重要原因。SINGH等[33]利用有機(jī)肥和黃鐵礦改良鹽堿土，發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)菌數(shù)量最大，原因在于試驗(yàn)處理降低了土壤pH和鹽度，筆者試驗(yàn)中有關(guān)牛糞有機(jī)肥處理的結(jié)果與之相似：牛糞有機(jī)肥的施用可以降低土壤pH，增加土壤有機(jī)碳含量，提高細(xì)菌豐度。施用生物炭對(duì)土壤影響的研究結(jié)果有一定差異，有研究[12]肯定了生物炭的改良作用，即能夠改善土壤性質(zhì)，提高微生物豐度，但也有研究[34]表明生物炭會(huì)提高土壤pH和EC，不同的結(jié)果差異可能與生物炭種類、施用量及土壤類型有關(guān)[11,34]。筆者試驗(yàn)中，與對(duì)照處理相比，施用生物炭雖會(huì)提高土壤pH和EC，但添加生物炭的土壤細(xì)菌群落多樣性和細(xì)菌豐度均高于對(duì)照處理。除去土壤條件本身的限制作用外，也有研究認(rèn)為是鹽度導(dǎo)致的植物生長(zhǎng)的減少間接影響了微生物的分布差異[35]。筆者試驗(yàn)中添加牛糞有機(jī)肥的土壤中根瘤菌相對(duì)豐度與其他處理相比有顯著差異，這可能表明由于牛糞有機(jī)肥對(duì)鹽堿土的改良效果，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)，進(jìn)而影響土壤微生物的分布。但在試驗(yàn)采樣過(guò)程中，并未觀察到不同處理樣地間植物生長(zhǎng)具有明顯差異，有機(jī)物料添加、植物生長(zhǎng)、土壤鹽度和微生物分布之間復(fù)雜的相互作用仍需進(jìn)一步研究。

結(jié)合現(xiàn)有研究分析，認(rèn)為有機(jī)物料添加對(duì)土壤微生物的作用原理主要在于兩個(gè)方面：(1)增加了土壤碳氮的輸入，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供所需養(yǎng)分；(2)改善土壤結(jié)構(gòu)，減少制約因素，如pH、鹽度等的限制，改善微生物活動(dòng)微域環(huán)境[8-9, 11-13]。有機(jī)物料的施加會(huì)改變土壤環(huán)境，環(huán)境的變化影響著微生物群落，而微生物群落的變化又會(huì)進(jìn)一步影響土壤養(yǎng)分的分解轉(zhuǎn)移，這是一個(gè)兩者互相影響、互相作用的漫長(zhǎng)過(guò)程。

4 結(jié)論

(1)與對(duì)照相比，所有處理均提高土壤TOC、TN、AP和AK含量，其中，生物炭處理TOC含量提高顯著，秸稈與牛糞有機(jī)肥處理TN含量增加顯著，生物炭與牛糞有機(jī)肥處理AP、AK含量提高顯著；牛糞有機(jī)肥的施用顯著降低土壤pH，秸稈處理顯著降低土壤鹽度，秸稈和生物炭處理土壤pH略微升高。

(2)不同有機(jī)物料添加后土壤中細(xì)菌在門屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌未發(fā)生變化，但優(yōu)勢(shì)菌相對(duì)豐度在不同處理間存在明顯差異。牛糞有機(jī)肥處理土壤細(xì)菌豐度最大，生物炭處理土壤群落多樣性最高，秸稈處理土壤差異物種最多。

(3)土壤細(xì)菌群落分布主要受土壤pH、總有機(jī)碳含量和EC的影響。