劉蕾， 馬德賓， 史亮， 孫文武

(中國(guó)人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 呼吸內(nèi)科， 遼寧 沈陽(yáng) 110016)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是以肺動(dòng)脈平均壓漸進(jìn)性升高為特征的慢性疾病，其病理特點(diǎn)為肺血管重構(gòu)及血管阻力的持續(xù)升高，最終導(dǎo)致患者右心衰竭及死亡[1-2]。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT)引起的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, EC)損傷是PAH發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[3]。抑制EndMT、恢復(fù)EC功能，可有效緩解PAH的發(fā)病進(jìn)程。Shh(Sonic hedgehog)可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞遷移，進(jìn)而誘導(dǎo)新生血管的生成[4]。研究發(fā)現(xiàn)，Shh在缺氧環(huán)境下的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[5]，提示Shh可能參與低氧誘導(dǎo)的PAH發(fā)病進(jìn)程；Twist參與細(xì)胞的遷移及血管生成，是促進(jìn)EndMT的關(guān)鍵因子[6]。推測(cè)Shh、Twist1在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于Shh/Twist1對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響鮮見報(bào)道。因此本研究旨在探討Shh/Twist1對(duì)低氧誘導(dǎo)的PAH細(xì)胞模型內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管重構(gòu)的影響，以期為PAH的早期防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1動(dòng)物來(lái)源 4周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量100～120 g，購(gòu)自北京華阜康公司[許可證號(hào)SCXK(京)2020-0004]，用于原代分離肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。

1.1.2主要試劑及材料 肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基(上海中喬新舟生物科技有限公司)，胰酶(美國(guó)Sigma公司)，Twist siRNA干擾片段及陰性對(duì)照(實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建保存)，Cyclopamine(上海源葉生物科技有限公司)，脂質(zhì)體3000(美國(guó)sigma公司)，絲裂霉素C(美國(guó)sigma公司)，Matrigel膠(美國(guó)Cornig公司)；全蛋白提取試劑盒、兔抗大鼠Shh一抗(A7726，1 ∶400)及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(武漢愛(ài)博泰克生物科技有限公司)，兔抗大鼠Twist1一抗(WL00997，1 ∶500)、兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)一抗(WL00009b，1 ∶400)、兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)一抗(WL03702，1 ∶1 000)及山羊抗兔IgG-HRP二抗(WLA023，1 ∶5 000)均購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1大鼠原代肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離[7]采用組織塊貼壁法提取大鼠原代肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉(200 mg/kg)后頸椎脫臼處死，無(wú)菌環(huán)境下取新鮮肺動(dòng)脈組織。在含PBS的10 cm的培養(yǎng)皿中，反復(fù)清洗血管內(nèi)的血液。將清洗干凈的血管移入另一個(gè)培養(yǎng)皿中，PBS沖洗2次后，移入第3個(gè)培養(yǎng)皿。用眼科剪縱向剪開肺動(dòng)脈，用無(wú)菌刀片將組織片切成1～2 mm2大小的動(dòng)脈片，整個(gè)操作過(guò)程標(biāo)本要浸泡于PBS中。最后將動(dòng)脈片移入直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，將其內(nèi)膜面貼于培養(yǎng)皿，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中干涸2 h后，加入3 mL專用培養(yǎng)基于37 ℃、5 %CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72 h細(xì)胞達(dá)一定密度后將動(dòng)脈片去除，換液1次，以后每2 d換液1次，每次按照新鮮培養(yǎng)基1 ∶1進(jìn)行換液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，細(xì)胞融合成單層。細(xì)胞密度達(dá)到90%，用胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2造模及細(xì)胞分組 肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種至專用細(xì)胞培養(yǎng)基中，3%O2培養(yǎng)細(xì)胞3 d，建立PAH細(xì)胞模型[8-9]。胰酶消化計(jì)數(shù)后的大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，分為正常對(duì)照組(37 ℃、5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞3 d)、模型組(3%O2培養(yǎng)細(xì)胞3 d)、Shh抑制劑組(37 ℃、5%CO2條件下5 μmol/L Cyclopamine處理過(guò)夜后，細(xì)胞置于3%O2條件下培養(yǎng)3 d)、siRNA NC組(37 ℃、5%CO2條件下用siRNA NC轉(zhuǎn)染過(guò)夜后，細(xì)胞置于3%O2條件下培養(yǎng)3 d)及Twist1 siNRA組(37 ℃、5%CO2條件下用Twist1 siNRA轉(zhuǎn)染過(guò)夜后，3%O2條件下培養(yǎng)3 d)。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 培養(yǎng)各組細(xì)胞至密度為融合狀態(tài)。在實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)基換為無(wú)血清培養(yǎng)基并加入1 mg/L的絲裂霉素C處理1 h。將各組細(xì)胞利用200 μL pipette tip造成細(xì)胞劃痕，用無(wú)血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面1次，除去細(xì)胞碎片，換用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。將各組細(xì)胞置于37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h后拍照。

1.2.4小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成管能力 Matrigel膠4 ℃過(guò)夜解凍，冰上操作，吸取Matrigel膠至96孔培養(yǎng)板，每孔50 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h，使其凝固。收集各組缺氧誘導(dǎo)1 d的培養(yǎng)液，用于細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞分別消化離心后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。分別取各組細(xì)胞懸液100 μL加入已鋪膠的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞數(shù)為104個(gè)，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測(cè)細(xì)胞中CD31、vWF、α-SMAmRNA的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，分光光度儀測(cè)定總RNA濃度，采用Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中CD31、vWF、α-SMAmRNA的相對(duì)表達(dá)量。CD31上游引物序列為5′-CTCCATCCTGTCGGGTAA-3′，下游引物序列為5′-TCATTCACGGTTTCTTCG-3′；vWF上游引物序列為5′-CTACGGCTTGCACTATTCA-3′，下游引物序列為5′-CCAGACACTTGCGTTCATC-3′；α-SMA上游引物序列為5′-GGGCATCCACGAAACCACCT-3′，下游引物序列為5′-GAGCCGCCGATCCAGACAGA-3′；內(nèi)參照β-actin上游引物序列為5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游引物序列為5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s、60 ℃退火及延伸50 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Shh、Twist1、VEGF、MMP2蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS漂洗3次，加入適當(dāng)體積的蛋白裂解液，抽提細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度并定量，以SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白復(fù)合物，將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入Shh(1 ∶400)、Twist1(1 ∶500)、VEGF(1 ∶400)、MMP2(1 ∶1 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；孵育一抗后的PVDF膜用TBST緩沖液洗膜4次，5 min/次；繼續(xù)用HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)37 ℃孵育45 min，TBST緩沖液洗膜6次，每次5 min。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，用凝膠圖處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer)軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遷移能力

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果如圖1和表1所示。與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的遷移率升高(P<0.05)；與模型組比較，Shh抑制劑組及siRNA-Twist1組細(xì)胞的遷移率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組細(xì)胞的遷移情況(100×)Fig.1 The migration ability of cells(100×)

表1 各組細(xì)胞的遷移率比較Tab.1 The migration rate of

2.2 成管能力

小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的血管生成能力。如表2所示，與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞形成的管腔數(shù)明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，經(jīng)Shh抑制劑處理或干擾Twist1后，細(xì)胞形成的管腔數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 各組細(xì)胞的成管情況(100×)Fig.2 The Tube formation of cells in each group(100×)

表2 各組細(xì)胞的管腔形成數(shù)目比較Tab.2 Number of luminal formation

2.3 CD31、vWF及α-SMA mRNA表達(dá)

與模型組比較，Shh抑制劑處理或干擾Twist1可上調(diào)CD31、vWFmRNA的表達(dá)，下調(diào)α-SMAmRNA的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組細(xì)胞CD31、vWF及α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)水平Tab.3 Expression of CD31,vWF, and α-SMA mRNA in each

2.4 Shh、Twist1、VEGF及MMP2蛋白表達(dá)

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組Shh、Twist1、VEGF及MMP2蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，Shh抑制劑組和siRNA-Twist1組細(xì)胞中Shh、Twist1、VEGF及MMP2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表4。

圖3 各組細(xì)胞Shh、Twist1、VEGF及MMP2蛋白電泳結(jié)果Fig.3 Protein electrophoresis images of Shh, Twist1, VEGF, and MMP2 in each group

表4 各組細(xì)胞Shh、Twist1、VEGF及MMP2蛋白相對(duì)表達(dá)水平Tab.4 Expression of Shh、Twist1、VEGF、MMP2 proteins in each

3 討論

PAH是一種破壞性極強(qiáng)的心肺疾病，發(fā)病率及死亡率均較高[10]。目前，PAH的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，現(xiàn)認(rèn)為炎癥、低氧、氧化應(yīng)激等因素均可能導(dǎo)致肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受損，引起肺血管重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致肺動(dòng)脈腔隙狹窄甚至完全堵塞[11]。

EndMT是PAH發(fā)生時(shí)肺動(dòng)脈血管重構(gòu)的主要因素，EndMT會(huì)加劇肺血管重構(gòu)及PAH進(jìn)程[12]。因此，抑制EndMT、恢復(fù)EC的正常功能可有效治療PAH。

內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT的主要特征變化為間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA表達(dá)增加，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31及vWF表達(dá)下調(diào)[3]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)缺氧誘導(dǎo)后，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中α-SMAmRNA的表達(dá)上調(diào)，CD31及vWFmRNA的表達(dá)降低，說(shuō)明細(xì)胞發(fā)生EndMT，符合PAH的臨床病理特征[13]。

Shh作為HH蛋白家族中重要一員，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)通路。激活Shh可促進(jìn)細(xì)胞遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14-15]。此外，Shh信號(hào)通路還可通過(guò)促進(jìn)血管因子的釋放，增強(qiáng)血管再生。在胃癌發(fā)病進(jìn)程中，抑制Shh/Gli1通路可下調(diào)Twist1的表達(dá)，提示Shh對(duì)Twist1存在調(diào)控作用[16]。Twist1是誘導(dǎo)EndMT的常見轉(zhuǎn)錄因子，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EndMT的發(fā)生[17]。研究顯示，缺氧處理的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD31的表達(dá)顯著減少，α-SMA表達(dá)顯著增加，其作用機(jī)制可能是Twist1的激活誘導(dǎo)了EndMT的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果表明，抑制Shh/干擾Twist1表達(dá)均能上調(diào)CD31及vWFmRNA的水平，降低α-SMAmRNA的表達(dá)，具有抑制EndMT的作用。

VEGF是促進(jìn)血管新生重要的細(xì)胞因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞激活、遷移及血管形成[19-20]。MMP2是基質(zhì)蛋白酶(MMPs)家族中一種明膠酶，參與血管生成過(guò)程[21]。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)后，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和MMP2蛋白表達(dá)水平顯著上升，與趙海燕等[22]的研究結(jié)果一致。研究顯示，Shh信號(hào)通路及Twist1可通過(guò)直接或間接上調(diào)VEGF及MMP2的表達(dá)[23-24]，促進(jìn)血管形成[21]。抑制Shh/Twist1蛋白的表達(dá)可降低血管再生及細(xì)胞轉(zhuǎn)移[25-26]。本研究結(jié)果表明，當(dāng)抑制Shh/干擾Twist1表達(dá)后，細(xì)胞中VEGF、MMP2蛋白表達(dá)下調(diào)，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力減弱，使缺氧誘導(dǎo)的PAH得到明顯改善。

綜上所述，降低Shh/Twist1的表達(dá)可有效抑制抑制肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT，改善肺動(dòng)脈血管重塑。