徐旖旎， 陳婷婷， 楊非， 張彥燕， 潘迪， 羅紅， 沈祥春， 付凌云**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室 & 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

心血管疾病(cardiovascular diseases，CVDs)是威脅我國居民健康水平及生活質(zhì)量的首要疾病，且全國乃至全球CVDs的發(fā)病率和死亡率仍處于上升階段[1]。心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是CVDs導(dǎo)致患者心肌順應(yīng)性和收縮功能下降而發(fā)生泵衰竭的必然過程，是心衰由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)[2]；與此同時，心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(fibroblast-myofibroblast transition，F(xiàn)MT)在CVDs惡化過程中的地位和作用與心肌細(xì)胞病變同等重要[3]。因此研究MF的關(guān)鍵病變機(jī)制，尤其是FMT調(diào)控關(guān)鍵靶位，為研發(fā)療效明確、副作用少、作用靶位明確、能直接抑制FMT發(fā)生、減輕或延緩纖維化的藥物，對減少CVDs的發(fā)病率、降低死亡率及提高生存質(zhì)量都具有十分重要的意義。研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)可獨立作用于心血管系統(tǒng)，也可與血管緊張素聯(lián)合對心臟結(jié)構(gòu)和功能造成不良后果，是引起心臟損傷、重塑、纖維化及衰竭的重要因子[4]，但ALD誘導(dǎo)心臟損傷機(jī)制至今不明。Notch-1是與細(xì)胞分化密切相關(guān)的信號分子，在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，研究表明黃芩素改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠MF過程中，伴隨有Notch-1蛋白表達(dá)減少[5]。Notch-1信號異常活化對多臟器如肺、肝、腎、皮膚、心血管等的纖維化具有重要的調(diào)控作用[6-9]，但其對ALD誘導(dǎo)FMT的作用及機(jī)制目前尚不清楚?？鄥⑹嵌箍苹睂僦参锟鄥?SophoraflavescensAit.)的干燥根，有清熱、燥濕及殺蟲的功效[10]，氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是苦參主要藥效成分之一，有抗心律失常、保護(hù)血管內(nèi)皮、保護(hù)缺血和梗死心肌等作用[11-13]。有研究顯示，OMT對心肺復(fù)蘇術(shù)后大鼠心肌重塑有抑制作用[14]；可明顯減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)實驗大鼠心肌組織的重構(gòu)和纖維化，對急性心肌梗死后MF有顯著的逆轉(zhuǎn)作用；可降低病毒性心肌炎小鼠心肌的炎癥和損傷，對損傷后心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，對心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖也有顯著的抑制作用[15-16]。本課題組前期研究表明，OMT對大鼠冠狀動脈結(jié)扎誘發(fā)的急性心肌梗死、心肌重塑及MF具有顯著的改善作用，其作用與逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞凋亡，抑制CFs增殖及分化等密切相關(guān)[17-18]。本研究以ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水誘導(dǎo)大鼠MF模型，通過觀察OMT對大鼠心肌病理形態(tài)、心肌羥脯胺酸(hydroxyproline, HYP)含量、心肌FMT指標(biāo)以及Notch-1信號蛋白的表達(dá)，分析OMT對ALD誘導(dǎo)大鼠MF的作用以及與Notch-1信號的關(guān)系，為臨床MF的防治提供新的作用靶點，為傳統(tǒng)中藥防治MF提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，體質(zhì)量180～220 g，Ⅱ級清潔級，由學(xué)校實驗動物中心提供[SCXK(黔)2012-0001]。

1.1.2主要藥物、試劑及儀器 Aldosterone(美國sigma)，OMT(南京廣潤生物)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) Mouse McAb、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP2)Rabbit polyclonal antibody及Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ, ColⅠ)Rabbit Polyclonal antibody(美國Proteintech Group)，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)及MMP2(英國abcam)，Notch-1(DIE11)XP(R) RABBIT mAb(美國Cell Signaling technology)；CFX型凝膠成像系統(tǒng)儀、PowerPac Basic及Mini-PROTEAN Tetra System(美國BIO-RAD)，XDS-2B倒置顯微鏡(日本尼康)，HF240 CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué))。

1.2 研究方法

1.2.1造模和分組 大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對照組、模型組、25 mg/kg OMT(低劑量)組、50 mg/kg OMT(高劑量)組，10只/組；對照組大鼠給予等容積生理鹽水皮下注射、自由飲水，其余各組大鼠采用80 μg/kg ALD皮下注射聯(lián)合1%NaCl飲水復(fù)制MF模型；造模持續(xù)4周時，處死各組大鼠，切取左心室，待后續(xù)實驗使用。

1.2.2天狼星紅染色 取福爾馬林固定的各組大鼠心肌組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、固定，切片(厚度4～8 μm)，展片，貼于載玻片上，烘干；切片脫蠟、水化，weigert鐵蘇木素染色15 min；1%鹽酸酒精分化3 s，自來水沖洗10 min，ddH2O洗5 min，天狼星紅染色1 h；自來水沖洗去除染液，梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；普通光學(xué)顯微鏡下觀察，膠原纖維呈紅色，胞核呈藍(lán)色，肌纖維呈黃色，拍照分析。

1.2.3堿水解法分析心肌HYP含量 稱取各組大鼠心肌組織100 mg，置于預(yù)先編號的試管中，加水解液1 mL，混勻，95 ℃水浴20 min，水解10 min時混勻1次；pH值調(diào)至6.0～6.8，各試管內(nèi)加ddH2O至10 mL混勻，取稀釋的水解液3～4 mL置于對應(yīng)編號的新的試管內(nèi)，加活性炭20～30 mg混勻，3 500 r/min離心10 min，取上清液1 mL做檢測；同時設(shè)空白管、標(biāo)準(zhǔn)管；混勻，60 ℃水浴15 min，冷卻，3 500 r/min離心10 min，取上清于波長550 nm，ddH2O調(diào)零，測定各管光密度(optical density，OD)值并計算。

1.2.4Western blot法分析FMT指標(biāo)及Notch-1信號指標(biāo) 液氮中取每只大鼠組織樣本100 mg，置于預(yù)冷研缽中加液氮研磨至白色干粉，將組織干粉轉(zhuǎn)入提取液中，混勻后瞬時離心，低溫震蕩至無明顯沉淀，11 441 r/min離心20 min；常規(guī)提取蛋白、定量、制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉及雜交(一抗稀釋濃度GAPDH 1 ∶7 500、ColⅠ 1 ∶1 000、 MMP9 1 ∶10 000、MMP2 1 ∶1 000、TIMP2 1 ∶1 000、TIMP1 1 ∶750、Jagged-1 1 ∶1 000、Notch-1 1 ∶1 000、DLL-4 1 ∶1 000及Hes-1 1 ∶1 000)，置于CFX型凝膠成像系統(tǒng)儀暗室曝光，用Image Lab圖像分析軟件對選擇的目標(biāo)條帶進(jìn)行光密度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌組織學(xué)

普通光學(xué)顯微鏡下觀察，天狼星紅染色后，心肌膠原呈紅色，其余組織呈淡黃色；與對照組相比，模型組大鼠可見大量紅色膠原；與模型組相比，OMT低、高劑量組組大鼠心肌紅色膠原不同程度減少。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織的天狼星紅染色結(jié)果(200×)Fig.1 Sirius red staining results of rats cardiac histomorphology in each group (200×)

2.2 心肌HYP含量

ALD皮下注射聯(lián)合高鈉鹽飲水造模4周后，與對照組相比，模型組大鼠心肌HYP含量升高(P<0.05)；與模型組相比，OMT低劑量組大鼠心肌HYP含量降低(P<0.05)。見圖2。

注：(1) 與對照組比較，P<0.05；(2) 與模型組比較，P<0.05。圖2 各組大鼠心肌HYP含量 Fig.2 Hydroxyproline content of rats myocardial tissue in each group

2.3 心肌FMT指標(biāo)

ALD皮下注射聯(lián)合高鈉鹽飲水造模4 周時，與對照組相比，模型組大鼠心肌ColⅠ、 MMP9、MMP2、TIMP2及TIMP1升高(P<0.05)；與模型組相比，OMT低劑量組大鼠心肌上述FMT指標(biāo)均有降低(P<0.05)，OMT高劑量組大鼠心肌MMP2、TIMP2和TIMP1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3。

注：A為蛋白條帶，B～F分別為 ColⅠ、MMP9、MMP2、TIMP1及TIMP2的定量表達(dá)結(jié)果；(1) 與對照組比較，P<0.05；(2) 與模型組比較，P<0.05。圖3 各組大鼠心肌FMT指標(biāo)的表達(dá)Fig.3 Expression of FMT indexes in myocardium of rats in each group

2.4 心臟Notch-1信號蛋白的表達(dá)

ALD皮下注射聯(lián)合高鈉鹽飲水造模4周時，與對照組相比，模型組大鼠心肌Jagged-1、Notch-1、DLL-4及Hes-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組相比，OMT低劑量組大鼠心肌Jagged-1、Notch-1及DLL-4蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)。見圖4。

注：A為蛋白條帶，B～E分別為Jagged-1、Notch-1、DLL-4及Hes-1蛋白的定量表達(dá)；(1) 與對照組比較，P<0.05；(2) 與模型組比較，P<0.05。圖4 各組大鼠心臟Notch-1信號蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of Notch-1 signal proteins in myocardium of rats in each group

3 討論

ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水造模后，顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，大量膠原纖維沉積，纖維組織明顯增生，肌纖維溶解壞死、殘留心肌數(shù)目少且排列紊亂，提示ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水造模，大鼠心臟出現(xiàn)肥厚和纖維化的病理表現(xiàn)；與對照組相比，OMT低、高劑量組大鼠亦出現(xiàn)不同程度的病理改變，但與模型組相比，OMT組病理改變較輕，提示OMT可改善ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水造成的大鼠心肌肥厚和纖維化。

在各種致病因素作用下，心肌正常組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維過量積聚，膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變，最終發(fā)生MF[19]。HYP是膠原蛋白的特征性氨基酸，HYP含量的變化可以反映膠原含量的變化，因此，檢測心肌中HYP含量可以反映MF的程度[20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水造模，模型組大鼠心肌組織HYP含量升高(P<0.05)，提示模型組大鼠心肌膠原沉積增多，發(fā)生了MF；與模型組相比，OMT組大鼠心肌HYP含量不同程度降低，膠原沉積減少，提示OMT能夠緩解ALD聯(lián)合高鹽飲水引起的MF。

正常情況下，心肌中細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)的合成和降解保持著動態(tài)平衡狀態(tài)[21]。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TMIPs)是維系這種平衡狀態(tài)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，MMPs負(fù)責(zé)降解ECM，以MMP2和MMP9的研究居多，可以降解ColⅠ、彈性蛋白酶等，在心肌組織重塑方面有重要作用[22]；TIMPs具有抑制MMPs的功能[23]。病理狀態(tài)下，ECM的動態(tài)平衡被打破，ECM沉積，其中Col Ⅰ是沉積于纖維化病灶部位ECM的核心成分，Col Ⅰ的聚集是纖維化進(jìn)程的特征[24-25]。因此，研究心肌病變后的ColⅠ、MMPs及TIMPs的表達(dá)可以反映MF的程度。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌ColⅠ、MMP9、MMP2、TIMP2及TIMP1均較對照組升高，OMT組大鼠心肌上述蛋白表達(dá)較模型組降低，提示ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水造模大鼠心臟發(fā)生纖維化，OMT可以通過逆轉(zhuǎn)ColⅠ、MMP9、MMP2、TIMP2及TIMP1蛋白的表達(dá)上調(diào)從而逆轉(zhuǎn)ALD聯(lián)合高鈉鹽飲水引起的MF及FMT。

Notch信號通路在組織器官的發(fā)生、發(fā)育過程中具有重要作用[26]，近年來有關(guān)Notch與疾病的關(guān)系越來越受到人們的重視。Notch信號的研究主要集中在其受體(Notch-1)、配體(Jagged，DLL)和下游靶基因(Hes-1)上[27]。一般認(rèn)為，Notch信號的活化要經(jīng)過3步蛋白水解，首先是Notch受體的前體在高爾基體經(jīng)過Furin蛋白酶剪切、變成有活性的Notch受體，之后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜與配體(Jagged、DLL)結(jié)合后經(jīng)第二步酶切，即金屬蛋白酶家族參與完成的胞外域的水解，最后經(jīng)γ分泌酶水解胞內(nèi)域，酶切后的胞內(nèi)域進(jìn)入胞核，與核內(nèi)效應(yīng)蛋白結(jié)合，啟動下游靶基因(Hes-1)的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡[28]。本研究通過整體動物模型驗證ALD誘導(dǎo)的MF大鼠模型心肌中Notch-1信號的變化，結(jié)果顯示，ALD皮下注射聯(lián)合高鈉鹽飲水造模后，模型組大鼠心肌組織中Notch-1、Jagged-1、DLL-4及Hes-1均高于對照組，提示ALD誘導(dǎo)MF模型中Notch-1信號表達(dá)上調(diào)；OMT低劑量組大鼠心肌組織Jagged-1、Notch-1及DLL-4蛋白表達(dá)較模型組降低，提示OMT改善ALD誘導(dǎo)的大鼠MF可能與降低Notch-1信號的蛋白表達(dá)存在相關(guān)性。

綜上所述，OMT能夠逆轉(zhuǎn)ALD誘導(dǎo)的大鼠MF，其機(jī)制可能與下調(diào)Nothc-1信號相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。