蘭斯琦， 劉歡歡， 支苑， 張麗丹， 唐永瑜， 汪巳卜， 張敏，沈祥春*， 陶玲*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特色天然藥物資源高效利用工程中心， 貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025)

檸檬桉油又稱桉葉油、白千層腦及桉樹腦，是從桉樹葉、玉樹、樟樹及月桂等植物的油腺細(xì)胞中分泌的芳香精油，無色或微黃色油狀[1]。檸檬桉油呈特有清涼桉葉香氣和樟腦氣味，有辣口清涼感，香氣強(qiáng)烈而不持久，具有疏風(fēng)、清熱解毒、祛風(fēng)止癢等多種作用[2]；現(xiàn)代藥理研究表明，檸檬桉油還具有抗菌、抗炎、抗氧化、殺蟲驅(qū)蚊及透皮促吸收等作用[3-7]，有一定防霉和殺菌防腐作用，被廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥及香料等日常生活品及醫(yī)藥用品方面[8-11]，也是目前常用醫(yī)藥用制劑。檸檬桉油幾乎不溶于水，易溶于無水乙醇、油和脂肪中，傳統(tǒng)溶液劑等不利于發(fā)揮其效應(yīng)[12-14]。自微乳遞送系統(tǒng)(self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)作為新型藥物遞送系統(tǒng)，由乳化劑、助乳化劑、油相及目標(biāo)藥物共同組成的預(yù)濃縮微乳，臨用前用水稀釋，或在給藥部位遇體液后自發(fā)形成微乳，可改善藥物溶解度、降低表面張力、增強(qiáng)膜穿透性及提高生物利用度[15-17]；自微乳還具有熱力學(xué)穩(wěn)定性的優(yōu)勢(shì)，在增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性方面起著重要作用，可避免貯藏中分層等問題[18-20]；同時(shí)自微乳還能增進(jìn)藥物對(duì)角質(zhì)層屏障的透過，增強(qiáng)藥物的滲透性[21-24]；另外，自微乳還具有良好的緩釋作用，能夠更好地發(fā)揮其藥效[25-26]。自微乳遞送系統(tǒng)使用便利、容易制備、便于生產(chǎn)等亮點(diǎn)，近年來該劑型的研究倍受關(guān)注[27-29]。本研究基于SMEDDS的基礎(chǔ)，應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法建立偽三元相圖，篩選油相、乳化劑和共乳化劑的種類和比例，對(duì)檸檬桉葉油SMEDDS的處方進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行藥劑學(xué)性能表征，為其更好的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥劑與主要試劑 檸檬桉油和聚氧乙烯蓖麻油(上海阿拉丁)，吐溫-80和無水乙醇(國藥集團(tuán))，磷鎢酸(天津大茂)，15-羥基硬脂酸聚乙二醇酯(徳國巴斯夫)，1,2-丙二醇(天津瑞金特)，甘油(山東瑞生)。

1.1.2主要儀器 Nanobrook 90Plus PALS電位和納米粒度分析儀(美國布魯克海文)，BS-223S型分析天平(北京賽多利斯)，ME104/02型分析電子天平(上海梅特勒-托利多)，XH-C型旋渦混合器(金壇白塔新寶)。

1.2 研究方法

1.2.1溶劑偽三元相圖的構(gòu)建 混合乳化劑采用乳化劑與助乳化劑以一定的質(zhì)量比(Km)混勻。按照1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2及9 ∶1(W/W)的質(zhì)量比混合(固定體系質(zhì)量為1 g)油相與混合乳化劑，渦旋狀態(tài)下持續(xù)加入超純水，記錄液體體系中由渾濁至澄清時(shí)加水量及各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。分別以水相、油相、Km作為3個(gè)頂點(diǎn)，利用Orgin 7.5軟件構(gòu)建偽三元相圖，以乳化區(qū)域面積(圖中M區(qū)域)作為考察指標(biāo)。

1.2.2乳化劑的種類的考察 固定油相為檸檬桉油，助乳化劑為無水乙醇，Km為2 ∶1，總質(zhì)量為1 g。設(shè)置油相 ∶混合乳化劑為1 ∶9、2 ∶8、3 ∶7、4 ∶6、5 ∶5、6 ∶4、7 ∶3、8 ∶2及9 ∶1，分別采用吐溫80、聚氧乙烯蓖麻油及HS15進(jìn)行乳化劑種類的考察。精密稱量各比例油相與混合乳化劑置于試管中，渦旋，25 ℃超純水滴定，至溶液渾濁且再滴加無變化；肉眼直接觀察，將形成具有藍(lán)色乳光的澄明溶液點(diǎn)確定為自微乳的可形成區(qū)域，以此作為相變點(diǎn)為臨界點(diǎn)的加水量繪制偽三元相圖。

1.2.3助乳化劑的選擇 根據(jù)上述結(jié)果，確定HS15為乳化劑，固定油相為檸檬桉油，固定總質(zhì)量為1 g，分別設(shè)置甘油、無水乙醇、丙二醇為助乳化劑。將乳化劑和助乳化劑按Km為2 ∶1混勻，再與油相按9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8及1 ∶9的比例混勻、渦旋，25 ℃超純水滴定；肉眼觀察，自微乳的形成區(qū)域以澄明溶液并具有藍(lán)色乳光的點(diǎn)確定，加水量為混勻體系由渾濁到澄清時(shí)的量，以各組分在渾濁到澄清時(shí)臨界點(diǎn)的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)繪制偽三元相圖；自微乳化區(qū)域采用相圖中自微乳區(qū)邊線以水的頂點(diǎn)作切線，朝向混合乳化區(qū)頂點(diǎn)區(qū)域內(nèi)的體系可用水無限稀釋，根據(jù)相圖中自微乳區(qū)域篩選助表面活性劑；偽三元相圖面積結(jié)果提升甘油和丙二醇的乳化面積較大，但由于常溫下易分層不穩(wěn)定，故選用無水乙醇作為助乳化劑。

1.2.4Km的確定 根據(jù)偽三元相圖面積，油相采用檸檬桉油，乳化劑為HS15、無水乙醇為助乳化劑，考察不同Km(1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1及3 ∶1)對(duì)微乳形成的影響。

1.2.5油與Km比例的考察 以檸檬桉油為油相，HS15為乳化劑、無水乙醇為助乳化劑，根據(jù)偽三元相圖面積，考察不同油相與Km之間比例(9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8及1 ∶9)對(duì)微乳形成的影響，確定初步的檸檬桉油自微乳處方。

1.2.6星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化處方 為了更好地評(píng)價(jià)檸檬桉油自微乳的處方，根據(jù)偽三元相圖篩的結(jié)果，以粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，油相質(zhì)量百分比(X1)和Km(X2)作為影響自微乳性質(zhì)的考察因素；“1.2.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果證實(shí)，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～70%成乳效果好，有利于自微乳體系的穩(wěn)定與形成，因此本研究設(shè)定油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～70%，Km值采用偽三元相圖考察；最大的乳化面積時(shí)Km為2，故Km的范圍為1～3；采取星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法，以粒徑(Y)為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)化處方，各成分進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式的擬合使用Design expert 8.0.6軟件，擬合方程繪制表達(dá)各指標(biāo)與各成分之間關(guān)系的三維效應(yīng)面，響應(yīng)面優(yōu)化由曲線圖確定。油相與Km值的水平見表1。

表1 檸檬桉油自微乳處方因素與水平Tab.1 Prescription factors and levels of lemon eucalyptus oil from microemulsion

1.2.7檸檬桉油SMEDDS藥劑學(xué)性能考察 取按照最佳處方制備所得的檸檬桉油SMEDDS，超純水稀釋10倍，觀察其外觀；采用Nanobrook 90Plus PALS電位及納米粒度分析儀，測(cè)定稀釋后的檸檬桉油SMEDDS粒徑大小、分布情況以及Zeta電位。

2 結(jié)果

2.1 乳化劑種類

偽三元相圖面積表明， HS15、聚氧乙烯蓖麻油和吐溫80的乳化面積中HS15乳化面積最大，且相對(duì)穩(wěn)定、不易分層。見圖1。

圖1 不同乳化劑制備的檸檬桉油偽三元相圖面積Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram area of lemon eucalyptus oil prepared with different emulsifiers

2.2 助乳化劑

偽三元相圖的乳化面積結(jié)果表明，檸檬桉油為油相，HS15為乳化劑，無水乙醇、丙二醇及甘油作為助乳化劑的相圖面積從大到小依次為甘油、丙二醇及無水乙醇，但丙二醇和甘油作助乳化劑時(shí)，其穩(wěn)定性較差，易于分層，故選無水乙醇作為助乳化劑。見圖2。

圖2 不同助乳化劑制備的檸檬桉油偽三元相圖面積Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram area of eucalyptus lemon oil prepared by different auxiliary emulsifiers

2.3 Km值

在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，固定總質(zhì)量為1 g，以檸檬桉油為油相，HS15為乳化劑，無水乙醇為助乳化劑，分別設(shè)置Km值為1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1及3 ∶1，油相與Km值的比例分別為9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8及1 ∶9，進(jìn)行偽三元相圖的繪制，結(jié)果表明Km值為1 ∶1、1 ∶2、2 ∶1及3 ∶1的偽三元相圖中Km為3 ∶1時(shí)其微乳區(qū)域面積最大，但因靜置易分層，故選擇Km值為2 ∶1進(jìn)行下一步研究。見圖3。

圖3 不同Km值制備的檸檬桉油偽三元相圖面積Fig.3 Pseudo-ternary phase diagram area of lemon eucalyptus oil prepared with different Km values

2.4 油與Km比例

結(jié)果表明，檸檬桉油與乳化劑Km比例為1 ∶9時(shí)沒有乳化現(xiàn)象，比例為8 ∶2和9 ∶1時(shí)不穩(wěn)定、容易分層，比例為2 ∶8、3 ∶7及4 ∶6時(shí)外觀呈半透明且?guī)в兴{(lán)色乳光的均一乳液且較為穩(wěn)定、不易分層。因此，初步確定油相與Km之間的比例為2 ∶8、3 ∶7及4 ∶6來進(jìn)行下一步考察。見表2。

表2 檸檬桉油與乳化劑Km比例的考察Tab.2 The investigation of lemon eucalyptus oil to Km ratio

2.5 星點(diǎn)響應(yīng)面優(yōu)化處方

表3 處方的星點(diǎn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Prescription dot design with results

2.6 效應(yīng)面分析

當(dāng)油相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，粒徑隨著Km值的增大而減?。划?dāng)Km值一定時(shí)，隨著油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，粒徑相應(yīng)減小，呈反比的關(guān)系；與油相相比，Km對(duì)粒徑的影響較大，通過三維效應(yīng)面圖、擬合方程及軟件預(yù)測(cè)等綜合分析，確定以粒徑大小為考察指標(biāo)，理論最佳處方中油相占比為45%，Km為2 ∶1，即檸檬桉油45%、HS15 36.7%及無水乙醇18.3%。見圖4。

注：顏色越深表示變化趨勢(shì)越急劇。圖4 檸檬桉油粒徑的三維效應(yīng)面分析Fig.4 Three-dimensional effect surface analysis of the grain size of lemon eucalyptus oil

2.7 處方驗(yàn)證

按照優(yōu)化的最佳處方，精密稱取HS15 0.366 7 g、無水乙醇0.183 3 g，及檸檬桉油0.450 0 g，渦旋混勻，旋渦過程中逐滴加純水8 mL，制備得檸檬桉油自微乳液，呈略帶藍(lán)色乳光的半透明微乳；粒徑測(cè)定結(jié)果提示，最佳處方粒徑的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值未見明顯差異，指標(biāo)的相對(duì)誤差均小，提示星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所擬合的方程在本研究中預(yù)測(cè)效果良好。見表4。

表4 檸檬桉油自微乳液粒徑的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值Tab.4 Real and predicted particle size of lemon eucalyptus oil self-microemulsion

2.8 最佳處方的確定

結(jié)合前述結(jié)果，選用得到的最佳處方為油相為檸檬桉油，表面活性劑為HS15，助表面活性劑為無水無水乙醇，Km=2 ∶1。

2.9 檸檬桉油自微乳性質(zhì)考察

制備所得的檸檬桉油自微乳為藍(lán)色乳光的均一液體，有良好的流動(dòng)性，靜置不分層；稀釋后的檸檬桉油SMEDDS粒徑測(cè)定結(jié)果表明，其平均粒徑為49.05 nm，粒度分布呈單峰態(tài)勢(shì)，Zeta電位為5.33 mV。見圖5。

圖5 檸檬桉油自微乳的性質(zhì)考察Fig.5 Study on the properties of lemon eucalyptus oil self-emulsion

3 討論

HS15是新型非離子型增溶劑和乳化劑，安全范圍大，已被德國、英國、美國及歐洲藥典收錄[30]。本課題組前期制備的相關(guān)劑型考察結(jié)果表明，其具有良好的乳化性、穩(wěn)定性和均一性[31]。本研究結(jié)果表明，該劑型在檸檬桉油SMEDDS的制備過程中也發(fā)揮了重要作用。

檸檬桉油為具有較強(qiáng)的揮發(fā)性化合物構(gòu)成的揮發(fā)油體系，當(dāng)前采用的開放式系統(tǒng)的溶出度考察方法容易導(dǎo)致?lián)]發(fā)性物質(zhì)的丟失，從而難以完全代表檸檬桉油的特性[32-33]，因此本研究沒有進(jìn)行檸檬桉油溶出度的考察。

油相、乳化劑、助乳化劑的種類及比例能夠明顯影響微乳的理化性質(zhì)[34]。本研究采用檸檬桉油作油相，HS15與甘油Km值為2 ∶1做混合乳化系統(tǒng)的處方乳化面積最大，但因分層不穩(wěn)定而采用其他方案。因此采用正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的方法容易導(dǎo)致SMEDDS的考察精度不夠，數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性難以獲得理想的結(jié)果[35]，故本研究采用自微乳體系廣泛使用的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法，優(yōu)化設(shè)計(jì)混合乳化劑與油相的配比，結(jié)果證實(shí)該方法能夠獲得更合理和更準(zhǔn)確的結(jié)果。

通過觀察與選擇，本研究確定了檸檬桉油SMEDDS的處方。根據(jù)乳化面積等比較可得到油相 ∶乳化劑為45% ∶55%效果較佳，具體工藝為稱取處方量的檸檬桉油、HS15、無水乙醇置于試管中，磁力攪拌混合均勻，得油相；渦旋狀態(tài)下，向油相中緩慢滴加處方量的純化水，即得檸檬桉油自微乳。

本研究單因素考察采用利用偽三元相圖，星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化檸檬桉油SMEDDS處方，分析其藥劑學(xué)性能表征，為檸檬桉油資源的優(yōu)效配置與使用提供新型藥物遞送系統(tǒng)的參考。