孫思潔， 張海兵， 耿曉如， 章杭， 胡陽陽， 周東亞

(南京中醫(yī)藥大學(xué)沭陽附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 南京 223600)

食管癌(esophageal cancer，EC)指原發(fā)于食管黏膜上皮的惡性腫瘤，根據(jù)病理特點主要分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer，ESCC)兩種組織學(xué)亞型[1]。EC是世界范圍內(nèi)第九大常見癌癥，是全球第六大癌癥相關(guān)死亡的主要原因，患者5年生存率僅有15%～25%[2-3]。手術(shù)、放療、化療和聯(lián)合治療是目前食管癌最常見的治療方式[4]，食管腫瘤切除術(shù)是EC的主要治療方法，但許多患者由于年齡大而不能忍受手術(shù)，或病變處于晚期并伴有淋巴轉(zhuǎn)移而不適合手術(shù)切除[5]，因此對于這些患者而言，最終的放/化療被認為是這些患者的標準治療模式[6]。雖然放射治療在晚期EC的治療中起著重要的作用，然而由于放射耐受和腫瘤復(fù)發(fā)等障礙，結(jié)果仍然不令人滿意，同時還會出現(xiàn)不良并發(fā)癥[7]。因此，提高放射治療的效率是非常重要的。Su等[8]通過對人食管鱗癌細胞株KYSE-150和人食管癌放療抵抗細胞株KYSE-150R中microRNA表達譜進行差異分析發(fā)現(xiàn)，與人食管鱗癌細胞株KYSE-150相比，hsa-miR-21在KYSE-150R的相對表達量下降了約2/3，提示miR-21與食管癌細胞放療敏感性相關(guān)。Chen等[9]研究結(jié)果也證實了這一說法，還提到miR-21對食管癌進展的影響是通過調(diào)節(jié)腫瘤DNA活性完成的；有研究同樣提出miR-21可能參與調(diào)節(jié)腫瘤DNA損傷反應(yīng)[10]。因此，本研究探討miR-21通過調(diào)節(jié)DNA損傷對食管癌放療敏感性的影響及其機制，旨在為提高臨床食管癌的放射治療療效奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞、藥品及主要試劑 人食管癌KYSE150細胞株購自ATCC(上海佰曄生物科技中心代理)，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國賽默飛世爾科技公司(HyClone, Logan, Utah, USA)，滅活胎牛血清購于德國(FBS, PAN, Adenbach, Germany)，KYSE150細胞購自美國賽默飛世爾科技公司，Lipo3000轉(zhuǎn)染劑購自美國愛普拜斯公司，RT-qPCR試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.2主要儀器 細胞培養(yǎng)箱購自美國賽默飛世爾科技公司，化學(xué)發(fā)光儀Chemi-Scope mini imaging system購自德國西門子公司(劑量率為0.5 Gy/min)，流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特有限公司，酶標儀購自美國英杰生命技術(shù)有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 取出液氮中保存的人食管癌KYSE150細胞株，于37 ℃水浴鍋中2 min內(nèi)融化完全，吹打細胞混勻，移至離心管內(nèi)，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，1 000 r/min離心3 min，棄上清，再加入適量新的完全培養(yǎng)基重懸細胞，再移至培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%～90%時，倒出培養(yǎng)基，以PBS洗滌后，加入0.25%胰蛋白酶消化細胞。一般待細胞傳代1～2次后狀態(tài)穩(wěn)定，方可取此時生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2放療抵抗細胞株的構(gòu)建 將處于指數(shù)生長期的KYSE150細胞置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，模擬食管癌患者放射治療過程，使用X放射線照射KYSE150細胞，培養(yǎng)瓶底朝上，放固體水模板，劑量率為2 Gy/min，照射完成后立即放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞長到90%密度時，胰蛋白酶消化傳代至新的培養(yǎng)瓶，重復(fù)上述操作直至細胞累計接受劑量與臨床照射類似。X射線照射分16次完成，總劑量40 Gy(1 Gy 4次、2 Gy 4次、3 Gy 4次、4 Gy 4次)。X放射線照射KYSE150細胞使用含10%熱滅活胎牛血清(FBS, PAN, Adenbach, Germany)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并穩(wěn)定傳代。親本株細胞KYSE150同步進行傳代20次，不進行X射線照射。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染 通過基因編輯技術(shù)合成hsa-miR-21 mimic和miR-21 inhibitor，使用Lipo3000進行細胞轉(zhuǎn)染。將親本株KYSE150和耐藥株KYSE150R細胞胰酶消化并計數(shù)，以3×105接種于6孔細胞培養(yǎng)皿中，使用OPTI-MEM 培養(yǎng)基(250 μL)稀釋miR-21 mimic(5 μL) 或 miR-21 inhibitor使用 OPTI-MEM 血清培養(yǎng)基(250 μL)稀釋 Lipo 3000試劑(5 μL)，稀釋后室溫放置5 min，與稀釋的Lipo 3000 在室溫孵育20 min。棄培養(yǎng)基，PBS清洗；將混合物慢慢加入各孔細胞，輕輕搖晃至混合均勻，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后更換生長培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后得到KYSE-150細胞對照組(miR-21 inhibitor NC轉(zhuǎn)染KYSE-150細胞)、KYSE-150 細胞實驗組(miR-21 inhibitor 轉(zhuǎn)染 KYSE-150細胞)、KYSE-150R 細胞對照組(miR-21 mimic NC轉(zhuǎn)染 KYSE-150R細胞)及KYSE-150R細胞實驗組(miR-21 mimic轉(zhuǎn)染 KYSE-150R細胞)，通過RT-qPCR檢測4組細胞中miR-21的表達水平評估轉(zhuǎn)染是否成功，轉(zhuǎn)染成功可進行后續(xù)實驗。

1.2.4克隆形成實驗檢測放射敏感性 取轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，輕輕用0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，稀釋并計數(shù)，將適量細胞接種于6孔板中，貼壁24 h后，給予X射線照射，劑量率為2 Gy/min，照射完成后立即放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)14 d，檢測體外克隆形成活性。用PBS洗滌兩次后，甲醇固定，姬姆薩染色，低倍鏡下計數(shù)>50個細胞的克隆數(shù)。X射線設(shè)置為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 Gy等劑量點，每個劑量點設(shè)3復(fù)孔，每孔的細胞數(shù)分別為500、1 000、2 000、3 000、4 000個，計算細胞存活分數(shù)，根據(jù)單靶多擊模型模擬存活曲線。

1.2.5增殖實驗 取轉(zhuǎn)染后48 h的細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并離心，作活細胞計數(shù)，96孔板的每孔均接種1×104細胞。固定時間收集細胞，用MTT法檢測細胞活力。每次加CCK-8檢測液20 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定OD吸光度。

1.2.6DNA損傷反應(yīng)元件磷酸化水平 Western blot分析 p-ATM(Ser1981)、p-ATR(Ser428)、p-BRCA1(Ser1524)、p-Chk1(Ser345)、p-Chk2(Thr68)、p-H2AX(Ser139)、p-p53 (Ser15)、p53的表達，Westernblot檢測DNA損傷反應(yīng)元件磷酸化水平。按照SDS-PAGE制膠試劑盒分別制備12%分離膠與5%濃縮膠，提取后的蛋白溶液調(diào)整濃度至1 g/L，取10μL加入同等體積的loading buffer混勻，95 ℃煮沸5 min，迅速點樣至上樣孔，80 V、30 min至樣品與loading buffer混合物開始進入濃縮膠時，調(diào)整電壓180 V，60 min；半干法恒壓15 V，轉(zhuǎn)PVDF膜1 h；室溫封閉(封閉液通常為5% 脫脂奶粉，檢測磷酸化樣品用5% BSA)1 h；棄封閉液，1×TBST洗膜，5 min/次×3次，加一抗，4 ℃搖過夜；回收一抗，1× TBST洗膜，5 min/次× 3次，加二抗，室溫搖1 h；棄二抗，T BST洗膜，5 min/次×3次；加入化學(xué)發(fā)光底物(等量A液和B液，現(xiàn)用現(xiàn)配，用化學(xué)發(fā)光儀Chemi-Scope mini imaging system曝光成像。該研究中的抗體包括p-ATM(Ser1981)、p-ATR(Ser428)、p-BRCA1(Ser1524)、p-Chk1(Ser345)、p-Chk2(Thr68)、p-H2AX(Ser139)、p-p53 (Ser15)、p53和β-actin。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 放療敏感性

細胞轉(zhuǎn)染成功后，采用克隆形成實驗檢測細胞存活分數(shù)，結(jié)果如圖1所示，在親本株KYSE150細胞中，inhibitor-KYSE150組細胞存活分數(shù)高于陰性對照組inhibitor NC組(P<0.05)；在放療抵抗KYSE150R細胞中，mimic-KYSE150R在細胞存活分數(shù)低于陰性對照組mimic NC-R組(P<0.05)；說明抑制miR-21可提高癌細胞放療敏感性，而過表達miR-21能降低癌細胞對放療的敏感性。

圖1 miR-21對KYSE150和KYSE150R 放療敏感性的影響Fig.1 Effects of miR-21 on the radiotherapy sensitivity of KYSE150 and KYSE150R

2.2 細胞增殖能力

inhibitor-KYSE150組細胞增殖曲線高于陰性對照組inhibitor NC組，mimic-KYSE150R在細胞增殖曲線低于陰性對照組mimic NC-R組(P<0.05)。說明抑制miR-21可提高癌細胞增殖能力，而過表達miR-21能抑制癌細胞增殖。見圖2。

圖2 miR-21對KYSE150和KYSE150R增殖能力的影響Fig.2 Effects of miR-21 on the proliferation of KYSE150 and KYSE150R

2.3 DNA損傷情況

結(jié)果如圖3所示， inhibitor-KYSE150組細胞中p-ATM、p-ATR、p-H2AX、p-BRCA1、p-CHK1、p-CHK2及p-p53表達水平低于inhibitor NC組細胞(P<0.05)；mimic-KYSE150R組細胞中p-ATM、p-ATR、p-H2AX、p-BRCA1、p-CHK1、p-CHK2及p-p53表達水平高于mimic NC-R組細胞(P<0.05)，結(jié)果提示抑制miR-21可抑制癌細胞中DNA損傷，而過表達miR-21能促進癌細胞中DNA損傷的發(fā)生。

注：A為Western blot檢測p-ATM、p-ATR、p-H2AX、p-BRCA1、p-CHK1、p-CHK2及p-p53蛋白表達水平,B為p-ATM、p-ATR、p-H2AX、p-BRCA1、p-CHK1、p-CHK2及p-p53統(tǒng)計分析結(jié)果； (1)與inhibitor-NC組比較，P<0.05；(2)與mimic NC-R組比較，P<0.05。圖3 miR-21對KYSE150和KYSE150R DNA損傷的影響Fig.3 Effects of miR-21 on DNA damage of KYSE150 and KYSE150R

3 討論

MicroRNAs(miRNAs)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各種細胞過程中的基因表達，作為腫瘤抑制因子或致癌基因。MiRNAs也在EC相關(guān)多藥耐藥(MDR)中發(fā)揮重要作用，從而影響EC治療的療效[11]。如Jin等[12]通過沉默miR-193b促進Cyclin D1的表達，增加了放療的敏感性。Su等[13]對比放療抵抗和無放療抵抗食管癌患者的差異表達基因發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-21的表達水平差異約12.8倍，這表明miR-21與食管癌細胞放療敏感性相關(guān)。

本研究通過梯度劑量放射處理誘導(dǎo)放療抵抗KYSE150R細胞，通過RT-qPCR證實了miR-21在KYSE150R細胞中的表達與親本株KYSE150之間存在差異。隨后對親本株KYSE150和放療抵抗KYSE150R細胞分別進行miR-21 inhibitor和miR-21 mimic轉(zhuǎn)染，采用RT-qPCR鑒定轉(zhuǎn)染成功后，對四組細胞進行克隆形成實驗和增殖實驗檢測，評估m(xù)iR-21表達水平對食管癌放療敏感性的影響。結(jié)果表明，在親本株KYSE150細胞中轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor可增加克隆形成數(shù)，癌細胞增殖能力提高，說明抑制miR-21表達可提高食管癌細胞增殖能力，降低放射敏感性；在放療抵抗KYSE150R細胞中轉(zhuǎn)染miR-21 mimic可降低克隆形成數(shù)，癌細胞增殖能力下降，說明過表達miR-21可降低食管癌細胞增殖能力，提高放射敏感性。因此，本研究認為：過表達miR-21能夠提高食管癌放療敏感性。

既往相關(guān)研究還表明miR-21參與多種癌癥的發(fā)生和進展[14-16]，并與DNA損傷相關(guān)[17]。因此，本文將對miR-21在食管癌放療敏感性調(diào)控中的機制進行探究。多項研究表明放療抵抗與DNA損傷/修復(fù)、細胞周期、細胞凋亡以及信號通路相關(guān)基因表達之間具有緊密聯(lián)系[18-21]，DNA損傷是抗腫瘤活性的中心機制[22]。DNA受損時，DNA損傷元件被激活，如DNA損傷傳感器ATM和ATR，激活的ATM和ATR進一步使下游因子H2AX、BRCA1、CHK1和CHK2發(fā)生磷酸化，從而影響參與細胞周期進展和細胞存活的下游因子，這些DNA損傷元件磷酸化水平可反映DNA受損情況[23]。既往研究還通過體外提取miR-21證實了其能夠通過與程序性細胞死亡因子(programmed cell death 4, PDCD4)的3'-非翻譯區(qū)(UTR)相互作用，降低食管癌細胞侵襲能力，表示過表達miR-21可降低食管癌細胞對順鉑的敏感性[24]，這與本研究結(jié)果一致。

本研究進一步從DNA損傷方面探究了miR-21可降低食管癌細胞放療敏感性的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-21可抑制癌細胞中DNA損傷，而過表達miR-21能促進癌細胞中DNA損傷的發(fā)生。這與Yang[24]的研究結(jié)果相似，其研究結(jié)果表示，miR-21可調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)并認為這種調(diào)節(jié)是通過MSH2完成的。本研究表明miR-21可作為一個潛在的放療治療中調(diào)節(jié)放療抵抗性的靶標，并且miR-21調(diào)節(jié)食管癌放療敏感性的作用與誘導(dǎo)和促進癌細胞DNA損傷相關(guān)。