袁蘊(yùn)馨， 簡單， 張姝，， 何蕓， 孫朝琴，， 黃健， 莫非，**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種定植于人胃黏膜的革蘭陰性螺旋桿菌。據(jù)報道，世界范圍內(nèi)H.pylori感染率高達(dá)50%，且呈逐年上升的趨勢[1]。H.pylori在人體內(nèi)通常難以清除，H.pylori長期感染是引起慢性胃炎、消化性潰瘍及胃腺癌等胃腸道疾病的原因之一[2]，1994年H.pylori被世界衛(wèi)生組織列為一級致癌物[3-4]。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein3，NLRP3)炎癥小體是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合體，主要在固有免疫細(xì)胞中表達(dá)，如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[5]。NLRP3炎性小體作為固有免疫的重要組分，在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[6]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)嚴(yán)格監(jiān)管NLRP3在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，激活NF-κB信號通路，能夠使在未激活的巨噬細(xì)胞中低表達(dá)的NLRP3的表達(dá)增加；另外，活化的NLRP3可激活天冬氨酸蛋白水解酶 1(caspase-1)，活化的caspase-1繼而促進(jìn)無活性的炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1beta，IL-1β)前體和IL-18前體的加工，形成成熟的IL-1β和IL-18釋放入體內(nèi)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)生[7-8]。在由細(xì)胞因子介導(dǎo)的H.pylori感染相關(guān)的炎癥反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-1β和IL-18在H.pylori感染的胃黏膜中的分泌明顯增加[9-10]。此外，NLRP3不僅能被機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性物質(zhì)或某種細(xì)胞狀態(tài)的變化所激活，也可以捕捉病毒、細(xì)菌等病原微生物入侵的“危險信號”[11-12]。研究表明，H.pylori空泡毒素VacA可促進(jìn)胃上皮細(xì)胞NLRP3炎性小體的激活，H.pylori的感染與NLRP3炎癥小體的活化密切相關(guān)[13]。因此，NLRP3炎癥小體可能成為H.pylori相關(guān)性胃炎提供新的治療靶點。頭花蓼(Polygonumcapitatum, PC)是一種具有貴州地方特色的民族藥，因其具有抗菌、抗炎、清熱及利濕等功效被廣泛使用[14-15]。本課題組前期研究表明，PC可顯著降低H.pylori在胃黏膜的定植率，同時可緩解H.pylori引起的小鼠胃黏膜炎癥反應(yīng)，減輕其導(dǎo)致的胃炎等疾病[16]，但PC是否能夠通過影響NF-κB/NLRP3/IL-1β信號通路發(fā)揮作用尚未見研究報道。鑒于H.pylori感染引起的是全身性炎癥反應(yīng)，本研究以骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)為研究對象，觀察PC對H.pylori刺激后的BMDMs細(xì)胞模型中NF-κB/NLRP3/IL-1β信號通路的影響，以期發(fā)現(xiàn)新的PC作用靶點，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細(xì)胞株及菌株 BMDMs購自青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，H.pyloriSS2000由中國疾病控制中心傳染病所張建中研究員惠贈。

1.1.2主要藥物、試劑及儀器 PC浸膏粉(貴州威門藥業(yè))；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(欣博盛生物)，抗鼠IL-1β抗體(美國 Cell Signaling Technology)，抗兔NF-κB /p65 抗體和抗兔NLRP3抗體(英國 Abcam)；三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher Scientific)，Western blot電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和酶標(biāo)儀(英國Bio-Rad)，低溫離心機(jī)(美國Beckman)，紫外分光光度計(日本SHIMADZU)。

1.2 實驗方法

1.2.1H.pylori復(fù)蘇、培養(yǎng)及鑒定 從-80 ℃冰箱中取出含H.pyloriSS2000菌株的凍存管，室溫下溶解，用移液器將含菌凍存液轉(zhuǎn)移至哥倫比亞血瓊脂平板內(nèi)，平板放入37 ℃的5%O2、10%CO2、85%N2及95%相對濕度的三氣恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h待用；觀察H.pylori生長狀況，穩(wěn)定傳代3次后進(jìn)行革蘭染色、觸酶試驗、快速尿素酶試驗和氧化酶試驗，以鑒定H.pylori。

1.2.2細(xì)菌-細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立及分組 收集處于指數(shù)生長期的BMDMs，于培養(yǎng)皿中加無血清高糖(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培養(yǎng)基，饑餓培養(yǎng)4 h；收集H.pylori，使用含10%胎牛血清無雙抗高糖DMEM培養(yǎng)基將其配制成均勻菌液，紫外分光光度計測定菌液D600值，計算菌液濃度并將菌液稀釋至3.0×105CFU/L。用四甲基偶氮唑鹽比色法(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)試劑盒，檢測H.pylori對BMDMs細(xì)胞的影響。按照不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI；細(xì)菌數(shù) ∶細(xì)胞數(shù))分為空白、25 ∶1、50 ∶1、100 ∶1、200 ∶1、400 ∶1，96孔板中培養(yǎng)各組細(xì)胞12 h，加0.005 g/L MTT 20 μL，培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)150 μL，室溫震蕩溶解結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀檢測D450值。

1.2.3細(xì)胞上清液中IL-18和IL-1β的表達(dá) 以MOI分別為空白、25 ∶1、50 ∶1及100 ∶1的比例置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加H.pylori菌液刺激，培養(yǎng)3、6、12及24 h，倒置顯微鏡下觀察H.pylori感染的BMDMs的細(xì)胞形態(tài)，收集各時間的培養(yǎng)上清液及細(xì)胞， ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-18和IL-1β的表達(dá)水平，根據(jù)ELISA試劑說明書，并嚴(yán)格按照實驗操作步驟進(jìn)行操作，向各孔中加反應(yīng)終止液100 μL，混勻并立即測量D450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各孔中IL-18和IL-1β的含量。

1.2.4PC治療模型的建立及分組 將BMDMs分為空白組、模型組及PC治療組，模型組和PC治療組中加H.pylori，以MOI為100 ∶1刺激12 h；PC治療組BMDMs中藥物終質(zhì)量濃度根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果確定，以0.08 μg/L PC處理48 h[17]；空白組和模型組BMDMs給予等量DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

1.2.5NF-κB單體p65(NF-κB/p65)、NLRP3、IL-1β前體(IL-1β precursor，Pro-IL-1β)及IL-1β蛋白的表達(dá) 收集空白組、模型組及PC治療組BMDMs，使用PBS洗滌3次，加含1%苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的蛋白裂解液(RIPA lysis buffer, RIPA)，冰上裂解30 min，12 000 r/min于4 ℃離心10 min，取上清液，采用蛋白定量(bicinchoninic acid assay，BCA)法對其進(jìn)行蛋白定量；根據(jù)胞漿、胞核蛋白提取試劑說明書，對空白組、模型組及PC治療BMDMs的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的蛋白進(jìn)行提取，使用BCA法定量；總蛋白以β-actin為內(nèi)參蛋白，核蛋白以LaminB為內(nèi)參蛋白；向蛋白樣品加SDS loading buffer，100 ℃煮沸10 min，行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)；200 mA恒流冰浴電泳轉(zhuǎn)膜1.5 h，打開轉(zhuǎn)移夾，肉眼可見清晰的Marker轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)上；使用雜交膜清洗液(TBS with tween-20，TBST)漂洗后放于封閉液中，室溫震蕩封閉2 h；加相應(yīng)抗體孵育；凝膠成像儀中曝光采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖

MTT比色法結(jié)果顯示，當(dāng)MOI高于100 ∶1時，細(xì)胞抑制率增高，BMDMs的數(shù)量減少(P<0.05)。見圖1。

圖1 H.pylori對BMDMs細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of H.pylori on BMDMs cell proliferation

2.2 H.pylori感染的細(xì)胞形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察BMDMs形態(tài)，結(jié)果表明，空白組細(xì)胞豐滿呈梭形、表面光滑、顆粒物質(zhì)少，模型組BMDMs多數(shù)變圓、表面不光滑、顆粒物質(zhì)明顯增多。見圖2。

空白組 模型組圖2 H.pylori感染的BMDMs細(xì)胞形態(tài)(未染色鏡檢，×100)Fig.2 Cellular morphology of H. pylori infected-BMDMs(unstained samples under microscopic examination，×100)

2.3 IL-1β和IL-18的表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)H.pylori刺激后，BMDMs中IL-1β 和IL-18的表達(dá)水平增高，與H.pylori呈明顯的濃度依賴性；當(dāng)MOI為100 ∶1且作用于DMEMs 12 h時，IL-1β 和IL-18的表達(dá)水平達(dá)到峰值，且高于空白組(P<0.05)。見圖3。

注：A、B為不同細(xì)菌與細(xì)胞比例下IL-1β、IL-18濃度；C、D為不同感染時間下IL-1β、IL-18濃度；(1)與細(xì)菌與細(xì)胞比例0組或感染時間3 h組比較，P<0.05。圖3 H.pylori感染BMDMs的共培養(yǎng)模型中 IL-1β和IL-18的表達(dá)Fig.3 The expression levels of IL-1β and IL-18 in BMDMs cocultured with H. pylori

2.4 NF-κB/p65的表達(dá)

與空白組相比，模型組BMDMs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)減少、細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，PC治療組BMDMs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)升高、細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot檢測NF-κB/p65表達(dá)，B、C為NF-κB/p65的蛋白定量結(jié)果；(1)與空白組比較，P<0.05；(2)與模型組比較，P<0.05。圖4 各組BMDMs細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中NF-κB/p65蛋白表達(dá)Fig.4 NF-κB/p65 expression levels in the cytoplasm and nuclei of BMDMs in each group

2.5 NLRP3、IL-1β及Pro-IL-1β蛋白的表達(dá)

研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組BMDMs中NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，PC治療組BMDMs中NLRP3、IL-1β蛋白表達(dá)減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各組BMDMs中 Pro-IL-1β蛋白表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5。

注：A為IL-1β、Pro-IL-1β、NLRP3的Western blot檢測結(jié)果；B、C、D為IL-1β、Pro-IL-1β、NLRP3蛋白的定量結(jié)果；(1)與空白組相比，P<0.05；(2)與模型組相比，P<0.05。圖5 各組BMDMs中 NLRP3、IL-1β及Pro-IL-1β 蛋白的表達(dá)Fig.5 Proteins expression levels of NLRP3, IL-1β, and Pro-IL-1β in BMDMs in each group

3 討論

H.pylori是一種革蘭氏陰性螺旋狀桿菌，通常定植于人體的胃黏膜和十二指腸黏膜，是胃炎的主要致病因子，其引起的炎癥反應(yīng)可進(jìn)一步發(fā)展為胃黏膜腸化生，甚至癌變[18-19]。H.pylori在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，我國H.pylori總感染率達(dá)56.22%[20]。在西醫(yī)上，H.pylori的治療主要采用質(zhì)子泵抑制劑(鉍劑)聯(lián)合兩抗生素的三聯(lián)或四聯(lián)療法，但由于抗生素的廣泛使用，使得H.pylori對抗生素的耐藥性增強(qiáng)，根除率逐年下降[21]。因此，尋求新的治療H.pylori感染的方法成為亟待解決的問題。

PC作為“十大苗藥產(chǎn)業(yè)鏈”之一，具有清熱解毒、活血化瘀等多重療效，臨床上可用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[22]。有研究表明，PC的水提物顯示出良好的抗菌、抗炎效果，具有進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用的前景[17]；本課題組前期研究也表明，PC能夠抑制H.pylori生長，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，可對H.pylori胃炎小鼠進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，并抑制其胃腸激素的紊亂，改善內(nèi)環(huán)境[23]。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)MOI為100 ∶1時，且作用于DMEMs 12 h時，IL-1β和IL-18的產(chǎn)生達(dá)到最大值；當(dāng)MOI高于100 ∶1時，H.pylori可抑制BMDMs的增殖，這表明當(dāng)H.pylori達(dá)到一定濃度時，其會對BMDMs細(xì)胞產(chǎn)生一定的細(xì)胞毒性，影響其正常生長。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空白組BMDMs細(xì)胞豐滿呈梭形、表面光滑、顆粒物質(zhì)少，H.pylori感染后大多數(shù)細(xì)胞變圓、表面不光滑、顆粒物質(zhì)明顯增多，提示H.pylori感染可引起B(yǎng)MDMs細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，這可能是H.pylori突破BMDMs細(xì)胞的細(xì)胞屏障，在細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，產(chǎn)生毒素和其他代謝產(chǎn)物進(jìn)而損傷BMDMs細(xì)胞造成的。

NLRP3是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白復(fù)合物，與多種慢性炎癥相關(guān)。有研究表明，H.pylori能夠活化NLRP3炎癥小體，并進(jìn)一步誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞分泌成熟的IL-1β[24]。作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，NLRP3在H.pylori引起的慢性炎癥中扮演著重要的角色。Li等[25]研究顯示，H.pylori可通過活性氧(reactive oxygen species，ROS)信號通路激活NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)人單核細(xì)胞系產(chǎn)生IL-1β和IL-18；另外有研究表明，中藥可通過抑制NLRP3等炎癥因子的活化控制病情[26]；Choi等[27]研究表明，查爾酮衍生物可通過抑制白細(xì)胞介素-1受體激活的激酶4 (interleukin-1 receptor-activated kinase 4 ，IRAK4)/核因子抑制蛋白-α(inhibitor of NF-κB-α，IκBα)/NF-κB信號通路阻斷H.pylori引起的NLRP3炎癥小體的激活，抑制IL-1β、IL-18及caspase-1的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)；Lian等[28]研究結(jié)果顯示，廣藿香醇能抑制H.pylori引起的單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等促炎因子的分泌，且經(jīng)廣藿香醇作用后，NLRP3的表達(dá)水平較模型組明顯降低，因此其機(jī)制可能與抗氧化活性、抑制促炎因子的分泌和調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體功能有關(guān)。

在本研究中，經(jīng)PC作用后，與模型組相比，PC治療組BMDMs細(xì)胞漿內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB/p65蛋白表達(dá)減少，表明PC可抑制由H.pylori引起的NF-κB/p65核內(nèi)轉(zhuǎn)移，且可抑制炎癥反應(yīng)中NLRP3、IL-1β及IL-18的表達(dá)上調(diào)，因此有理由認(rèn)為PC可通過調(diào)節(jié)NF-κB/NLRP3/IL-1β信號通路在H.pylori胃炎中發(fā)揮治療作用。