趙哲儀， 王正蓉， 方興艷， 王甜， 羅昭遜， 謝婷婷*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心， 貴州 貴陽 550004； 4.山東省立第三醫(yī)院 檢驗科， 山東 濟南 250031； 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 兒科學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

地方性砷中毒是嚴(yán)重危害人體健康的生物地球化學(xué)性疾病之一，目前已發(fā)現(xiàn)的地方性砷中毒病區(qū)遍布于全球70多個國家，至少有2億人面臨砷暴露的風(fēng)險[1]。砷中毒是以多臟器多系統(tǒng)損害為特點的全身性疾病，肝臟亦是砷毒作用的主要靶器官之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)，砷所致機體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡、細(xì)胞凋亡信號通路異常是砷中毒的重要機制[3-4]。哺乳動物不育系20樣激酶1(mammalian sterile 20-like kinases 1，MST1)和MST2是不育系20樣激酶家族中具有進(jìn)化保守性的、編碼絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶的同源基因[5]。以往動物及細(xì)胞水平的研究表明，MST1和MST2能通過調(diào)節(jié)多條信號通路促進(jìn)氧化應(yīng)激和凋亡，且磷酸化MST1/2(phosphorylated-MST1/2,p-MST1/2)能通過激活Hippo信號通路抑制一系列抗氧化及抗凋亡因子的表達(dá)[6-8]。盡管MST1和MST2與砷毒性作用相關(guān)的信號通路存在相互作用關(guān)系[9-10]，但目前未有報道表明砷對肝細(xì)胞p-MST1/2、MST1及MST2表達(dá)水平的影響。因此，本研究用亞砷酸鈉(sodium arsenite，NaAsO2)對正常肝細(xì)胞AML12進(jìn)行染毒處理，探究砷對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡以及MST1/2表達(dá)的影響，為砷所致肝損傷疾病的防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細(xì)胞來源 小鼠正常肝細(xì)胞AML12購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 NaAsO2(美國Merck公司)，2.5 g/L胰蛋白酶溶液、DMEM/F-12培養(yǎng)基及磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS；美國Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS；美國Corning公司)，青霉素、鏈霉素(美國Hyclone公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿(無錫耐思生物科技有限公司)，細(xì)胞凍存液、普通RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、蛋白marker和聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)，化學(xué)發(fā)光試劑(electrochemiluminescence，ECL；美國Millipore公司)，活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，二辛可寧酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗小鼠p-MST1/2單克隆抗體(美國CST公司)，兔抗小鼠MST1、MST2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗(英國Abcam公司)，兔抗小鼠半胱氨酸蛋白酶3剪接體(cleaved caspase 3, c-caspase 3)單克隆抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)。

1.1.3主要儀器 倒置光學(xué)顯微鏡(日本OLympus公司)，ELX800 酶標(biāo)儀(美國Bio-Teck公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，小型垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)、NaAsO2染毒處理及分組 小鼠正常肝細(xì)胞AML12用含10%FBS的DMEM /F-12培養(yǎng)基，于5%CO2、37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)；待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，進(jìn)行傳代、凍存及后續(xù)實驗。常規(guī)培養(yǎng)時，每隔2 d進(jìn)行換液，傳代比例為1 ∶2；待細(xì)胞融合率達(dá)80%時，棄原培養(yǎng)基，0、10、15、20、25及30 μmol/L NaAsO2的完全培養(yǎng)基溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以不含NaAsO2為對照組，其余各濃度NaAsO2處理組為實驗組。

1.2.2熒光探針染色法檢測AML12細(xì)胞內(nèi)ROS含量 取處于對數(shù)生長期的AML12細(xì)胞接種于6孔板中，實驗組NaAsO2染毒處理后，棄各組細(xì)胞的原培養(yǎng)基，加含10 μmol/L活性氧熒光探針(DCFH-DA)的DMEM/F-12培養(yǎng)基1 mL繼續(xù)于37 ℃孵育細(xì)胞1 h；棄含染料的培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞2次，加適量PBS于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強度。

1.2.3化學(xué)比色法檢測AML12細(xì)胞內(nèi)SOD活性 取處于對數(shù)生長期的AML12細(xì)胞接種于6孔板中，實驗組NaAsO2染毒處理后，消化收集各組細(xì)胞至離心管，按每500萬細(xì)胞加蛋白提取液1 mL，行超聲破碎裂解細(xì)胞后，4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取部分上清測定蛋白濃度，再按說明書配制SOD活性檢測反應(yīng)體系行吸光度檢測，計算每克樣本質(zhì)量中MDA的含量；每組樣本設(shè)置3個復(fù)孔，并重復(fù)3次實驗。

1.2.4Western blot法檢測AML12細(xì)胞內(nèi)p-MST1/2、MST1、MST2及c-caspase 3蛋白相對表達(dá)量 取處于對數(shù)生長期的AML12細(xì)胞接種于6孔板中，實驗組NaAsO2染毒處理后，棄各孔中原培養(yǎng)基，按100 ∶1 ∶1的比例加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑提取總蛋白；經(jīng)BCA法測定蛋白濃度，再將蛋白樣品與1/4倍體積的5×SDS-PAGE上樣緩沖液充分混勻，置于100 ℃金屬浴中加熱8 min；各組蛋白均以40 μg上樣量進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA封閉2 h，TBST洗膜3次、10 min/次，分別加p-MST1/2抗體(1 ∶1 000)、MST1抗體(1 ∶10 000)、MST2抗體(1 ∶10 000)及c-caspase 3抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶10 000)于4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次、10 min/次，加山羊抗兔IgG二抗(1 ∶10 000)于室溫孵育2 h，TBST洗滌3次、10 min/次，ECL顯影；采用Image J軟件統(tǒng)計蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照計算各目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗；計量資料呈正態(tài)分布且方差齊時，組間比較采用單因素方差分析法，進(jìn)一步兩兩比較采用最小顯著性差異法(least significance difference t test,LSD-t)；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ROS含量

倒置熒光顯微鏡結(jié)果表明，與對照組相比，隨著NaAsO2濃度的增高，10～30 μmol/L NaAsO2各組小鼠AML12細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強度逐漸增強，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為熒光探針染色法檢測結(jié)果(200×)，B為熒光強度的定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖1 各組小鼠AML12細(xì)胞的ROS表達(dá)Fig.1 The contents of ROS in AML12 hepatocytes of mice in each group

2.2 SOD活性

化學(xué)比色法檢測結(jié)果表明，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2各組小鼠AML12細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖2 各組小鼠AML12肝細(xì)胞的SOD活性Fig.2 The activity of SOD in AML12 hepatocytes of mice in each group

2.3 p-MST1/2、MST1、MST2和c-caspase 3蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，10～30 μmol/L NaAsO2組小鼠AML12細(xì)胞內(nèi)p-MST1/2蛋白相對表達(dá)量增加(P<0.05)，20～30 μmol/L NaAsO2組小鼠AML12細(xì)胞內(nèi)MST1蛋白相對表達(dá)量降低、c-caspase 3蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)，15～30 μmol/L NaAsO2組小鼠AML12細(xì)胞內(nèi)MST2蛋白相對表達(dá)量升高(P<0.05)。見圖3。

注：A為Western blot檢測各蛋白結(jié)果；B為各蛋白表達(dá)的定量結(jié)果；(1)與對照組比較，P<0.05；(2)與10 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(3)與15 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(4)與20 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05；(5)與25 μmol/L NaAsO2組比較，P<0.05。圖3 各組小鼠AML12細(xì)胞內(nèi)p-MST1/2、MST1、MST2及c-caspase 3蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.3 The protein expression levels of p-MST1/2, MST1, MST2, and c-caspase 3 in AML12 hepatocytes of mice in each group(Western blot)

3 討論

ROS是一類具有高化學(xué)反應(yīng)活性的含氧物質(zhì)，其主要來源于線粒體內(nèi)的氧化呼吸鏈[11]。當(dāng)機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)不足以清除氧化物質(zhì)，使得ROS過度積累，最終導(dǎo)致組織細(xì)胞損傷[12]。SOD作為生物體內(nèi)的一線抗氧化酶，在清除ROS、維持氧化與抗氧化平衡中具有重要作用，其水平高低可直接反應(yīng)體內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)[13]。而ROS作為連接氧化應(yīng)激和凋亡的樞紐，可通過多種途徑激活凋亡信號通路，進(jìn)而促進(jìn)caspase-3發(fā)生裂解而活化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。本研究通過體外構(gòu)建砷暴露細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)：隨著染砷劑量的增加，AML12細(xì)胞內(nèi)ROS含量逐漸增加，SOD活性逐漸下降，c-caspase 3蛋白相對表達(dá)量逐漸增加，提示砷可以明顯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡。

MST1和MST2作為不育系20樣激酶家族中受到廣泛研究的成員，在細(xì)胞氧化應(yīng)激、凋亡、增殖、分化等多種生物學(xué)過程中都發(fā)揮著重要作用[15-16]。研究表明，MST1/2屬于Hippo信號通路中關(guān)鍵的信號傳導(dǎo)激酶，可在氧化應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)生自磷酸化而被激活，活化的MST1/2可通過激酶級聯(lián)反應(yīng)抑制一系列抗凋亡因子的表達(dá)[17-19]。此外，基因敲除實驗表明，敲低MST1/2能降低p53的表達(dá)量及caspase-3的活性，從而抑制細(xì)胞凋亡[20-21]。本實驗結(jié)果顯示，在NaAsO2誘導(dǎo)AML12細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡過程中，p-MST1/2和MST2蛋白的相對表達(dá)量增加，MST1蛋白相對表達(dá)量逐漸降低，推測MST1/2可能通過其磷酸化形式以及提高caspase-3活性參與了砷致肝損傷過程，但其具體生物學(xué)機制有待深入研究。與本實驗結(jié)果類似的，Shi等[22]和Wang等[23]分別在不同細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中發(fā)現(xiàn)，p-MST1或p-MST1/2的表達(dá)量顯著上升而MST1的表達(dá)量顯著下降。Lu 等[24]還發(fā)現(xiàn)在紫外線引起HaCat表皮細(xì)胞凋亡過程中，隨著紫外線作用時間的延長，MST1蛋白表達(dá)量逐漸降低，而分子量為34 kDa的MST1蛋白片段逐漸增多。MST1在多種凋亡刺激作用下，可被caspase-3切割成分子量為34 kDa的高活性促凋亡片段，該片段通過進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)磷酸化組蛋白H2B，從而使得染色質(zhì)固縮、DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[25-26]。因此，分析本研究中MST1降低的原因可能有：(1)MST1發(fā)揮促凋亡的作用可能主要依賴于其磷酸化形式，故在p-MST1/2升高而MST1降低時細(xì)胞仍然能發(fā)生凋亡；(2)伴隨著caspase-3活性的增高，部分MST1經(jīng)caspase-3切割活化，導(dǎo)致MST1蛋白呈逐漸降低趨勢。

綜上所述，NaAsO2可促進(jìn)小鼠正常肝細(xì)胞AML12發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡，在此過程中p-MST1/2、MST1及MST2蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)異常。本研究僅初步驗證了砷對p-MST1/2、MST1及MST2蛋白表達(dá)水平的影響，還需深入探討MST1/2在砷致肝損傷過程中所調(diào)控的具體信號通路。