王 秦，胡 航，龔順澤，徐德鋒

（常州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇常州 213164）

苦皮藤（Celastrus angulatus）為衛(wèi)矛科南蛇藤屬的植物，為中國的特有植物，分布于河南、陜西等地，主要生長于海拔1 500 m左右山地叢林及山坡灌叢中。20世紀30年代，陳嶸[1]就發(fā)現(xiàn)了苦皮藤的殺蟲作用，20世紀80年代以后，吳文君等[2]從苦皮藤中分離得到了一些結(jié)構(gòu)新穎、具有獨特生物活性的β-二氫沉香呋喃倍半萜多醇酯類化合物（即苦皮藤素），掀起了對該植物的研究熱潮。關(guān)于苦皮藤素制備藥劑，人們研究主要集中在乳油和微乳劑的開發(fā)。吳文君等[2]開發(fā)的0.2%苦皮藤素乳油通過相關(guān)試驗表明其在菜青蟲上有著較好的防效。陳軍等[3]研發(fā)的1%苦皮藤素微乳劑在室內(nèi)與大田試驗中對菜青蟲和小菜蛾的防效較好。

更為環(huán)保綠色的苦皮藤素水乳劑開發(fā)鮮有報道。水乳劑是一種將難溶于水的農(nóng)藥原藥通過少量有機溶劑，加入適當(dāng)?shù)娜榛瘎?，最終制得以微小液滴形式分散在水中，在一定時期內(nèi)熱力學(xué)穩(wěn)定，外觀為乳白色的O/W型乳狀液。同乳油或微乳劑相比，水乳劑大大降低了有機溶劑或乳化劑用量，目前已成為國際上公認的綠色環(huán)保農(nóng)藥制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景[4-5]。然而，水乳劑是一種非均相分散體系，其儲存過程中會有析油、浮膏等穩(wěn)定性破壞現(xiàn)象發(fā)生。影響水乳劑穩(wěn)定性因素主要有乳化劑種類與濃度、體系pH、電解質(zhì)離子等。乳狀液穩(wěn)定性表征方法主要以液滴平均粒徑及其分布測定與液滴Zeta電位來體現(xiàn)[6-7]。因此，為了探究相關(guān)影響因素對苦皮藤素水乳劑穩(wěn)定性的影響規(guī)律，本研究通過測定不同條件下水乳劑的平均粒徑和液滴Zeta電位，分析了影響水乳狀液穩(wěn)定性的原因，并最終開發(fā)了一種穩(wěn)定的苦皮藤素水乳劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑：含苦皮藤素Ⅴ12%的苦皮藤素原藥，實驗室自制；苦皮藤素Ⅴ標(biāo)準品，上海詩丹德標(biāo)準技術(shù)服務(wù)有限公司；10%氰戊菊酯乳油，上海悅聯(lián)化工有限公司。

供試蟲：玉米象，渠首天然趣味昆蟲館提供。

1.2 儀器與試劑

YH-A600天平，上海英衡稱重設(shè)備有限公司；AL204分析天平，賽多利斯公司；VCX-500超聲波粉碎機，美國Sonics公司；ZSE粒徑電位檢測儀，英國馬爾文儀器有限公司；數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋HH-4與磁力攪拌ZNCL-T，鞏義市予華儀器有限公司；Agilent 1260 HPLC，美國安捷倫有限公司。

分析純的氯化鈉、氯化鈣、氯化鐵、硫酸鎂，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硅膠粉（300～400目），安徽良臣硅源材料有限公司；苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（農(nóng)乳600），江蘇省海安石油化工廠；十二烷基苯磺酸鈣（農(nóng)乳500）、蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-40）、蓖麻油聚烴氧酯（EL-35）、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯（Tween-80）、脫水山梨醇油酸酯（Span-80）、?？松梨诜枷銦N溶劑Solvesso 150，東莞市千和化學(xué)科技有限公司；黃原膠，江蘇古貝生物科技有限公司；乙二醇，上海凌峰化學(xué)試劑公司；有機硅阻泡劑，東莞博誠化工有限公司；自制去離子水。

1.3 苦皮藤素水乳劑的制備

將苦皮藤素原藥與芳香烴溶劑混合攪拌，控制溫度40～60℃，500～100 r/min攪拌5～10 min，再加入去離子水、非離子型表面活性劑、增稠劑、防凍劑、消泡劑等，控溫40～60℃，1 000～2 500 r/min攪拌15～25 min，使用超聲均質(zhì)破碎5～10 min，最終制備得到苦皮藤素水乳劑。

1.4 性能表征

1.4.1 外觀

觀察乳狀液外觀顏色及所屬混合分散系類別，按照GB/T 31737—2015《農(nóng)藥傾倒性測定方法》判斷傾倒性是否良好。

1.4.2 稀釋穩(wěn)定性測試

根據(jù)GB/T 1603—2001《農(nóng)藥乳液穩(wěn)定性測定方法》測定苦皮藤素水乳劑的稀釋穩(wěn)定性。稱取無水氯化鈣304 g和帶結(jié)晶水的氯化鎂0.139 g于1 000 mL的容量瓶中，用蒸餾水溶解稀釋至刻度即可制得標(biāo)準硬水。取250 mL燒杯，加入100 mL 30±2℃標(biāo)準硬水，用移液槍準確吸取0.5 mL苦皮藤素水乳劑試樣，在2～3 r/s速度勻速攪拌的情況下慢慢滴加到硬水中，使其配成100 mL乳狀液。滴畢持續(xù)攪拌30 s，立即將乳狀液移至清潔、干燥的100 mL量筒中，并將量筒恒溫水浴，在30±2℃范圍內(nèi)，靜置1 h后取出，觀察乳液有無浮油、浮膏和沉淀出現(xiàn)。

1.4.3 低溫穩(wěn)定性試驗

依據(jù)GB/T 19137—2003《農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法》進行測定。取苦皮藤素水乳劑10 mL裝入安瓿瓶中封口，共制6瓶。將裝有測試樣的安瓿瓶放置0±2℃冰箱中，7 d后進行觀察和分析。

1.4.4 高溫穩(wěn)定性試驗

根據(jù)GB/T 19136—2003《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法》進行高溫穩(wěn)定性檢測。取苦皮藤素水乳劑10 mL裝入安瓿瓶中封口，共制6瓶。將裝有測試樣的安瓿瓶放置于54±2℃恒溫箱中，14 d后進行觀察和分析。

1.4.5 苦皮藤素水乳劑粒徑與電位測定

取苦皮藤素水乳劑0.1 mL稀釋20倍，使用Malvern-Nano ZSE粒徑電位檢測儀進行測量，每組測樣3次，取平均值。

1.5 室內(nèi)藥效試驗

取0.3%苦皮藤素水乳劑分別制備500、1 000、1 500倍稀釋液。試驗共分為5個處理，其中以10%氰戊菊酯乳油500倍液為對照藥劑，清水為空白對照，以玉米象為供試蟲，做好標(biāo)記分成5組，每組20只。采用噴霧法，按照標(biāo)記各組分別噴灑10%氰戊菊酯乳油500倍液，0.3%苦皮藤素水乳劑500、1 000、1 500倍液和清水。噴藥后定期觀察玉米象的生命狀況，統(tǒng)計不同試驗組在處理后的害蟲存活數(shù)，并按式（1）計算防效。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦皮藤素水乳劑的乳化劑篩選

2.1.1 乳化劑種類的選擇

不同原藥制備水乳劑所需的乳化劑的種類以及用量都各不盡相同，良好的乳化劑可以使得乳狀液形成穩(wěn)定的非均勻分散體系，且在極端天氣下也無分層、析油等破乳現(xiàn)象發(fā)生。研究選擇幾種常用于水乳劑制備的表面活性劑來進行篩選，得出結(jié)果如表1。

表1 不同乳化劑制備苦皮藤素水乳劑的測試結(jié)果

由表1可知，不同乳化劑所制得苦皮藤素水乳劑差異很大，OP-4、OP-10無法制備生成穩(wěn)定的乳狀液；農(nóng)乳500等可以制成穩(wěn)定的乳狀液，但在通過相應(yīng)測試，出現(xiàn)分層，亦不穩(wěn)定；乳化劑農(nóng)乳600、EL-35、EL-40、Tween-80、Span-85等各項指標(biāo)表現(xiàn)良好。因此，本研究選擇部分表現(xiàn)穩(wěn)定的乳化劑進行低溫?zé)豳A實驗。不同乳化劑的低溫?zé)豳A試驗結(jié)果如圖1所示。盡管試驗所供試乳化劑均為非離子乳化劑，乳狀液體系的Zeta電位卻均為負值，但這與王莉、徐雪峰等[8-9]相關(guān)報道一致，原因可能為非離子乳化劑生產(chǎn)中有未能完全參與反應(yīng)的有機酚，工業(yè)級的乳化劑沒有將其有效去除，在油水界面層，酚類物質(zhì)和非離子乳化劑形成復(fù)合界面膜，而有機酚解離導(dǎo)致界面電荷為負。

圖1 不同乳化劑制備水乳劑平均液滴的粒徑與Zeta電位絕對值

根據(jù)DLVO理論[10]：當(dāng)Zeta電位絕對值較高時，可以削弱范德華引力，避免液滴間因相互靠近而聚結(jié)變大，從而提高乳狀液的物理穩(wěn)定性；相反，當(dāng)Zeta電位絕對值較低時，液滴間斥力減小并逐漸靠近，最終因相互吸引而團聚，從而破壞乳狀液的穩(wěn)定性。乳狀液是一種非均相分散體系，且液滴粒徑大小不均勻，小液滴容易與大液滴合并，加速聚結(jié)、沉降及析油等不穩(wěn)定現(xiàn)象的發(fā)生。根據(jù)斯托克斯公式，液滴的沉降速率與其粒徑大小有關(guān)，即液滴粒徑越小，沉降速率越慢，分布越集中，越有利于乳狀液體系的穩(wěn)定[11]。因此乳狀液的液滴平均粒徑越小，Zeta電位絕對值越大，乳狀液則越穩(wěn)定。

乳狀液在儲存中會因外部環(huán)境和自身屬性改變從而分層沉降或相轉(zhuǎn)變等破壞其穩(wěn)定體系的分布狀態(tài)，并發(fā)生奧式熟化。不同乳化劑制備的苦皮藤素水乳劑經(jīng)過冷藏、熱貯試驗后的樣品中的平均液滴粒徑和Zeta電位如圖2所示。結(jié)果表明，乳化劑EL-40制備的水乳劑液滴平均粒徑最小、Zeta電位絕對值最大，說明在EL-40更適合應(yīng)用苦皮藤素水乳劑體系。

圖2 不同乳化劑在低溫與熱貯試驗中液滴平均粒徑與Zeta電位

2.1.2 乳化劑濃度的選擇

乳化劑的用量影響水乳劑的穩(wěn)定性，一般乳化劑用量為2%～15%[12]。本研究使用乳化劑EL-40，濃度分別為3%、5%、7%、9%、11%來制備水乳劑。從圖3可以看出，當(dāng)乳化劑的使用量為9%時，液滴平均粒徑最小、Zeta電位絕對值最大。因為使用乳化劑過少時，其在油水界面的吸附不夠飽和，界面膜電荷密度較低，Zeta電位絕對值較小，使得粒子間排斥力較小，導(dǎo)致粒子間易于發(fā)生聚集，故液滴平均粒徑較大。而隨著乳化劑濃度的增加，乳化劑在油水界面吸附增強，Zeta電位絕對值增大，液滴平均粒徑減小，粒子間不易發(fā)生聚集，乳狀液的穩(wěn)定性增強[8]。

圖3 不同濃度的EL-40在冷藏試驗中液滴平均粒徑與Zeta電位絕對值

2.2 苦皮藤素水乳劑水相條件的篩選

2.2.1 pH值的選擇

同樣，不同pH值的水中存在的H＋與OH-也是影響乳狀液穩(wěn)定的因素[13]。通過加入不同濃度HCl與NaOH來調(diào)節(jié)水相的pH值，使得pH=1、3、5、7、9、11、13，進行苦皮藤素水乳劑的制備。結(jié)果如圖4所示，在所研究的pH值范圍內(nèi)，液滴的Zeta電位絕對值隨著pH值的增加先增大后減小，在pH=7時達到最大。同時，隨著pH值的增加，液滴的平均粒徑在pH=7時，粒徑最小。分析原因可能為，在酸性環(huán)境下非離子乳化劑中的聚氧乙烯基團會吸附水中的H＋而發(fā)生質(zhì)子化，使得非離子乳化劑攜帶一定的正電荷，從而中和了乳狀液界面膜所帶負電荷，這就導(dǎo)致界面膜所帶電荷數(shù)下降，因此Zeta電位絕對值變小，而隨著pH值增大至堿性，體系中會引入一定量的鈉離子，正離子與油水界面膜發(fā)生緊密吸附，從而壓縮雙電層，導(dǎo)致Zeta電位絕對值下降。

圖4 不同pH制備苦皮藤素水乳劑平均液滴的粒徑與Zeta電位絕對值

2.2.2 無機鹽離子

在pH=7時，添加不同種類和濃度電解質(zhì)離子制備的水乳劑測量其樣品的液滴平均粒徑和Zeta電位如圖5所示。相對于添加純水而言，添加不同類別的電解質(zhì)做制備的水乳劑其液滴平均粒徑均在一定程度上增大，而液滴的Zeta電位的絕對值也因添加電解質(zhì)而減小。在添加同一種電解質(zhì)時，隨著其濃度由0.001 mol/L到0.1 mol/L依次遞增時，水乳劑中液滴的平均粒徑呈遞增趨勢，Zeta電位的絕對值呈遞減趨勢，即隨著電解質(zhì)離子的添加與濃度遞增苦皮藤素水乳劑的穩(wěn)定性降低。這樣的試驗結(jié)果亦可以用DLVO理論解釋：非離子表面活性劑EL-40因有機酚解離導(dǎo)致液滴界面負電荷，其液滴界面通過吸附產(chǎn)生靜電位阻來提高O/W型乳狀液的穩(wěn)定性，而添加一定的無機鹽后，相應(yīng)量的電解質(zhì)離子進入液滴界面滑移面，使得雙電層變薄，導(dǎo)致Zeta電位的絕對值降低，乳狀液的穩(wěn)定性降低[14-15]，而對于同一種電解質(zhì)離子，其濃度越高壓縮雙電層的能力越強，Zeta電位的絕對值下降越多，乳狀液穩(wěn)定性會更差。

圖5 不同電解質(zhì)制備水乳劑的液滴平均粒徑與Zeta電位絕對值

2.3 配方的確定及性能檢測

根據(jù)上述試驗結(jié)果，確定0.3%苦皮藤素水乳劑配方為苦皮藤素原藥1.66%、EL-40 9.0%、Solvesso150 15%、乙二醇4.0%、消泡劑0.1%、增稠劑0.02%，去離子水補足至100%。所制的水乳劑外觀為乳白色流動性良好且均一的液體，無浮膏、析水等現(xiàn)象產(chǎn)生。產(chǎn)品指標(biāo)檢測結(jié)果見表2，均達到產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準要求。

表2 0.3%苦皮藤素水乳劑質(zhì)量指標(biāo)檢測結(jié)果

2.4 生物活性測定結(jié)果

以玉米象為供試蟲，10%氰戊菊酯乳油500倍液作為對照藥劑，測定0.3%苦皮藤素水乳劑的室內(nèi)殺蟲活性。通過表3可以看出，施藥1 d后，不同稀釋倍數(shù)的0.3%苦皮藤素水乳劑防效均較10%氰戊菊酯乳油500倍液低，表明其速效性差。施藥7 d后，0.3%苦皮藤素水乳劑的500、1 000倍液防效均高于氰戊菊酯乳油，并且苦皮藤素水乳劑500倍稀釋液的殺蟲活性最高。

表3 0.3%苦皮藤素水乳劑防治玉米象的室內(nèi)試驗結(jié)果

3結(jié) 論

本試驗通過確定乳化劑的種類與使用量、水的pH和電解質(zhì)離子，得到了苦皮藤素水乳劑的具體配方為：苦皮藤素原藥1.66%、EL-40 9.0%、Solvesso150 15%、乙二醇4.0%、消泡劑0.1%、增稠劑0.02%，去離子水補足至100%。

所制0.3%苦皮藤素水乳劑，通過稀釋、熱貯、冷藏等穩(wěn)定性試驗，其外觀、液滴平均粒徑、Zeta電位等證明其符合水乳劑質(zhì)量要求。室內(nèi)活性試驗顯示，藥后7 d，0.3%苦皮藤素水乳劑500倍液對玉米象的防效為90%，且高于10%氰戊菊酯乳油500倍液。

玉米象為儲糧蟲害，化學(xué)農(nóng)藥氰戊菊酯毒性過高，更安全的植物源殺蟲劑苦皮藤素水乳劑在儲糧蟲害防治應(yīng)用方面符合綠色發(fā)展理念，防效更高，有著廣闊的應(yīng)用前景。