梁仲堯　岑瑛

[摘要]目的：探討二肽基肽酶-4（DPP4）在瘢痕疙瘩中的表達(dá)情況。方法：分別獲取切除術(shù)后的瘢痕疙瘩組織及正常皮膚組織，然后通過(guò)蛋白免疫印跡方法、定量聚合酶鏈反應(yīng)，比較二者DPP4基因在蛋白和mRNA水平上表達(dá)的差異。結(jié)果：與正常皮膚組織相比，DPP4蛋白在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)高于正常皮膚，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），DPP4基因在mRNA水平上的表達(dá)高于正常皮膚（P<0.05）。結(jié)論：DPP4在瘢痕疙瘩中的表達(dá)上升，DPP4可能在促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化、纖維化形成方面有一定作用。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩;纖維化;二肽基肽酶-4;實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng);蛋白免疫印跡;基因表達(dá);成纖維細(xì)胞

[中圖分類號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2022）01-0087-03

Study on the Expression of Dipeptidyl Peptidase-4 in Keloids

LIANG Zhongyao1，CEN Ying2

（1.West China Clinical Medical College of Sichuan University，Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China;2.Department of Plastic and Aesthetic Surgery，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610000，Sichuan，China）

Abstract： Objective To explore the expression of dipeptidyl peptidase-4 in keloids. Methods The keloid tissue and normal skin tissue after resection were obtained， and then the differences in the expression of DPP4 gene between the two were compared by Western blotting and quantitative polymerase chain reaction. Results Compared with normal skin tissue， the expression of DPP4 protein in keloid tissue was higher than that in normal skin， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression of DPP4 gene at mRNA level was higher than that in normal skin （P<0.05）. Conclusion The expression of DPP4 in keloids is increased. DPP4 may play a role in promoting fibroblast activation and fibrosis formation.

Key words： keloid; fibrosis; Dipeptidyl Peptidase-4; real-time polymerase chain reaction; blotting western; gene expression; fibroblast

瘢痕疙瘩（keloid）是整形外科中一類常見的皮膚纖維化疾病，發(fā)病機(jī)制大多與膠原纖維過(guò)度修復(fù)增生有關(guān)，其主要特征表現(xiàn)為高出于皮膚表面、侵襲性生長(zhǎng)和容易復(fù)發(fā)。有研究表明，在各種上皮細(xì)胞表面廣泛分布著一類T細(xì)胞表面抗原——二肽基肽酶-4（Dipeptidyl peptidase 4，DPP4）即CD26，是一種細(xì)胞膜表面的絲氨酸蛋白酶，其在成纖維細(xì)胞表面也有分布[1]。有研究表明DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞是一類功能更加活躍的細(xì)胞亞群，其主要參與形成細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度纖維化[2]。因此，臨床醫(yī)生很難不將瘢痕疙瘩的形成與DPP4的表達(dá)聯(lián)系在一起。本文中，筆者使用了蛋白免疫印跡、定量聚合酶鏈反應(yīng)兩種方法，以探討瘢痕疙瘩中DPP4在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)情況，進(jìn)一步說(shuō)明瘢痕疙瘩的形成與DPP4表達(dá)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料和方法

1.1 材料來(lái)源：10例瘢痕疙瘩組織和10例正常皮膚組織分別來(lái)源于四川大學(xué)華西醫(yī)院整形美容外科瘢痕疙瘩切除術(shù)后的多余組織和腹壁整形術(shù)、巨乳切除術(shù)后的多余皮膚組織。取得患者知情同意，然后分別獲取切除術(shù)后的瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織。患者合并有瘢痕疙瘩、增生性瘢痕疾病、其他皮膚疾病或癌癥不納入采納范圍。本研究符合倫理學(xué)要求。

1.2 蛋白免疫印跡法：將正常皮膚和瘢痕疙瘩組織剪碎后，加入RIPA裂解液，裂解完成后在4℃，12 000 g條件下離心5 min，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后用5×上樣緩沖液稀釋5倍，然后按照電泳（先80 V條件下電泳30 min，然后調(diào)整電壓至120 V繼續(xù)電泳使maker條帶明顯分離）、轉(zhuǎn)膜（4 ℃條件下過(guò)夜）、封閉（用5%脫脂奶粉TBST溶室溫封閉1 h）、孵育（一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h）的順序進(jìn)行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定DPP4蛋白在正常皮膚和瘢痕疙瘩中的表達(dá)情況。

1.3 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（Quantitative polymerase chain reaction，QPCR）：在液氮中將正常皮膚和瘢痕疙瘩組織研磨成粉末，按照離心柱法進(jìn)行組織總RNA提取，然后按照逆轉(zhuǎn)錄方法將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，最后利用SYBR法進(jìn)行熒光定量PCR，以確定DPP4基因在正常皮膚和瘢痕疙瘩組織mRNA上的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由Graphpad Prim 8.0.2軟件和SPSS 26.0完成。

2? 結(jié)果

2.1 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖1～2所示，DPP4蛋白在瘢痕疙瘩中的表達(dá)量高于正常皮膚，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 QPCR結(jié)果：如圖3所示，與正常皮膚組織相比，在瘢痕疙瘩組織上DPP4基因的mRNA表達(dá)水平更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3? 討論

瘢痕疙瘩的主要發(fā)生原因?yàn)橥鈧碳?，是一種組織修復(fù)過(guò)度，纖維化無(wú)法正常受控的疾病。皮膚發(fā)生外傷后，成纖維細(xì)胞在損傷皮膚修復(fù)方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，且修復(fù)的早中晚期發(fā)揮的作用也各不相同。修復(fù)早期：成纖維細(xì)胞分泌各種細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng)[3];分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肉芽組織形成，為其他細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)功能提供結(jié)構(gòu)支撐。修復(fù)晚期：成纖維細(xì)胞參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解與組織結(jié)構(gòu)重塑，在外源性因素作用下，成纖維細(xì)胞功能發(fā)生紊亂，主要表現(xiàn)出以下3點(diǎn)能力：①“活化”的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移力和收縮力，從而導(dǎo)致瘢痕疙瘩向皮損區(qū)外侵襲;②瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出更多的分泌膠原和細(xì)胞因子的能力，從而合成過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì);③向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化以及平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)上升會(huì)導(dǎo)致組織收縮。修復(fù)后期：瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)與組織結(jié)構(gòu)重塑的功能發(fā)生紊亂，從而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的堆積[4]。由此可見，成纖維細(xì)胞在瘢痕疙瘩的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著主要作用，但成纖維細(xì)胞并不是由單一一群細(xì)胞亞群組成的。有文獻(xiàn)[5]表明，成纖維細(xì)胞由一大類有著不同細(xì)胞表面抗原的成纖維細(xì)胞組成，其不僅會(huì)在增殖分化以及機(jī)體不同的生長(zhǎng)階段發(fā)生表型及功能的改變，而且在不同部位成纖維細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子、增殖能力以及細(xì)胞表型方面都有一定差異，在皮膚、真皮層和表皮層的成纖維細(xì)胞組成上也表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性。

在臨床實(shí)踐中，筆者發(fā)現(xiàn)不同患者以及不同部位來(lái)源的瘢痕疙瘩其治療效果有差異。這種治療上的異質(zhì)性促使筆者思考其是否與瘢痕疙瘩的異質(zhì)性有關(guān)。瘢痕疙瘩不能精準(zhǔn)化治療以及復(fù)發(fā)問(wèn)題一直是治療的重點(diǎn)難點(diǎn)[6]，而對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行更加準(zhǔn)確的靶向治療的方法就是定位關(guān)鍵的致病亞群。目前不少的文獻(xiàn)表明，DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞可能是纖維化疾病中一類關(guān)鍵的細(xì)胞亞群。從小鼠動(dòng)物模型里分選出來(lái)的成纖維細(xì)胞顯示，表達(dá)En1基因的成纖維細(xì)胞是合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)，參與各種纖維化過(guò)程的主要效應(yīng)細(xì)胞。而DPP4分子是一類可以作為區(qū)分En1表達(dá)情況的細(xì)胞表面標(biāo)記物，在皮膚纖維化模型動(dòng)物中，DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是參與形成導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)纖維化的主要細(xì)胞亞群[7]。在皮膚損傷過(guò)程中，活化的MAPK途徑可以增加表皮IL-1α的分泌，從而誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞DPP4表達(dá)上升，抑制DPP4表達(dá)可以抑制損傷導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的過(guò)程。DPP4在其他疾病中也起著作用，例如人們發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤、黑素瘤等腫瘤疾病中，DPP4陽(yáng)性與腫瘤細(xì)胞侵襲性增加有一定關(guān)系。在其他一些由外傷刺激誘發(fā)的腫瘤如宮頸癌等疾病中，DPP4分子在其中的真皮細(xì)胞與表皮細(xì)胞的表達(dá)都有顯著的上調(diào)[8]。另外有文獻(xiàn)表明，DPP4陽(yáng)性細(xì)胞亞群在結(jié)直腸癌、Ewing肉瘤、間皮瘤以及血液系統(tǒng)腫瘤中有著更高的侵襲性、增殖力以及腫瘤惡性。有文獻(xiàn)[9]表明，DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞不僅在瘢痕疙瘩中比例增加，DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞的TGF-β1、IGF-1、IL-6、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)也比DPP4陰性成纖維細(xì)胞要高。而抑制DPP4活性可以降低成纖維細(xì)胞增殖能力和TGF-β1分泌水平。

本研究通過(guò)蛋白免疫印跡和定量PCR法發(fā)現(xiàn)DPP4在瘢痕疙瘩中的表達(dá)上升，結(jié)合目前發(fā)現(xiàn)的DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞亞群的功能活躍情況，進(jìn)一步表明DPP4陽(yáng)性成纖維細(xì)胞可能是導(dǎo)致瘢痕疙瘩形成的主要細(xì)胞亞群，為今后對(duì)瘢痕疙瘩進(jìn)行精準(zhǔn)治療做了一些基礎(chǔ)鋪墊。

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[收稿日期]2020-03-12

本文引用格式：梁仲堯，岑瑛.二肽基肽酶-4在瘢痕疙瘩中的表達(dá)情況研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2022，31（1）：87-89.