賴海斌，周靜，陶俊，曾忠

（江西贛州市第五人民醫(yī)院結(jié)核科，贛州 341000）

結(jié)核病是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（包括結(jié)核、牛、非洲和田鼠分枝桿菌）和麻風(fēng)分枝桿菌感染人體引起的一種常見的傳染性疾病，臨床主要是根據(jù)患者不同的感染部位命名，如常分為肺結(jié)核、淋巴結(jié)結(jié)核、骨結(jié)核、泌尿系結(jié)核、肝結(jié)核等。在男性生殖系統(tǒng)疾病中附睪結(jié)核是一種常見的肺外結(jié)核，也是引起男性不育的重要病因，在泌尿生殖系統(tǒng)疾病中比較容易被誤診[1-2]。當(dāng)前臨床鑒定MTB仍然以傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)及液體培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)，抗酸染色檢測廉價，但檢出率有限，同時MTB培養(yǎng)法所需時間長，檢測過程中易受污染，導(dǎo)致部分患者難以早期獲得相應(yīng)治療[3-4]，熒光定量核酸擴增技術(shù)（Xpert MTB/RIF）檢測技術(shù)是臨床上較為常用而且快速的一種結(jié)核病診斷技術(shù)，常規(guī)用于結(jié)核病患者痰液、支氣管鏡肺泡灌洗液標(biāo)本及其他結(jié)核病變部位標(biāo)本檢測結(jié)核分枝桿菌及是否對利福平耐藥，在臨床應(yīng)用中具有較高的敏感性、高特異性，生物安全性好、檢測時間短等優(yōu)點。2010年WHO推薦在臨床Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)可用于肺結(jié)核痰標(biāo)本的檢測[5]，2013年WHO推薦Xpert MTB/RIF可以替代抗酸桿菌涂片、羅氏培養(yǎng)等技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌病的快速診斷。目前臨床上Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)用于在附睪結(jié)核標(biāo)本的檢測中尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道，本文為進(jìn)一步探析Xpert MTB/RIF技術(shù)用于附睪結(jié)核患者診斷及利福平耐藥性檢測中的臨床價值，收集80例患者入組觀察，具體報道如下。

1 資料及方法

1.1 基礎(chǔ)資料 納入本院2018年1月至2020年12月疑似附睪結(jié)核患者80例。疑似附睪結(jié)核患者入選標(biāo)準(zhǔn)：有肺結(jié)核病史、癥狀、體征，可觸及的附睪腫大；附睪穿刺所得膿液行病理學(xué)檢查提示結(jié)核可能；具有助于診斷的CT、MRI與B超檢查結(jié)果；附睪結(jié)核的確診標(biāo)準(zhǔn)：滿足以上疑似附睪結(jié)核性入選標(biāo)準(zhǔn)后加以下任何一點：附睪抽取標(biāo)本涂片找TB陽性及標(biāo)本行結(jié)核基因檢測陽性，結(jié)核病方案治療有效；附睪抽取標(biāo)本行固體或液體培養(yǎng)陽性，同時菌種鑒定排除非結(jié)核分枝桿菌（NTM）。知情此次研究內(nèi)容，自愿加入，且已同我院簽訂相關(guān)協(xié)議；精神正常，無老年癡呆、嚴(yán)重精神分裂、認(rèn)知功能障礙。排除標(biāo)準(zhǔn)：有凝血功能異常、自身免疫相關(guān)性疾??；嚴(yán)重肝功能異常，心功能不全，呼吸衰竭，腎衰竭；查驗基礎(chǔ)資料有缺損。80例患者年齡19~65歲，平均（45.5±19.5）歲。本方案的研究方法及患者知情情況均已通過我院倫理委員會的審查討論并批準(zhǔn)。

1.2 實驗材料及儀器試劑 穿刺采集腫大附睪膿液80份，傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)法（人工）以及羅氏培養(yǎng)管（珠海貝索生物技術(shù)有限公司），Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)由美國Cepheid公司研發(fā)，以半巢式熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，可同時對臨床收集的標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥性檢測，檢測儀器是全自動化，并且是一種全密閉檢測平臺。

1.3 方法

1.3.1 MTB培養(yǎng)及檢測 取膿液樣本1mL，使用40g/L的NaOH（氫氧化鈉）溶液處理樣本，接種于MTB培養(yǎng)基，于35℃環(huán)境中孵育，進(jìn)行為期4周的連續(xù)觀察，見MTB培養(yǎng)斜面有MTB菌落生長則記為陽性，反之陰性。

1.3.2 Xpert MTB/RIF檢測Xpert MTB/RIF技術(shù)具體操作步驟如下：將臨床收集的標(biāo)本進(jìn)行冰凍處理，再根據(jù)Xpert MTB/RIF檢測流程，將冰凍標(biāo)本沉淀物解凍，取1 mL標(biāo)本液，同時在標(biāo)本液中加入1.5 mL標(biāo)本處理液，輕微混勻標(biāo)本后放入室溫孵育15 min；依據(jù)儀器的檢測操作流程，取2 mL處理后的標(biāo)本加入到一次性的標(biāo)本盒中，然后將標(biāo)本盒置入4通道GeneXpert平臺中自動運行。加入標(biāo)本盒后約2 h，Xpert檢測系統(tǒng)可自動讀出結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)果與利福平耐藥結(jié)果。結(jié)果評估參照探針循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct)，內(nèi)對照探針Ct值≤38即為陽性，反之無效，提示標(biāo)本DNA提取含有PCR抑制物或不合格；5個探針中至少有2個探針Ct值≤35提示檢測結(jié)核分枝桿菌陽性，同時也可進(jìn)行半定量測定。參考值分別是高含量：Ct值＜16，中等含量：16~22，低含量：23~28，極低含量：＞28。

1.3.3 藥敏試驗 借助比例法將分離菌株研磨制為2-10 mg/mL及4-10 mg/mL的混懸液，各取0.01 mL菌液置于利福平培養(yǎng)基、對照培養(yǎng)基，于37℃恒溫箱內(nèi)進(jìn)行為期4周的培養(yǎng)觀察。

1.4 觀察指標(biāo) 記錄80例患者的臨床表現(xiàn)，以傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)法為參照計算Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測符合率，最終以傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)的菌種分型及藥敏結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計計算Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)在MTB檢測及其利福平耐藥性的符合率、靈敏度、特異性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，其中以[n（%）]作為疾病診斷的符合率、靈敏度等計數(shù)資料，最終完成χ2檢驗，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床表現(xiàn)情況

本次收集80例疑似附睪結(jié)核患者主要臨床表包括腫塊、消瘦、畏寒、盜汗、咳嗽、咯痰、憋氣等。見表1。

表1 80例疑似附睪結(jié)核臨床表現(xiàn)統(tǒng)計結(jié)果[n（%）]

2.2 利福平藥敏試驗結(jié)果 本次利福平藥敏實驗中培養(yǎng)法共計檢出MTB利福平耐藥18份（25.71%），敏感52份（74.29%），Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測中檢出利福平耐藥17份（21.25%），敏感53份（75.71%），其中敏感樣本中1份樣本為假敏感。見表2所示，應(yīng)用Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測MTB利福平耐藥情況其符合率、靈敏度、特異度與培養(yǎng)法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩種檢測方法利福平耐藥性檢測符合率、靈敏度、特異度比較

3 討論

泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核是因結(jié)核分枝桿菌感染引起的一種常見的難治感染性疾病，男性附睪結(jié)核出現(xiàn)附睪積液或附睪膿腫，在臨床診治過程中容易被誤診、誤治，延誤患者治療或就診泌尿外科行手術(shù)切除治療，最終導(dǎo)致不育或術(shù)后傷口潰爛無法愈合，嚴(yán)重影響患者生理及心理，加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，影響生活質(zhì)量。附睪結(jié)核在疾病早期階段無明顯臨床癥狀，附睪無不適感，臨床上也無明顯的低熱、盜汗等結(jié)核全身中毒表現(xiàn)，且附睪結(jié)核的發(fā)病率通常較低，而且附睪結(jié)核病灶病變部位特殊，早期該病急性發(fā)作時，與附睪炎、精索發(fā)炎癥狀十分相似，附睪結(jié)核病理變化主要有干酪樣壞死、肉芽組織形成、纖維化、鈣化等[6]，這些病理演變復(fù)雜多變，或單獨存在，或同時存在，與急性細(xì)菌性附睪炎、慢性附睪炎急性發(fā)作、陰囊腫瘤性疾病合并感染等非結(jié)核性疾病不易鑒別，易造成漏診或延誤診斷，臨床上因此容易被忽視，大部分出現(xiàn)附睪體尾部不規(guī)則腫塊，腫塊逐漸蔓延至附睪頭體部、睪丸，甚至形成陰囊冷膿腫，繼而出現(xiàn)膿腫破潰、竇道形成。附睪結(jié)核的診斷及治療在臨床上面臨極大挑戰(zhàn)，疾病中晚期常出現(xiàn)切除附睪、睪丸的嚴(yán)重后果，較易誤診，因此對附睪結(jié)核的早期診治極為重要[7-8]。目前診斷結(jié)核病的主要方法包括抗酸染色鏡檢、MTB培養(yǎng)法、線性探診技術(shù)、基因芯片技術(shù)、Gene Xpert檢測系統(tǒng)等[9]，目前臨床常用的傳統(tǒng)檢測方法主要有抗酸桿菌涂片找TB、傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)，960液體培養(yǎng)、術(shù)后病變組織病理檢查等。臨床結(jié)核病診斷均以傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果作為該疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷結(jié)果準(zhǔn)確率高，但是結(jié)核羅氏培養(yǎng)時間比較長，獲得陽性檢測結(jié)果最短需要2周時間，最長需要5周以上，而如果是陰性結(jié)果，則需要2月以上時間，耗時太長，延誤疾病治療，導(dǎo)致疾病進(jìn)一步加重，導(dǎo)致患者難以接受[10]。臨床常用的抗酸桿菌涂片檢測率低，較難檢測出陽性結(jié)果，只有標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌菌量濃度＞1000個/mL，才有可能出現(xiàn)TB陽性。目前臨床傳統(tǒng)羅氏固體培養(yǎng)法較單純抗酸涂片檢測有明顯優(yōu)勢，標(biāo)本中如果含有10~100個活菌，就能培養(yǎng)出TB陽性結(jié)果，也能行菌種鑒定及藥敏試驗，鑒別排除NTM，但唯一的缺點是耗時比較長，常需要6~8周時間[11]。附睪結(jié)核病屬于肺外結(jié)核，病灶處含氧量低，并不適合結(jié)核分枝桿菌生長，故含菌量較少，臨床常規(guī)檢測方法無法檢測，而固體培養(yǎng)、960液體培養(yǎng)法也不能有效的快速做出診斷，導(dǎo)致附睪結(jié)核患者不能明確診斷，得不到及時藥物治療，促使病變進(jìn)一步發(fā)展惡化。

Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)是一種基于realtime PCR的技術(shù)，臨床能快速檢測結(jié)核分枝桿菌，并且能檢測利福平耐藥基因突變，常規(guī)用于臨床肺結(jié)核的診斷和利福平耐藥的診斷[12-13]。Xpert MTB/RIF檢測主要是以半巢式熒光定量PCR為工作基礎(chǔ)，通過自動化儀器在全封閉檢測平臺完成檢測標(biāo)本純化、標(biāo)本細(xì)菌核酸的擴增、提取純化及濃縮等檢測流程。整個試驗流程都是在封閉的標(biāo)本盒中完成。Xpert MTB/RIF技術(shù)針對結(jié)核桿菌rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間設(shè)計引物、探針，檢測結(jié)核桿菌是否發(fā)生針對利福平突變，進(jìn)一步明確是否為結(jié)核分枝桿菌以及是否對利福平耐藥做出臨床診斷，協(xié)助臨床制定有效的治療方案，而最終檢測時間僅需要2 h就可以獲得診斷結(jié)果[14]，為臨床醫(yī)生提供穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。既往傳統(tǒng)的檢測方式耗時較長，準(zhǔn)確率低，Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)能夠有效的彌補此方面檢測的缺陷。臨床上因為醫(yī)生制定治療方案的不規(guī)范，患者用藥的不規(guī)律性，菌種鑒定的不完善，導(dǎo)致繼發(fā)性耐藥結(jié)核的發(fā)病率不斷升高，因此在早期獲得結(jié)核分枝桿菌的藥敏試驗結(jié)果及菌種鑒定結(jié)果，有助于臨床醫(yī)生制定合理的抗結(jié)核治療方案，縮短治療療程。故在附睪結(jié)核疾病早期，如果有一種簡易而快速的檢測方法能夠提高其診斷陽性率，則能有效提高患者的治愈率，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，縮短治療療程，避免手術(shù)切除治療，改善附睪結(jié)核患者生活質(zhì)量。

此次觀察中Xpert MTB/RIF技術(shù)用于MTB利福平耐藥性檢測中其符合率、靈敏度、特異度均達(dá)到95%以上，且與培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明Xpert MTB/RIF技術(shù)在MTB耐藥性檢測中與傳統(tǒng)培養(yǎng)法效能基本一致，黃建斌等人[15]的研究結(jié)果顯示，Gene Xpert Mtb/RIF檢測耐藥度為100.00%與傳統(tǒng)羅氏藥敏結(jié)果一致，且特異度為96.55%與傳統(tǒng)藥敏結(jié)果100.00%差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本次研究結(jié)果、結(jié)論與該研究基本一致，可進(jìn)一步證實Xpert MTB/RIF技術(shù)在附睪結(jié)核患者診斷及利福平耐藥性分析中的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，證實了Xpert MTB/RIF技術(shù)在疑似附睪結(jié)核快速診斷中的臨床價值，也為附睪結(jié)核患者尋找一種敏感、快速且特異性高的新技術(shù)，降低本病的漏診或誤診率，在早期診斷、鑒別診斷及治療提供準(zhǔn)確可靠的依據(jù)，避免因膿腫切除附睪等風(fēng)險，其診斷效能及MTB利福平耐藥性分析的靈敏度、特異度與培養(yǎng)法一致，可積極在臨床推廣。