宮曉紅，馬天舒，朱鴻

（1.大連市中醫(yī)院檢驗科，遼寧 大連 116001；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧 大連 116011）

結(jié)直腸癌是臨床常見的胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第4位和第2位[1]。大部分的結(jié)直腸癌在確診時已處于中晚期，錯過了最佳的治療時期。目前對中晚期的結(jié)直腸癌患者主要采取化療控制疾病的發(fā)展，延長生存期[2]。進(jìn)行結(jié)直腸癌篩查的檢測手段主要是糞便潛血和腸鏡。糞便潛血試驗雖然簡便、無創(chuàng)、經(jīng)濟(jì)，但干擾因素較多，假陽性率高[3]。結(jié)直腸鏡是診斷結(jié)直腸癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但大部分患者的依從性較差，高危人群的篩查率＜20%[4]。糖類抗原19-9（CA199）、癌胚抗原（CEA）在結(jié)直腸癌患者中明顯升高，具有較高的靈敏度，可用于輔助診斷[5]。近年來，研究[6]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌在進(jìn)展過程中，SEPT9基因5，端CpG島常發(fā)生高度甲基化，導(dǎo)致SEPT9基因表達(dá)下降，從凋亡壞死的癌細(xì)胞釋放入血。因此，血漿中游離的DNA中mSEPT9可作為結(jié)直腸癌敏感性的腫瘤標(biāo)志物。本研究旨在探討SEPT9基因甲基化檢測聯(lián)合CA199、CEA在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年6月至2020年6月于本院肛腸科住院的200例患者的血液樣本，其中70例結(jié)直腸癌患者的血液樣本作為A組，男40例，女30例；平均年齡（63.2±8.7）歲。130例結(jié)直腸腺瘤患者的血液樣本作為B組，男85例，女45例；平均年齡（64.2±9.4）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國臨床腫瘤學(xué)會結(jié)直腸癌診療指南（2019版）》綜合診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他惡性腫瘤；接受過放化療治療；腹部手術(shù)史；妊娠期女性。同期收集本院體檢中心100名健康體檢者的外周血樣本作為C組，男57例，女43例；平均年齡（63.8±10.1）歲。3組年齡、性別等臨床資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)?；颊呒凹覍倬橥獠⒑炇鹬橥鈺?/p>

1.2 方法 所有研究對象均于空腹8 h以上于第2天早晨8:00抽取2管靜脈血標(biāo)本。一管EDTA抗凝2 ml，一管無抗凝劑3 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血漿和血清。CA199、CEA采用貝克曼DXI-800進(jìn)行檢測，參考范圍是0～35 U/ml、0～5 ng/ml。mSEPT9檢測方法：離心后的血漿吸取3.5 ml置于新的離心管，加100 ml磁珠，室溫旋轉(zhuǎn)混勻45 min。棄去上清液，吸取底部磁珠2 ml置于Eppendorf管，待磁珠吸附后，棄去上清液。洗脫后的DNA加入硫酸鹽溶液150μl，80℃孵育45 min。加入磁珠結(jié)合，洗滌磁珠，待干燥后洗脫DNA，進(jìn)入PCR檢測階段。采用儀器為ABI7500 Fast DxPCR儀，每個樣本進(jìn)行3次重復(fù)檢測。每次實(shí)驗同時進(jìn)行陰陽性對照作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果判定：3個測試結(jié)果中，2個及以上Ct值＜45，判定為陽性，反之判定為陰性。

1.3 觀察指標(biāo) 比較3組血清CA199、CEA水平，3組mSEPT9、CA199、CEA陽性率，mSEPT9、CA199、CEA在結(jié)直腸癌患者不同分期中的靈敏度，3組mSEPT9、CA199、CEA診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以“±s”表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗；計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用ROC曲線分析mSEPT9、CA199、CEA對結(jié)直腸癌的診斷價值。

2 結(jié)果

2.1 3組血清CA199、CEA水平比較 A組CA199、CEA水平均明顯高于B、C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；B組、C組CA199、CEA水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。

表1 3組血清CA199、CEA水平比較（±s）

表1 3組血清CA199、CEA水平比較（±s）

注：CA199，糖類抗原19-9；CEA，癌胚抗原

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2.2 3組mSEPT9、CA199、CEA陽性率比較 A、B、C組血漿mSEPT9陽性率分別為75.71%、11.54%、1.00%；A、B、C組血清CA199的陽性率分別為18.57%、0.00%、1.00%，CEA的 陽 性 率 分 別 為35.71%、3.08%、2.00%，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組mSEPT9、CA199、CEA陽性率比較

2.3 mSEPT9、CA199、CEA在結(jié)直腸癌患者不同分期中的靈敏度比較 根據(jù)常見腫瘤的TNM分期系統(tǒng)，對70例結(jié)直腸癌進(jìn)行分期，分為早期26例（Ⅰ期10例+Ⅱ期16例），晚期44例（Ⅲ期18例+Ⅳ期26例）。晚期患者mSEPT9、CA199、CEA的靈敏度更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；mSEPT9在晚期的診斷效能最高，可達(dá)82.88%（95%CI：0.633～0.937），見表3。

表3 mSEPT9、CA199、CEA在結(jié)直腸癌患者不同分期中的靈敏度比較

2.4 3組mSEPT9、CA199、CEA診斷效能比較 根據(jù)mSEPT9、CA199、CEA對結(jié)腸癌的ROC曲線分析顯示，mSEPT9、CA199、CEA曲線下面積均＞0.5，具有臨床診斷意義。3項聯(lián)合檢測的診斷效能均高于單獨(dú)檢測的診斷效能，見圖1和表4。

圖1 mSEPT9、CA199、CEA單項與聯(lián)合檢測ROC曲線

表4 3組mSEPT9、CA199、CEA診斷效能比較

3 討論

根據(jù)《2018全球腫瘤統(tǒng)計》顯示，結(jié)直腸癌已逐漸成為全世界第2位腫瘤死因，約占9.2%[7]。結(jié)直腸癌也是我國比較常見的消化道實(shí)體腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康[8]。結(jié)直腸癌初期癥狀不明顯，就診時大多已發(fā)展到中晚期。雖然目前診斷和治療方法均取得了很大的進(jìn)步，但5年生存率僅為15%[9]。因此，早期篩查、早期診斷對提高患者生存率及預(yù)后極為重要。

SEPT9基因是septin基因家族的成員之一，是一種調(diào)節(jié)基因，主要參與細(xì)胞的分裂、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控。人體在各種致癌因子的作用下，SEPT9的基因結(jié)構(gòu)可改變，SEPT9蛋白表達(dá)受到干擾，導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定，影響SEPT9聚合物形成，細(xì)胞向腫瘤特征轉(zhuǎn)化[10]。mSEPT9在結(jié)直腸癌組織中可見，在正常組織中很少見。SEPT9基因甲基化檢測是近年來出現(xiàn)的比較新的檢測技術(shù)，是首個被美國FDA批準(zhǔn)的結(jié)直腸癌血液基因甲基化標(biāo)志物?？蒂坏萚11-12]報道顯示，mSEPT9是一種簡單無創(chuàng)的篩查技術(shù)，在診斷結(jié)直腸癌上具有較高的靈敏度和特異度。CA199、CEA是診斷結(jié)直腸癌常規(guī)檢測項目。CA199屬于糖類蛋白腫瘤標(biāo)志物，是腫瘤細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷酯，常用于消化道腫瘤的輔助診斷指標(biāo)[13]。CEA是一種酸性糖蛋白，是廣譜的腫瘤標(biāo)志物，內(nèi)胚層來源的腫瘤均可見CEA明顯異常。CEA常用于診斷結(jié)直腸癌和判斷腫瘤復(fù)發(fā)，而且升高的水平與腫瘤的分期呈正相關(guān)[14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者mSEPT9、CA199、CEA陽性率均明顯高于其他兩組，晚期結(jié)直腸患者mSEPT9的診斷效能最高，靈敏度可達(dá)82.88%（95%CI：0.633～0.937）。3項聯(lián)合檢測可進(jìn)一步提高診斷結(jié)直腸癌的靈敏度（89.88%）和特異度（90.23%）。

綜上所述，對于結(jié)直腸癌患者而言，晚期患者mSEPT9、CA199、CEA的靈敏度更高，mSEPT9診斷效能最高；mSEPT9聯(lián)合CA199、CEA檢測有助于提高靈敏度和特異度，對結(jié)直腸癌的早期診斷具有重要意義。但由于本研究樣本量較小，隨訪時間較短，可能存在一定的結(jié)果偏倚，有待以后加大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。