【作 者】付鑫焱，王巍，高海燕

1 杭州智微信息科技有限公司，杭州市，311203

2 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱市，150086

0 引言

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗以骨髓涂片為標(biāo)本，借助光學(xué)顯微鏡進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查，該方法是日常血液學(xué)檢查的基本方法，也是血液病診斷和療效評估的基礎(chǔ)。數(shù)字病理技術(shù)可以方便地將醫(yī)學(xué)圖像顯示在電子屏幕上，使用專用的圖像分析軟件可以便捷地進行圖像處理和分析操作，為細(xì)胞學(xué)檢驗帶來了優(yōu)異的成像質(zhì)量、實時顯示和處理圖像能力、方便快捷的圖像存貯以及隨時隨地檢索信息記錄，使得檢驗醫(yī)師能夠利用數(shù)字圖像進行便捷的檢驗和診斷，不再完全依賴于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡。

在骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗中，從光學(xué)顯微鏡檢查逐漸轉(zhuǎn)向利用電子屏幕查看骨髓涂片的細(xì)胞數(shù)字圖像，從人工判讀細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)向智能識別細(xì)胞形態(tài)和自動報告，臨床檢驗實踐正朝向數(shù)字化的工作流程轉(zhuǎn)變。數(shù)字病理技術(shù)在當(dāng)今骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗中發(fā)揮著越來越重要的作用。

下面概述數(shù)字病理技術(shù)的基本原理、細(xì)胞學(xué)數(shù)字病理設(shè)備的現(xiàn)狀、數(shù)字病理技術(shù)在臨床骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗中的應(yīng)用以及存在的問題和展望。

1 數(shù)字病理技術(shù)的基本原理

1.1 數(shù)字成像

數(shù)字成像技術(shù)分為數(shù)字圖像獲取和輸出兩大類[1]，主要采用數(shù)字圖像傳感器（CCD或CMOS數(shù)碼相機）將圖像信息以數(shù)字化形式記錄下來進行圖像獲取，成像原理主要有光學(xué)顯微成像、共聚焦顯微成像、超分辨顯微成像三種[2]。自動對焦決定著顯微成像的精確性和實時性，是數(shù)字成像中的關(guān)鍵技術(shù)。對焦原理主要有基于數(shù)字圖像處理的對焦深度法和基于光學(xué)離焦誤差檢測的離焦深度法[3]。對焦深度法通過改變鏡頭位置獲取一系列模糊程度不同的圖像，并計算每幅圖像的清晰度評價函數(shù)值形成對焦評價曲線，最終移動鏡頭到對焦評價曲線的最值處，即最佳對焦位置。離焦深度法通過使用拍攝圖像的參數(shù)建立離焦模型，然后對圖像的局部區(qū)域進行處理和分析，從而確定圖像的模糊程度和深度信息[4]。此外對焦窗口（圖像分析區(qū)域）的選擇決定著數(shù)字成像的效率。圖像分析耗費的時間與參與計算的圖像像素數(shù)量成正比，為了減少像素運算數(shù)量從而達到最佳成像和實時成像的雙重要求，通常直接選取圖像中央或圖像四周四個具有代表性的像素區(qū)域，即對焦窗口中央選擇法和多區(qū)域選擇法[4]。針對臨床上存在圖像分析區(qū)域面積過大的問題，近年來發(fā)展出全玻片成像技術(shù)，該技術(shù)利用圖像拼接（面陣相機）和全景掃描（線陣相機）以及無透鏡顯微系統(tǒng)等技術(shù)來擴大圖像分析區(qū)域，例如徠卡、蔡司光學(xué)和飛利浦的玻片成像系統(tǒng)。醫(yī)學(xué)數(shù)字成像原理，如圖1所示。其中玻片通過鏡頭在圖像傳感器上成像，自動對焦系統(tǒng)通過數(shù)據(jù)處理得到最佳對焦圖像，經(jīng)過圖像拼接或全景掃描從而組成全玻片的數(shù)字圖像。

圖1 醫(yī)學(xué)數(shù)字成像原理Fig.1 Principle of medical digital imaging

1.2 數(shù)字圖像分析

數(shù)字圖像分析主要利用圖像分析工具對圖像進行亮度、反差、顏色等級調(diào)整，校正偏色和飽和度等，去除雜色、斑點等，并從數(shù)字化的病理圖像中提取基于圖像分析區(qū)域、細(xì)胞以及其他組織相關(guān)的測量參數(shù)[5]。典型的醫(yī)學(xué)細(xì)胞數(shù)字圖像分析主要包含細(xì)胞圖像切割、顏色標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞分類識別、計算機軟件輔助分析、結(jié)果輸出，如圖2所示。其中數(shù)字圖像經(jīng)過軟件智能化細(xì)胞分割以后，由算法根據(jù)細(xì)胞特征進行自動分類和識別，然后將細(xì)胞圖像分析結(jié)果以報告形式輸出。

圖2 醫(yī)學(xué)數(shù)字圖像分析原理Fig.2 Principle of medical digital image analysis

2 細(xì)胞數(shù)字病理檢驗設(shè)備的現(xiàn)狀

隨著數(shù)字病理技術(shù)的進步，細(xì)胞數(shù)字病理設(shè)備已經(jīng)可以將血涂片和骨髓涂片高效地轉(zhuǎn)化成數(shù)字圖像，并包含細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查所需的信息。

2.1 血細(xì)胞數(shù)字病理檢驗設(shè)備

在血涂片圖像分析設(shè)備方面，自1982年白細(xì)胞分類分析儀（Automatic blood cell differential analyzer 8200，HITACHI,Tokyo,Japan）進行臨床應(yīng)用以來[5]，全自動血細(xì)胞圖像分析儀逐漸發(fā)展成熟（CellaVision DiffMaster Octavia，1994；CellaVison DM96，2005；Sysmex DI 60，2019；Roche cobas m 511，2018）[6]?；诩?xì)胞圖像分析技術(shù)的DM96系統(tǒng)整合了自動顯微鏡（×10、×50、×100 Oil）、步進馬達和光控單元、CCD彩色照相機以及細(xì)胞定位和特征分析軟件，該系統(tǒng)采用自動定位細(xì)胞圖像分析技術(shù)模擬傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡鏡檢過程對血涂片數(shù)字圖像中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板進行預(yù)分類和計數(shù)。隨后升級為DM9600系統(tǒng)，以及與血液分析流水線（Sysmex XN系列）整合在一起的全自動數(shù)字細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)DI-60[7]，使血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗在自動化、標(biāo)準(zhǔn)化、智能化方面達到先進水平。新款血球分析儀Cobas m 511（羅氏診斷）同樣利用數(shù)字化、細(xì)胞形態(tài)學(xué)和人工智能原理進行外周血細(xì)胞分析，該系統(tǒng)使用30 μL全血噴涂制備血涂片，通過圖像分析技術(shù)完成白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的計數(shù)和識別，提供相應(yīng)的血細(xì)胞數(shù)字圖像，整合白細(xì)胞分類、紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析、紅細(xì)胞參數(shù)計算等結(jié)果并出具外周血檢測報告[8]。在國內(nèi)，Celldiff BCM-2自動血細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)（北京賽爾蒂扶，2015）和LD BC-Ⅰ型全自動血細(xì)胞圖像分析儀（武漢蘭丁，2018）實現(xiàn)了白細(xì)胞預(yù)分類的自動化與標(biāo)準(zhǔn)化[9-10]。

2.2 骨髓細(xì)胞數(shù)字病理設(shè)備

在骨髓涂片圖像分析設(shè)備方面，盡管近年來研究人員在骨髓細(xì)胞分割和識別算法方面取得很大進步[11-13]，使用大量臨床骨髓細(xì)胞樣本和基于稀疏表示和數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)操作的新型細(xì)胞分割和識別算法對常見14種骨髓細(xì)胞的平均識別率達到82.46%[14]，該研究對骨髓細(xì)胞圖像分析的發(fā)展進程具有重要意義，然而這些研究使用的骨髓細(xì)胞圖像主要通過組織病理玻片成像系統(tǒng)（例如蔡司光學(xué)Axio Imager Z2、徠卡Aperio AT2 scanner高通量快速掃描儀）或顯微鏡系統(tǒng)獲取，通常無法滿足臨床骨髓涂片檢查中使用×100 Oil物鏡進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析的需求。臨床上使用的圖文系統(tǒng)僅用于輔助醫(yī)務(wù)人員出具骨髓涂片檢查報告單，例如BEION V4.90骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)圖文系統(tǒng)（北昂醫(yī)療），而不能用于骨髓細(xì)胞圖像分析[15]。

骨髓涂片數(shù)字病理設(shè)備研發(fā)方面進展緩慢，主要是由于骨髓涂片厚度不均，自動對焦比較困難，尤其使用×100 Oil物鏡對焦具有挑戰(zhàn)性。Morphogo骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析儀（杭州智微）使用Z-stack對焦技術(shù)和自動拼圖功能，首次實現(xiàn)了對骨髓涂片的×40物鏡全玻片掃描（20 mm×40 mm，（0.17 ± 0.02）μm/pixel）和×100 Oil物鏡細(xì)胞圖像掃描（0.018 ± 0.005）μm/pixel，可以管理、展示、修改和自動識別細(xì)胞圖像，并出具檢驗報告，形成數(shù)字圖像分析流程[16]。Slide Scan System SQS1000玻片掃描影像分析系統(tǒng)（深圳市生強科技）使用壓電納米位移控制對焦技術(shù)、區(qū)域掃描模式與單點掃描模式相結(jié)合，實現(xiàn)了血片和骨髓片×10和×100 Oil圖像掃描（0.7 μm/pixel，0.057 μm/pixel）[17]。Full Field PBS/BMA系統(tǒng)（Scopio公司）使用計算成像中的超分辨率（SR）圖像重建技術(shù)將低分辨率圖像合成為高分辨率圖像，以獲得×100等效放大率的血片或骨髓片圖像[18]。MP800 Fully Automatic Microscope 數(shù)字病理系統(tǒng)利用快速對焦（163～300 fps）和全玻片平掃（20 mm ×50 mm，全片8個對焦點，區(qū)域內(nèi)無需重新對焦）技術(shù)，實現(xiàn)了血片和骨髓片的圖像數(shù)字化并生成全玻片圖像（×40,0.25 μm/pixel,≤1 min;×60 Oil,0.17 μm/pixel,≤2 min;×100 Oil,0.1 μm/pixel,≤3 min）[19]。其次是骨髓細(xì)胞種類繁多，識別困難，以及骨髓涂片分析區(qū)域的不確定性。Morphogo細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析儀（杭州智微）可自動分類識別40類常見骨髓細(xì)胞，對常見骨髓細(xì)胞的識別率高達86%，可以輔助醫(yī)生提高檢驗效率和準(zhǔn)確度[20-21]。AetherAI Hema（臺灣云象科技）實現(xiàn)了11類骨髓細(xì)胞的識別[22]。Vision Bone Marrow（奧地利West Medica）實現(xiàn)了骨髓涂片自動分析和自動批量上片（4張/8張/200張）并可接入醫(yī)院LIS信息系統(tǒng)[23]。以上這些細(xì)胞數(shù)字病理設(shè)備正在研發(fā)或進行臨床試驗過程中，尚未獲得注冊證進入臨床應(yīng)用。

3 數(shù)字病理技術(shù)在骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗中的應(yīng)用

在臨床檢驗工作中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗一般由檢驗醫(yī)師在顯微鏡下進行操作。先用肉眼觀察涂片整體涂片和染色情況，接著使用低倍鏡觀察全片情況、有無異常細(xì)胞、選定代表性鏡檢區(qū)域等，然后使用高倍鏡或油鏡在涂片合適區(qū)域內(nèi)觀察細(xì)胞形態(tài)，進行細(xì)胞分類和計數(shù)，并確認(rèn)異常細(xì)胞，最后形成細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗報告。

在血涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗方面，血細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析儀主要配合血球儀的全血細(xì)胞計數(shù)和復(fù)檢規(guī)則使用，對血細(xì)胞計數(shù)異常、觸發(fā)復(fù)檢規(guī)則或疑似為血液疾病的樣本進行自動涂片,并對血涂片數(shù)字圖像中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板進行預(yù)分類和計數(shù)[24]，具有代表性的分析儀有CellaVison DM9600和Sysmex DI 60[6]，以及Celldiff BCM-2自動血細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)[9]。

在骨髓涂片細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗方面，首先使用骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析儀的高倍物鏡（×40）或油鏡（×100）將骨髓涂片數(shù)字化生成全玻片數(shù)字圖像，接著在具有代表性的合適區(qū)域內(nèi)選取有核細(xì)胞進行細(xì)胞圖像分析（×100 Oil）和自動分類計數(shù)，然后由檢驗醫(yī)師對分析結(jié)果進行審核并出具骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗報告，骨髓細(xì)胞數(shù)字病理分析流程見圖3[16]。目前骨髓涂片圖像分析儀正在研發(fā)或臨床試驗過程中，基本實現(xiàn)了骨髓涂片的全玻片數(shù)字化，并具有初步的細(xì)胞識別能力。具有代表性的Morphogo骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析儀（杭州智微）使用高倍鏡（×40）的掃描速度為50 mm2/min，使用油鏡（×100）的細(xì)胞圖像拍攝速度為20 張/min（4 000 × 3 000 Pixels）[16]。在使用30 867張細(xì)胞圖像（145張骨髓涂片）進行的細(xì)胞識別驗證試驗中，該設(shè)備對常見骨髓有核細(xì)胞的識別率達到90.1%（95%CI，89.8%～90.5%）；在使用124張骨髓涂片進行的與人工鏡檢比較的測試中，使用該設(shè)備對骨髓涂片進行圖像分析與人工鏡檢兩種分析方法之間可靠性系數(shù)（ICC）較高（ICC≥0.883），且兩種分析方法對骨髓涂片中粒系和紅系的細(xì)胞比例分析結(jié)果一致[16]。

圖3 骨髓細(xì)胞數(shù)字病理分析流程（修改自JIN,et al[16]）Fig.3 Digital pathology analysis process of bone marrow smears(modified from JIN,et al [16])

將骨髓涂片掃描轉(zhuǎn)化成數(shù)字全玻片圖像，從數(shù)字圖像的合適區(qū)域內(nèi)采集骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗所需的骨髓細(xì)胞信息，進行自動細(xì)胞分類和計數(shù)，從而減輕了骨髓涂片顯微鏡檢過程中的機械勞動，提高了檢驗醫(yī)師的工作效率和價值。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的數(shù)字病理分析流程將會改變臨床檢驗實驗室中骨髓涂片的傳統(tǒng)顯微鏡檢流程。

4 細(xì)胞學(xué)數(shù)字病理技術(shù)的存在的問題

在臨床檢驗實踐中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗一直存在細(xì)胞涂片效果有差異、染色偏酸或偏堿、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分類和評價標(biāo)準(zhǔn)主觀性強、檢驗醫(yī)師的閱片經(jīng)驗水平不統(tǒng)一等問題。細(xì)胞學(xué)數(shù)字病理技術(shù)有望解決細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗中的主觀性問題，細(xì)胞自動分類有望提高細(xì)胞識別的客觀性和準(zhǔn)確性，細(xì)胞自動計數(shù)有望提高細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的工作效率；同時數(shù)字全玻片圖像可以觀察到更多細(xì)胞，輔助檢驗醫(yī)師進行細(xì)胞分類，緩解用眼疲勞；生成的數(shù)字圖像易于保存、傳輸和復(fù)查，還可用于遠(yuǎn)程會診、輔助教學(xué)等。

進行細(xì)胞學(xué)數(shù)字病理圖像分析時，自動選區(qū)一直是圖像分析的難點之一。細(xì)胞圖像分析儀通常只能提供選定分析區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)信息，不能提供全片范圍內(nèi)的細(xì)胞形態(tài)細(xì)節(jié)信息，這通常會增加檢驗醫(yī)師進行細(xì)胞分類和臨床檢驗的難度。在現(xiàn)實臨床檢驗過程中，檢驗醫(yī)師不僅可以使用整個細(xì)胞涂片信息，還可以使用其他臨床信息，包括病史、化學(xué)染色、流式檢測、分子細(xì)胞遺傳學(xué)分析等檢測結(jié)果。一種解決方式是對感興趣的涂片區(qū)域和細(xì)胞進行重新補充拍攝，另一種解決方式是對涂片全片進行油鏡（×100）拍攝。其次是細(xì)胞數(shù)字病理設(shè)備生成的數(shù)字圖像過大，不僅耗費存儲資源，而且存在圖像傳輸緩慢和數(shù)據(jù)安全風(fēng)險問題，5G技術(shù)的普及將會緩解這一問題。此外，盡管細(xì)胞數(shù)字病理設(shè)備對常見骨髓細(xì)胞的識別率已經(jīng)達到較高水平，然而對血液病診斷具有重要意義的原始細(xì)胞識別率仍需繼續(xù)提高[16,21]。最后，細(xì)胞數(shù)字病理設(shè)備尚未整合形成血液病診斷的數(shù)字化工作流程。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗為臨床血液病診斷提供依據(jù)，然而當(dāng)前血液病診斷不能僅憑細(xì)胞形態(tài)學(xué)做出診斷，必須以臨床資料和細(xì)胞形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，整合免疫表型分析、細(xì)胞遺傳學(xué)分析和分子遺傳學(xué)分析等結(jié)果，從而形成血液病的綜合診斷。隨著醫(yī)療信息數(shù)字化程度不斷加深，以及深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以接受多種數(shù)據(jù)類型的輸入[25]，形成血液病綜合診斷的數(shù)字化工作流程將成為可能。

5 總結(jié)與展望

近年來，數(shù)字病理技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域取得了長足的進步，在血涂片和骨髓涂片自動化分析方面出現(xiàn)了眾多優(yōu)秀的細(xì)胞學(xué)數(shù)字病理設(shè)備。這些設(shè)備借助先進的數(shù)字成像和圖像分析技術(shù)將骨髓涂片和血涂片樣本掃描并生成數(shù)字全玻片圖像，自動進行細(xì)胞圖像的分割和識別，自動生成檢驗報告，從而形成骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗的全新數(shù)字病理工作流程。檢驗醫(yī)學(xué)已進入數(shù)字化時代，數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化、自動化和智能化是細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗發(fā)展的必然趨勢；在未來檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展和構(gòu)建中，數(shù)字病理技術(shù)也必將發(fā)揮更加重要的作用。