【作 者】吳昊，彭飛，王進(jìn)

成都迪康中科生物醫(yī)學(xué)材料有限公司，成都市，610000

0 引言

止血材料行業(yè)屬于醫(yī)療器械的細(xì)分行業(yè)。近年來(lái)隨著手術(shù)范圍的不斷擴(kuò)大，其應(yīng)用范圍也日益廣泛。據(jù)全國(guó)醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)信息網(wǎng)的數(shù)據(jù)顯示：我國(guó)每年臨床治療的手術(shù)病人超過(guò) 400萬(wàn)人次，主要集中在外科手術(shù)科室以及部分內(nèi)科手術(shù)科室。隨著我國(guó)外科手術(shù)水平和外科手術(shù)治療覆蓋率的提高，以及器官移植術(shù)的供不應(yīng)求，止血類(lèi)材料在臨床已必不可少。

外科手術(shù)中，無(wú)一例外涉及出血與止血[1]。手術(shù)操作或創(chuàng)傷，特別是大的創(chuàng)面出血、滲血，有時(shí)很難控制，不但會(huì)導(dǎo)致失血量增大，而且還會(huì)增加手術(shù)難度，甚至危及生命，而良好的止血類(lèi)材料是手術(shù)安全進(jìn)行的前提和保障。因此，止血材料具有巨大的發(fā)展空間。

隨著醫(yī)學(xué)、生物工程學(xué)及材料學(xué)的發(fā)展，各種新型止血材料不斷問(wèn)世[2-4]。材料逐漸由不可吸收向可吸收方向轉(zhuǎn)化，由動(dòng)物源向植物源方向轉(zhuǎn)化，由蛋白類(lèi)逐漸向糖類(lèi)的轉(zhuǎn)化。可吸收止血材料產(chǎn)品種類(lèi)繁多，目前上市產(chǎn)品主要有微纖維膠原[5]、醫(yī)用止血明膠[6]、氰基丙烯酸類(lèi)組織膠[7]、蛋白類(lèi)止血材料[8]及多糖類(lèi)止血材料[9]等，其在臨床及日常生活中的應(yīng)用極為廣泛。比如美國(guó)Z-Medica公司生產(chǎn)的多孔沸石止血材料QuikClot[10]，但是該止血材料無(wú)法被人體降解，并且使用時(shí)在傷口處易發(fā)熱對(duì)創(chuàng)口造成灼傷，極大地限制了其應(yīng)用。纖維蛋白膠、醫(yī)用止血明膠、微纖維膠原以及膠原纖維網(wǎng)等作為止血材料使用時(shí)也有較大的缺點(diǎn)，這些材料具有動(dòng)物源性，可誘發(fā)患者發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，存在較高的潛在使用風(fēng)險(xiǎn)。氰基丙烯酸類(lèi)組織膠類(lèi)止血材料在降解過(guò)程中釋放出氰和甲醛等有毒物質(zhì)，會(huì)引起炎癥反應(yīng)或傷口愈合延遲，存在較大的安全隱患[11]。而多糖類(lèi)可吸收止血材料是自然界中大量存在的天然高分子材料具有來(lái)源豐富、價(jià)格低廉、生物相容性良好、在人體內(nèi)易被降解吸收、不良反應(yīng)少等諸多優(yōu)勢(shì)，因此成為當(dāng)前止血材料的研究熱點(diǎn)[12-14]。美國(guó)HemCon公司就基于殼聚糖研發(fā)出了一種止血繃帶，止血效果良好，且無(wú)毒副作用。

我們旨在制備出一種具有優(yōu)秀止血性能且安全有效的新型止血材料，本研究具備止血迅速、吸水率高、促進(jìn)傷口愈合、可完全吸收降解及良好的生物相容性等特點(diǎn)。本研究使用鹽酸對(duì)馬鈴薯淀粉進(jìn)行酸解增加其表面積，交聯(lián)成微球后極大地提升了吸水效率，并且通過(guò)表面改性羧甲基化進(jìn)一步提升吸水率[15-17]。該研究中制備的止血微球粒徑均一呈球形，體外α-淀粉酶環(huán)境下表現(xiàn)出優(yōu)秀的降解速率，并且使用大鼠和家兔對(duì)體內(nèi)安全性和止血有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，本研究描述的止血材料，有望為臨床與生活止血材料的研究開(kāi)辟新的方向。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

馬鈴薯淀粉、鹽酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉和氯乙酸購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，乙醇、大豆油、環(huán)氧氯丙烷和Span80購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司，所有試劑均為AR級(jí)，純化水為自制。

使用儀器以及SD大鼠和新西蘭兔均為成都里來(lái)生物醫(yī)學(xué)中心提供。使用掃描儀包括：掃描電子顯微鏡（SU3500型）、核磁共振譜儀（AVANCE III 500 MHz）、傅里葉紅外光譜儀、鼓風(fēng)干燥箱、恒溫水浴鍋、機(jī)械攪拌器、光學(xué)顯微鏡MCL-1600、紫外分光光度計(jì)、勻漿儀、布氏漏斗。

1.2 止血材料制備

1.2.1 酸解

將馬鈴薯淀粉原料通過(guò)乙醇清洗3次，鼓風(fēng)干燥箱70oC烘干24 h。配制300 mL濃度6%的鹽酸水溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取清洗烘干后的馬鈴薯淀粉100 g加入至上述鹽酸水溶液中45oC攪拌2 h，2 h后使用布氏漏斗抽濾產(chǎn)物，純化水和乙醇各清洗3次，鼓風(fēng)干燥箱60oC烘干24 h。

1.2.2 交聯(lián)

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g酸解馬鈴薯淀粉和0.2 g氫氧化鈉，加入至40 mL純化水中，稱(chēng)取0.2 g硼氫化鈉，加入到上述淀粉溶液中攪拌30 min，30 min后加入3 g Span80和80 mL大豆油繼續(xù)攪拌30 min，30 min后向乳液中加入6 mL環(huán)氧氯丙烷，加入后在50oC條件下攪拌4 h。反應(yīng)完成后加入1 000 mL純化水破乳，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中過(guò)夜分層，取下層水相，抽濾后使用乙醇回收干粉顆粒，鼓風(fēng)干燥箱70oC烘干24 h，得到白色粉末狀產(chǎn)物。

1.2.3 醚化

準(zhǔn)確稱(chēng)量20 mL純化水和180 mL無(wú)水乙醇混合均勻，稱(chēng)取5 g氫氧化鈉溶于上述溶液中。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g上一步交聯(lián)后的馬鈴薯淀粉，倒入上述溶液中在50℃條件下攪拌1 h，1 h后準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g氯乙酸倒入上述淀粉溶液，并繼續(xù)在50oC條件下攪拌4 h，4 h后將使用布氏漏斗抽濾，并使用乙醇反復(fù)抽洗至pH值到6.0～8.0，80oC烘干得白色粉末產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 止血粉形貌表征

配置顯色碘溶液（含0.33%碘和0.66%碘化鉀）10 mL，取止血粉100 mg，并加入5 mol/L顯色碘溶液，使其充分吸水染色，并在MCL-1600型光學(xué)顯微鏡（40×）下觀察。通過(guò)顯微鏡配套軟件保存成像圖片。止血粉使用碘顯溶液顯色后在光學(xué)顯微鏡下的表征，如圖1所示，從圖中可以看出，止血粉吸水后呈球形，并且分布均勻，粒徑較為均一。

圖1 止血淀粉光學(xué)顯微鏡形貌圖Fig.1 Optical microscope of hemostatic starch

使用掃描電子顯微鏡（SU3500型）觀察干燥止血粉的微觀形貌，如圖2所示。從圖中可以看出，止血粉表面不光滑，這是由于在制備過(guò)程中使用了酸解和醚化工藝，使得止血粉表面輕微酸解并接枝了羧甲基官能團(tuán)，讓止血粉表面比表面積增多，并使得止血粉具有更高的吸水倍率。

圖2 止血粉SEM成像圖Fig.2 SEM of hemostatic powder

2.2 止血粉結(jié)構(gòu)表征

止血粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)使用紅外光譜和核磁共振氫譜來(lái)表征。在紅外表征中，分別稱(chēng)取1 g干燥止血粉，在傅里葉紅外光譜儀（FTIR）下記錄紅外光譜。止血粉紅外光譜譜圖如圖3所示，從圖中可以看出，止血粉紅外光譜在1 020 cm-1的P-O-C伸縮振動(dòng)峰較強(qiáng)，證明止血粉是交聯(lián)過(guò)的淀粉，同時(shí)1 603 cm-1和1 414 cm-1的振動(dòng)峰證明止血粉為經(jīng)過(guò)羧甲基改性后的淀粉。

圖3 止血粉紅外光譜譜圖Fig.3 Spectrum of hemostatic Pink

在固體核磁表征中，分別稱(chēng)取2 g干燥止血粉、馬鈴薯淀粉和羧甲基淀粉鈉，在核磁共振譜儀（AVANCE III 500 MHz）下測(cè)定止血粉的核磁共振氫譜（1H NMR）。

止血粉核磁譜圖，如圖4（a）所示，同時(shí)，使用馬鈴薯淀粉和羧甲基淀粉鈉的核磁譜圖如圖4（b）、圖4（c）所示，進(jìn)行對(duì)比分析。通過(guò)對(duì)比止血粉、馬鈴薯淀粉、羧甲基淀粉鈉核磁譜圖可知，止血粉和羧甲基淀粉鈉出峰區(qū)域都大致一樣，可分為55～67 ppm、67～80 ppm、80～90 ppm、90～110 ppm、170～190 ppm五個(gè)區(qū)域，而除了170～190 ppm的出峰區(qū)域與普通馬鈴薯淀粉不一樣外，其他區(qū)域都是一樣的，可以推測(cè)177.08 ppm和178.75 ppm為官能團(tuán)，結(jié)合核磁共振碳譜化學(xué)位移總覽表，170～190 ppm該區(qū)域出峰都代表的正是，所以可以肯定推測(cè)是正確的，說(shuō)明止血粉中含有羧基。通過(guò)羧甲基化的反應(yīng)原理，因此羧甲基淀粉鈉的化學(xué)式可以表達(dá)為：淀粉-OCH2COONa。

圖4 三種材料的NMR 核磁譜圖Fig.4 NMR spectrum of three kinds of materials

綜上所述，止血粉在保持馬鈴薯淀粉特征峰的前提下，成功進(jìn)行了交聯(lián)改性，并通過(guò)羧甲基化成功在其表面接枝官能團(tuán)-OCH2COONa。

2.3 止血粉吸水率表征

取5 g止血粉，平均分成5份，測(cè)試吸水率，測(cè)試方法如下：將抽濾紙潤(rùn)濕后進(jìn)行抽濾得到質(zhì)量m0的潤(rùn)濕濾紙，稱(chēng)取質(zhì)量為m1的干燥止血淀粉。將止血粉倒入抽濾紙上，使用純化水將其全部潤(rùn)洗后抽濾，直到?jīng)]有水滴下落為止，這時(shí)候?qū)V紙和止血粉全部取出，稱(chēng)得其質(zhì)量為m2。

通過(guò)以下公式計(jì)算出每克止血淀粉的吸水率：

測(cè)量3次后取平均值，0.5 g≤m1≤1.5 g。

止血粉和市售產(chǎn)品Arista的吸水率，如圖5所示，5次測(cè)試止血粉吸水率均在800%以上，平均吸水率達(dá)到881.28%，市售產(chǎn)品Arista經(jīng)測(cè)試吸水率812.3%，我們研究的止血粉平均吸水率略高于市售產(chǎn)品Arista。

圖5 止血粉和市售產(chǎn)品Arista的吸水率Fig.5 Water absorption of hemostatic powder and commercial product Arista

2.4 止血粉止血效果

2.4.1 動(dòng)物試驗(yàn)方案

動(dòng)物試驗(yàn)分為A、B兩組，其中A組為實(shí)驗(yàn)組，B組為對(duì)照組，使用對(duì)應(yīng)試驗(yàn)樣品。共90只大耳兔，術(shù)后1 d、3 d、7 d和14 d為觀察點(diǎn)，各取5只大耳兔觀察止血及術(shù)后恢復(fù)情況。

動(dòng)物造模皮下出血模型：

（1）全部動(dòng)物術(shù)前均禁食（不禁水）12 h，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉；

（2）動(dòng)物麻醉后仰臥位固定，將動(dòng)物腹部剪毛并用碘爾康溶液消毒鋪巾；

（3）無(wú)菌操作下取腹正中切口，長(zhǎng)約4～5 cm。銳性刮除壁層腹膜及其下部分肌層，形成1 cm×1 cm的出血區(qū)域，對(duì)側(cè)腹壁也按此法制造同樣缺損；

（4）在損傷出血區(qū)域，實(shí)驗(yàn)組均勻噴涂止血淀粉0.3 g，對(duì)照組使用Arista產(chǎn)品0.3 g，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，直至出血停止，記錄出血時(shí)間；

（5）止血完成后，將各試驗(yàn)組大耳兔以7號(hào)絲線關(guān)閉腹腔，動(dòng)物術(shù)后監(jiān)護(hù)，禁食12 h，單籠飼養(yǎng)；

（6）各受試組分別于手術(shù)后 1 d、3 d、7 d、14 d 麻醉處死5只，剖腹探查腹腔情況后采集標(biāo)本進(jìn)行分析。

2.4.2 止血時(shí)間分析

通過(guò)新西蘭大耳兔皮下出血模型實(shí)驗(yàn)顯示，并對(duì)照組B（Arista）止血粉相比，結(jié)果見(jiàn)表1。止血粉A組能夠在更短的時(shí)間達(dá)到止血的效果，平均時(shí)間為138.7 s，比對(duì)照組B（Arista）快了15.6%的止血時(shí)間。與Arista止血粉對(duì)照組比較，我們研制的止血粉止血時(shí)間減少，有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 皮下出血模型止血時(shí)間分析Tab.1 Analysis of hemostatic time of subcutaneous hemorrhage

2.4.3 組織病理切片

止血粉在皮下止血后，觀察動(dòng)物在術(shù)后1 d～14 d天傷口部位的炎癥反應(yīng)，相關(guān)組織病理切片見(jiàn)圖6～圖9。從組織切片圖中可以看出：

圖6 1 d (×400) 皮下組織內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)Fig.6 1 d (×400) subcutaneous infiltration of neutrophils

3 d：皮下組織內(nèi)結(jié)構(gòu)被破壞，可見(jiàn)大量肌纖維變性或壞死，伴不同程度的纖維組織增生，可見(jiàn)明顯的成纖維細(xì)胞增多；其中2例（2/5）可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，1例（1/5）可見(jiàn)少量嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；其他未見(jiàn)明顯病理變化。

圖7 3 d (×400) 成纖維細(xì)胞增生Fig.7 3 d (×400) fibroblast proliferation

7 d：皮下組織內(nèi)結(jié)構(gòu)較為清晰，可見(jiàn)部分肌纖維變性或壞死，不同程度的纖維組織增生，可見(jiàn)明顯的成纖維細(xì)胞增多；其中1例（1/5）皮下組織內(nèi)中度水腫，1例（1/5）可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；其他未見(jiàn)明顯病理變化。

圖8 7 d (×400) 成纖維細(xì)胞增生Fig.8.7 d (×400) a large number of fibroblasts proliferated

圖9 14 d (×400)皮下組織恢復(fù)完好Fig.9 14 d (×400) the subcutaneous tissue recovered

14 d：皮下組織內(nèi)結(jié)構(gòu)完整清晰，未見(jiàn)明顯的肌纖維變性或壞死，其中1例（1/5）可見(jiàn)少量纖維組織增生；未見(jiàn)明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；其他亦未見(jiàn)明顯病理變化。

1 d：皮下組織內(nèi)結(jié)構(gòu)較為清晰，可見(jiàn)大量以中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分可見(jiàn)少量膿細(xì)胞，即變性壞死的中性粒細(xì)胞；其中2例（2/5）可見(jiàn)部分肌纖維變性壞死，偶見(jiàn)少量纖維組織增生，可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞；2例（2/5）皮下組織內(nèi)中度水腫；其他未見(jiàn)明顯病理變化。

組織切片結(jié)果顯示，動(dòng)物體內(nèi)組織對(duì)止血粉無(wú)明顯排異現(xiàn)象，并且在組織切片中，沒(méi)有明顯的止血粉材料殘留，證明其在組織中已完全降解。在皮下出血模型中，組織炎癥消退較快，具備良好的促進(jìn)組織修復(fù)功能。

3 總結(jié)

本研究通過(guò)使用馬鈴薯淀粉作為原料，經(jīng)過(guò)酸解、環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)和羧甲基醚化等步驟后制備出一種高吸水性的止血粉材料，通過(guò)對(duì)止血粉材料進(jìn)行物化表征，確定化學(xué)結(jié)構(gòu)和形貌。通過(guò)止血粉吸水性能的測(cè)試，結(jié)果顯示平均吸水率略高于進(jìn)口對(duì)照品。最后，通過(guò)皮下出血模型對(duì)止血粉止血效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，止血速度明顯好于對(duì)照品，組織切片結(jié)果顯示止血粉具有良好的生物相容性。本研究中的止血粉止血迅速、吸水率高、促進(jìn)傷口愈合、可完全吸收降解并具有良好的生物相容性，為今后可吸收植入止血材料的開(kāi)發(fā)提供了一條新的研究途徑。