張世微 程雁鴻 徐章 張艷

(1湖北職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2孝感市中心醫(yī)院)

腹膜透析(PD)是終末期腎病患者腎臟替代治療的選擇之一。雖然該方法與血液透析相比，有諸多優(yōu)點(diǎn)，但也有一些局限性。感染性并發(fā)癥如腹膜炎仍然是PD技術(shù)失敗的主要原因〔1～3〕，降低了患者的生活質(zhì)量〔2～5〕。探討微生物學(xué)的最新發(fā)展趨勢(shì)，選擇合適的經(jīng)驗(yàn)性治療方法對(duì)PD腹膜炎至關(guān)重要。已知表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌是PD腹膜炎最常見的病因〔6〕。黃芪多糖(APS)是中藥黃芪的主要成分之一〔7〕，已被證明具有多種生物活性，包括抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎和抗病毒活性〔8〕。因此，APS在疾病治療中得到了廣泛的研究。在抗菌方面，Dong等〔8〕發(fā)現(xiàn)APS可對(duì)感染寒沙門菌小鼠發(fā)揮抗炎作用，并可調(diào)節(jié)其腸道菌群平衡。另外，Ma等〔9〕發(fā)現(xiàn)APS與銀納米粒子合成物對(duì)臨床分離的耐多藥細(xì)菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株，如銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抗菌活性，且呈劑量依賴性。雖然已有研究探討了APS的抗菌作用，但對(duì)APS在表皮葡萄球菌感染誘發(fā)腹膜炎中的作用仍缺乏研究。

1 材料與方法

1.1大鼠的分組、建模與給藥 75只成年(10周齡)雄性Sprague Dawley大鼠(體重250～300 g)購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)2 w內(nèi)將大鼠飼養(yǎng)在室內(nèi)溫度為20～24℃，光暗循環(huán)交替(各12 h)的飼養(yǎng)籠中，喂以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物食物，可以隨意攝入食物和水。本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)，外科手術(shù)均按照指南進(jìn)行。將大鼠隨機(jī)分為5組(n=15)：空白對(duì)照組、模型組、APS低劑量組、APS中劑量組、APS高劑量組。將表皮葡萄球菌菌株(ATCC 35984)接種于300 ml常規(guī)培養(yǎng)基，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日4℃，12 000 r/min離心10 min，留取沉淀使用生理鹽水洗滌3次后，留取最終沉淀用預(yù)冷的生理鹽水重懸，配制成濃度為107c.f.u/ml的菌液，置于4℃冰箱備用?？瞻讓?duì)照組大鼠腹腔注射生理鹽水；模型組大腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107c.f.u/ml；APS低、中、高劑量組分別在造模后予以100、200和400 mg/kg APS(購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司)灌胃，空白對(duì)照組及模型組則同時(shí)予以等體積無(wú)菌蒸餾水灌胃。于造模后0 h、12 h、24 h、36 h及48 h時(shí)處死大鼠，留取血清、腹腔灌洗液及腹膜組織備用。

1.2計(jì)數(shù)腹腔灌洗液中的白細(xì)胞個(gè)數(shù) 將腹腔灌洗液在室溫1 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液。12 000 r/min離心10 min后，留取沉淀加入含0.6 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)的200 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，使用密度梯度離心法和Wright-Giemsa染色法(購(gòu)自碧云天生物科技有限公司)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。

1.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清及腹腔灌洗液中的炎癥因子水平 按照制造商說明書，使用ELISA試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)測(cè)定腹腔灌洗液及血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α的濃度。

1.4檢測(cè)腹膜組織中的髓過氧化物酶(MPO)水平〔10〕使用分光光度計(jì)測(cè)定460 nm處的吸光度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1APS調(diào)節(jié)大鼠腹腔灌洗液白細(xì)胞計(jì)數(shù) 表1所示，與空白對(duì)照組相比，模型組的白細(xì)胞總數(shù)顯著增加(均P<0.05)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，白細(xì)胞總數(shù)隨之增加(P<0.05)。此外，與模型組相比，3個(gè)不同劑量APS組白細(xì)胞總數(shù)顯著減少(均P<0.05)。且APS高劑量組的白細(xì)胞總數(shù)減少最為明顯。各組間中性粒細(xì)胞所占百分比的變化與白細(xì)胞總數(shù)變化一致(均P<0.05)，而巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞所占百分比變化則與之相反(均P<0.05)，見表2，表3，表4。

2.2APS降低腹腔灌洗液及血清炎癥因子水平 與空白對(duì)照組相比，模型組腹腔灌洗液和血清TNF-α水平均呈時(shí)間依賴性升高(均P<0.05)。而與模型組相比，給予APS治療可顯著抑制此變化(均P<0.05)，且APS高劑量組的效果最為明顯。見表5，表6。

2.3APS降低腹膜組織中MPO活性 模型組腹膜組織中MPO活性呈時(shí)間依賴性升高(P<0.05)，給予APS治療可顯著抑制該變化(均P<0.05)，且APS高劑量組的效果最為明顯。見表7。

3 討 論

PD是治療終末期腎病的主要手段之一，長(zhǎng)時(shí)間的PD會(huì)誘發(fā)一系列并發(fā)癥，例如PD相關(guān)性腹膜炎〔11〕。表皮葡萄球菌作為引起腹膜炎的致病菌之一，具有極強(qiáng)耐藥性，并可通過促進(jìn)促炎因子的釋放引發(fā)炎癥反應(yīng)〔12〕。

研究表明，傳統(tǒng)中草藥已成為臨床治療各種疾病的有效替代方法〔13〕。黃芪中提取的APS是一種水溶性大分子化合物，具有多種生物學(xué)活性〔14〕。在抗菌方面，有研究發(fā)現(xiàn)APS可抑制由寒沙門菌引起的炎癥反應(yīng)〔8〕。然而目前尚無(wú)研究探討APS在表皮葡萄球菌致腹膜炎中的作用。

已知白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞所占比提示機(jī)體炎癥狀態(tài)〔15〕。我們發(fā)現(xiàn)腹膜炎狀態(tài)下，大鼠腹腔灌洗液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞占比顯著升高，而APS治療可顯著逆轉(zhuǎn)上述變化。已知MPO是髓樣分化過程中合成的一種血紅素蛋白，作為中性粒細(xì)胞中的特殊成分，MPO的活性與炎癥的嚴(yán)重程度呈正比〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)給予APS治療可顯著逆轉(zhuǎn)由表皮葡萄球菌引起的MPO活性升高，提示APS治療可抑制中性粒細(xì)胞的功能。另外，已知TNF-α是一種經(jīng)典促炎因子〔17～19〕，本研究分別對(duì)大鼠腹膜灌洗液及血清中的TNF-α進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表皮葡萄球菌可誘導(dǎo)TNF-α水平增加，而APS治療可抑制其變化，且高劑量組作用最為明顯。

綜上所述，表皮葡萄球菌誘導(dǎo)的腹膜炎中，APS治療可通過減少白細(xì)胞總數(shù)，降低炎癥因子TNF-α的水平，抑制MPO活性，發(fā)揮抑制炎癥的保護(hù)性作用。上述結(jié)果為APS治療在表皮葡萄球菌誘導(dǎo)的腹膜炎提供了新的治療思路。