李蔚 鄔海橋 李炯 張俊娜 向茜 馮霞

(重慶市中醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，重慶 400021)

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，是癌癥相關死亡的主要原因，據統計全球每年約有180萬肺癌新增病例〔1〕。約85%的肺癌病例為非小細胞肺癌(NSCLC)，早期NSCLC患者經手術治療后其5年生存率可顯著提高，然而70%的NSCLC患者在確診時已處于晚期或發(fā)生轉移。化療盡管可延長NSCLC患者生存期，但多數患者在治療后易產生耐藥性，導致化療失敗。天然中草藥提取物具有較好的抗腫瘤活性引起研究者的廣泛關注〔2〕。劍葉風尾蕨是鳳尾蕨屬多年生常綠草本植物，具有清熱消食、利尿止痢作用。研究顯示其乙醇提取物對人結腸癌細胞SW579、肝癌細胞HepG2、胃癌細胞BGC-823及肺癌細胞H23具有一定的增殖抑制作用〔3，4〕。但目前劍葉鳳尾蕨對肺癌的遷移、侵襲及增殖的影響及其機制還未有研究。類賴氨酰氧化酶1反義RNA1(LOXL1-AS1)是近年發(fā)現的新型的長鏈非編碼RNA，研究顯示，LOXL1-AS1在膠質母細胞瘤、前列腺癌中具有致癌作用，敲除LOXL1-AS1可抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲〔5，6〕。對NSCLC微陣列分析顯示，LOXL1-AS1在肺癌組織中的表達高于正常組織〔7〕，但其對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及劍葉鳳尾蕨乙醇提取物能否調控LOXL1-AS1表達參與對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的調控尚未可知。本研究擬通過觀察不同濃度劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對肺癌A549細胞增殖、遷移侵襲及LOXL1-AS1表達的影響，初步揭示其調控肺癌細胞生物學行為的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 肺癌細胞A549購于美國ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Hyclone公司；小干擾RNA陰性對照(si-NC)、LOXL1-AS1小干擾RNA(si-LOXL1-AS1)、空載體質粒(pcDNA3.1)、LOXL1-AS1過表達載體(pcDNA3.1-LOXL1-AS1)購于上海吉瑪制藥有限公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)購于北京索萊寶生物科技有限公司；Transwell小室和基質膠購于美國BD公司；兔源細胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、兔源p21抗體、兔源基質金屬蛋白酶(MMP)-2抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體及山羊抗兔Ⅱ抗購于美國Abcam公司；鼠源E鈣黏附蛋白(E-cadherin)抗體及山羊抗鼠Ⅱ抗購于美國Santa Cruz公司；Trizol試劑喝RIPA裂解液購于上海碧云天公司；LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司。

1.2細胞培養(yǎng)和分組 A549細胞用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37℃、含5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，每隔1 d換液1次，當細胞鋪滿瓶底80%時進行傳代，取對數期A549細胞進行實驗。將A549細胞分為0 mg/ml組、3 mg/ml組、6 mg/ml組、12 mg/ml組、si-NC組、si-LOXL1-AS1組、劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組和劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組。3 mg/ml組、6 mg/ml組、12 mg/ml組為分別采用劍葉鳳尾蕨乙醇提取物濃度為3、6、12 mg/ml的細胞培養(yǎng)液處理A549細胞48 h。si-NC組、si-LOXL1-AS1組分別為轉染si-NC、si-LOXL1-AS1的A549細胞。劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組和劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組為分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOXL1-AS1轉染至A549細胞后，采用含6 mg/ml的劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的細胞培養(yǎng)液處理48 h。細胞轉染參照LipofectamineTM2000使用說明書步驟進行。

1.3方法

1.3.1劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的制備 劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的制備參考文獻〔4〕進行，具體如下：將劍葉鳳尾蕨于陰涼處晾干，粉碎后，取10 g樣品加乙醇100 ml利用索氏抽提器連續(xù)回流提取8 h，稀釋提取液至乙醇含量為30%，將石油醚Ⅱ和提取液按照1∶2比例混合后萃取2次，棄去石油醚層，合并萃取蒸干后，加入適量二甲基亞砜溶解，磷酸鹽緩沖液(PBS)定容，獲得1 g/ml的提取液，滅菌后，置于4℃冰箱備用。

1.3.2CCK-8法檢測細胞存活 將A549細胞按照5×103個細胞/孔細胞密度接種于96孔板，當細胞貼壁后，棄去孔內上清液，每孔加入含不同濃度劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液200 μl，另外設置對照(0 mg/ml)組只添加200 μl的RPMI1640培養(yǎng)基，孵育48 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度值，計算細胞存活率。

1.3.3Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲 收集劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)處理48 h的A549細胞和0 mg/ml組細胞，PBS洗滌細胞2次后，用無血清RPMI1640細胞培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×106個/ml。將包被基質膠的Transwell小室進行基底膜水化后，取200 μl細胞懸液加入Transwell上室，24孔板下室加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h，用棉簽輕輕拭去上室未穿膜細胞，甲醇固定，結晶紫染色后，將Transwell小室倒置于顯微鏡下觀察細胞過膜情況，隨即選取5個視野拍照和細胞記數，取均值即為侵襲細胞數目。遷移實驗采用未包被基質膠的Transwell小室，其他步驟同侵襲實驗。

1.3.4Western印跡檢測CyclinD1、p21、E-cadherin和MMP-2蛋白的表達 收集劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)處理48 h的A549細胞和0 mg/ml組細胞，利用PIPA裂解液提取細胞蛋白。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白樣品濃度。將蛋白樣品與2×上樣緩沖液以1∶1比例混合，沸水浴變性5 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白。電泳結束后后，將細胞蛋白電轉至硝酸纖維素膜，采用5%脫脂牛奶中室溫封閉膜1 h，TBST洗膜2 min，加入Ⅰ抗(p21抗體1∶1 000稀釋，內參GAPDH抗體1∶2 500稀釋，其他抗體稀釋比例為1∶500)側擺搖床室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次，加入Ⅱ抗(1∶1 000稀釋)側擺搖床室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，洗膜3次，加入化學發(fā)光顯色試劑于暗室內顯色，以GAPDH為內參，應用ImageJ軟件分析各組細胞目的蛋白的灰度值。

1.3.5qRT-PCR檢測LOXL1-AS1的表達水平 收集劍葉鳳尾蕨乙醇提取物(3、6、12 mg/ml)處理48 h的A549細胞和0 mg/ml組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，分光光度法測定RNA濃度和純度。利用逆轉錄試劑盒合成cDNA，qRT-PCR檢測LOXL1-AS1的表達水平。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列如下：LOXL1-AS1上游引物序列5′-TTCCCATTTACCTGCCCGAAG-3′，下游引物序列5′-GTCAGCAAACACATGGCAAC-3′；GAPDH上游引物序列5′-GGAAGGACTCATGACCACAGTCC-3′，下游引物序列5′-TCGCTGTTGAAGTCAGAGGAGACC-3′。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算LOXL1-AS1的表達水平。

1.3.6抑制LOXL1-AS1對細胞A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響 將A549細胞按照5×103個細胞/孔細胞密度接種于96孔板，當細胞融合度約為60%時，利用脂質體LipofectamineTM2000分別將si-NC、si-LOXL1-AS1轉染至A549細胞，轉染48 h按照1.3.2步驟檢測轉染效果。

1.3.7過表達LOXL1-AS1逆轉劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549增殖、遷移、侵襲的影響 利用脂質體LipofectamineTM2000分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-LOXL1-AS1轉染至A549細胞，采用含6 mg/ml的劍葉鳳尾蕨乙醇提取物的細胞培養(yǎng)液處理48 h。

1.4統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549增殖的影響 與0 mg/ml組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物處理A549細胞后，細胞存活率顯著降低，CyclinD1蛋白的表達顯著降低，p21蛋白的表達顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見圖1、表1。

1～4：0 mg/ml組、3 mg/ml組、6 mg/ml組、12 mg/ml組，下圖同圖1 劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549增殖蛋白表達的影響

2.2劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549遷移、侵襲的影響 與0 mg/ml組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物處理A549細胞后，遷移和侵襲細胞數目顯著減少，E-cadherin蛋白的表達顯著升高，MMP-2蛋白的表達顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見表1，圖2。

圖2 劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.3劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549中LOXL1-AS1表達的影響 0、3、6、12 mg/ml組A549細胞中LOXL1-AS1表達水平分別為〔(1.01±0.10)、(0.70±0.07)、(0.47±0.04)、(0.23±0.02)〕，與0 mg/ml組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物處理A549細胞后，A549細胞中LOXL1-AS1的表達水平均顯著降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。

2.4抑制LOXL1-AS1對細胞A549增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LOXL1-AS1組A549細胞LOXL1-AS1的表達水平顯著降低，細胞存活率、遷移和侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)，CyclinD1和MMP-2蛋白表達顯著降低，p21和E-cadherin蛋白表達顯著升高(均P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 抑制LOXL1-AS1對細胞A549增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響

2.5過表達LOXL1-AS1能逆轉劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549增殖的影響 與劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組A549細胞LOXL1-AS1的表達水平顯著升高，細胞存活率顯著升高，CyclinD1蛋白的表達顯著升高，p21蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。見表3，圖4。

1，2：劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組、劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1，下圖同圖4 過表達LOXL1-AS1能逆轉劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549增殖蛋白表達的影響

2.6過表達LOXL1-AS1能逆轉劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549遷移、侵襲的影響 與劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1組比較，劍葉鳳尾蕨乙醇提取物6 mg/ml+pcDNA3.1-LOXL1-AS1組A549細胞遷移和侵襲數目顯著增加，MMP-2蛋白的表達顯著升高，E-cadherin蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。見圖5，表4。

圖5 過表達LOXL1-AS1能逆轉劍葉鳳尾蕨乙醇提取物對細胞A549遷移、侵襲蛋白表達的影響

3 討 論

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首，已造成嚴重的社會和經濟負擔〔8，9〕。盡管肺癌治療方案不斷進展，肺癌患者的預后仍然很差，患者的5年生存率約為15%〔10〕。

研究顯示中草藥提取物在肺癌治療中有一定療效〔11〕。白花蛇舌草通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路抑制肺癌細胞的體內外增殖，誘導細胞凋亡〔12〕。巖黃連提取物可抑制裸鼠A549細胞移植瘤的生長，減輕肺癌骨轉移對骨質的破壞〔13〕。此外，刺齒鳳尾蕨提取物對人肝癌細胞和結腸癌細胞具有一定的體外抗增殖活性〔14，15〕。CyclinD1是細胞增殖的關鍵蛋白，其在細胞周期從G1期向S期轉換中發(fā)揮促進作用，是細胞增殖的關鍵蛋白，而p21則發(fā)揮相反的作用。E-cadherin是上皮細胞的標志蛋白，當細胞上皮間質轉化(EMT)過程中，上皮細胞失去細胞間連接和極性，獲得間充質細胞特性，提高細胞的遷移和侵襲能力〔16〕。MMP-2可降解細胞外基質，促進細胞浸潤轉移。檢測增殖、遷移侵襲相關蛋白表達發(fā)現CyclinD1和MMP-2蛋白的表達顯著降低，p21和E-cadherin蛋白的表達顯著增加，與功能實驗結果一致。提示劍葉鳳尾蕨乙醇提取物可有效抑制A549細胞增殖、遷移和侵襲，具有肺癌治療潛力。

LOXL1-AS1位于人類染色體15q24.1位置，由10 781個核苷酸組成。研究顯示氧化應激和循環(huán)機械應激分別導致人晶狀體上皮細胞和神經根管內皮細胞中LOXL1-AS1表達的失調，與青光眼和剝脫綜合征密切相關〔17，18〕。隨后在癌癥中逐漸發(fā)現LOXL1-AS1表達失調。LOXL1-AS1在骨肉瘤組織中呈高表達，其高表達與骨肉瘤患者腫瘤大小、遠端轉移、組織學分級及總生存時間有關，下調LOXL1-AS1可有效抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移和侵襲〔19〕。LOXL1-AS1高表達還與膽管癌淋巴結浸潤、原發(fā)腫瘤局部淋巴結遠處轉移分期及預后不良有關，其可促進膽管癌細胞增殖、遷移、侵襲和減少腫瘤凋亡，從而在膽管癌中發(fā)揮致瘤作用〔20〕。本研究結果說明劍葉鳳尾蕨乙醇提取物通過調控LOXL1-AS1表達參與對肺癌細胞惡性生物學行為的調控。