楊光偉 鄧楠

(1西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院神經(jīng)外科,四川 瀘州 646000；2 瀘州市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

腦膠質(zhì)瘤是一種常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差〔1〕。膠質(zhì)瘤的治療有手術(shù)、放療、化療等方法，但治療效果不佳〔2〕。膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，從基因水平探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，從而進(jìn)行基因治療膠質(zhì)瘤日益受到關(guān)注。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本超過(guò)200個(gè)核苷酸但不編碼蛋白質(zhì)的，依據(jù)其相對(duì)于蛋白編碼基因的位置，可分為正義、反義、基因內(nèi)、基因間LncRNA〔3〕。研究顯示，LncRNA可參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔4～6〕。如敲減LncRNA HOXC-ASl可通過(guò)下調(diào)HOXC8表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。研究顯示，反義LncRNA胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP)7-AS1在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)升高〔8〕，但其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還未知。本研究主要探討敲減LncRNA IGFBP7-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、A172、U87均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；胎牛血清(FBS)和RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、兔抗人IGFBP7單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；鼠抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；IGFBP7-AS1的si-RNA及陰性對(duì)照、IGFBP7過(guò)表達(dá)載體均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和分組轉(zhuǎn)染 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、A172、U87細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d更換新鮮的培養(yǎng)基。細(xì)胞融合至80%時(shí)，胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞，接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至60%時(shí)，參照LiPofectamineTM2000試劑盒操作說(shuō)明，分別轉(zhuǎn)染IGFBP7-AS1的si-RNA(si-IGFBP7-AS1組)、si-RNA陰性對(duì)照(si-con組)、共轉(zhuǎn)染si-IGFBP7-AS1與IGFBP7過(guò)表達(dá)載體(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組)、si-IGFBP7-AS1與空載體(si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組)。轉(zhuǎn)染后48 h，qRT-PCR檢測(cè)IGFBP7-AS1、Western印跡檢測(cè)IGFBP7蛋白評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)IGFBP7-AS1表達(dá) 各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，加入Trizol試劑，提取總RNA。微量核酸儀檢測(cè)細(xì)胞RNA的純度和濃度后，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算IGFBP7-AS1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3Western印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞中加入蛋白裂解液，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。取適量蛋白，100℃煮沸5 min。變性后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入IGFBP7、Bcl-2和Bax抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5 min。然后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.4四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 各組轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞，以每孔1×103個(gè)接種于96孔板中。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，混合均勻后于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(A)。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲 各組轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞，PBS清洗后，加入不含F(xiàn)BS的細(xì)胞RPMI1640培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μl細(xì)胞懸液，加入Transwell上室。下室加入500 μl含F(xiàn)BS的RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，棉簽擦去小室內(nèi)膜細(xì)胞。倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：預(yù)先將基質(zhì)膠用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋(比例1∶8)，鋪于Transwell上室，自然晾干。然后再取100 μl細(xì)胞懸液，加入鋪有基質(zhì)膠的上室，后續(xù)操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)接種于24孔板中。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，吸棄PBS。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說(shuō)明，加入400 μl結(jié)合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細(xì)胞。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min。最后加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1IGFBP7-AS1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá) 與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA1800中IGFBP7-AS1表達(dá)水平(1.00±0.12)比較，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251、A172、U87顯著升高〔(4.12±0.45)、(3.98±0.37)、(3.89±0.41)，P<0.05〕。

2.2敲減IGFBP7-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移和侵襲的影響 si-IGFBP7-AS1組IGFBP7-AS1水平顯著低于si-con組(P<0.05)，表明si-IGFBP7-AS1轉(zhuǎn)染成功，U251細(xì)胞中IGFBP7-AS1敲低。與si-con組比較，si-IGFBP7-AS1組U251細(xì)胞A值、遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞侵襲和遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

2.3敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響 與si-con組比較，si-IGFBP7-AS1組U251細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖2，圖3。

圖2 敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響

圖3 敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞中IGFBP7表達(dá)的影響 與si-con組U251細(xì)胞IGFBP7蛋白表達(dá)水平(1.00±0.13)比較，si-IGFBP7-AS1組(0.32±0.04)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

1～4：si-con組;si-IGFBP7-AS1組;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組圖4 Western印跡檢測(cè)U251細(xì)胞中IGFBP7的表達(dá)

2.5過(guò)表達(dá)IGFBP7逆轉(zhuǎn)敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用 si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組U251細(xì)胞IGFBP7蛋白表達(dá)水平(0.91±0.05)顯著高于si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組(0.34±0.05，P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。見(jiàn)圖4。與si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組比較，si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組U251細(xì)胞A值、遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6過(guò)表達(dá)IGFBP7逆轉(zhuǎn)敲減IGFBP7-AS1對(duì)U251細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用 與si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組比較，si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組凋亡率和Bax蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖5。

1～2：si-IGFBP7-AS1+pcDNA-control組;si-IGFBP7-AS1+pcDNA-IGFBP7組圖5 U251細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

隨著對(duì)LncRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)LncRNA參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用〔9〕。

細(xì)胞的異常增殖可引起腫瘤的發(fā)生〔10〕。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的主要作用機(jī)制。本研究結(jié)果說(shuō)明IGFBP7-AS1影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，是膠質(zhì)瘤治療的潛在作用靶點(diǎn)。Bax是一種促凋亡蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，兩者參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。Bax表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2表達(dá)升高則抑制細(xì)胞凋亡〔11〕。敲減IGFBP7-AS1抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)了Bax蛋白表達(dá)，與相關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致〔12〕，提示IGFBP7-AS1通過(guò)調(diào)控胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

IGFBP7是一種可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附及血管形成的可溶性蛋白，參與結(jié)腸癌、多發(fā)性骨髓瘤等腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔13，14〕。Jiang等〔15〕研究顯示，IGFBP7表達(dá)與膠質(zhì)瘤腫瘤等級(jí)、患者總體存活率相關(guān)，抑制IGFBP7表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果提示IGFBP7-AS1通過(guò)下調(diào)IGFBP7表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，原因可能是IGFBP7-AS1水平降低可通過(guò)影響IGFBP7基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白去乙?；傅母患?，使IGFBP7基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙?；桨l(fā)生改變，從而抑制IGFBP7基因轉(zhuǎn)錄〔16〕。