薛晶 程玉 陳永良 嚴(yán)曉麗 嚴(yán)鵬 申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院 1形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，河北 承德 067000；2附屬醫(yī)院)

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致女性死亡的重要因素，近年來其發(fā)病率及死亡率有逐年上升的趨勢〔1～4〕。對(duì)于乳腺癌的治療，早期手術(shù)切除效果較好，但是如已發(fā)生轉(zhuǎn)移，手術(shù)效果會(huì)大打折扣，因此尋找治療乳腺癌的有效靶點(diǎn)已迫在眉睫。胰島素樣生長因子(IGF)家族調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡及癌變，這些不同的生物活性主要通過IGF與受體Ⅰ型和Ⅱ型(IGF-ⅠR和IGF-ⅡR)的結(jié)合介導(dǎo)。流行病學(xué)研究表明，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族(IGFBPs)與幾種常見癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)〔5〕。IGFBP-6通過特異性結(jié)合IGF-Ⅱ抑制細(xì)胞增殖〔3〕。基因芯片研究也表明IGFBP-6在癌癥中具有抗增殖作用〔7〕。IGFBP-6對(duì)乳腺癌的作用尚無報(bào)道，因此本文主要探討IGFBP-6對(duì)乳腺癌組織及細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1材料 收集2017年4月至2018年2月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科乳腺癌手術(shù)切除石蠟標(biāo)本80例及癌旁組織標(biāo)本50例，術(shù)前告知患者并與家屬簽署知情同意書?；颊咝g(shù)前均未接受過任何形式的放化療治療。

細(xì)胞系及主要試劑：人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自美國Gibco公司，優(yōu)級(jí)胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，IGFBP-6質(zhì)粒購自蘇州吉瑪基因股份有限公司，IGFBP-6抗體購自英國Abcam公司(1∶100稀釋)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，實(shí)驗(yàn)所需無水乙醇、二甲苯均為分析純，均由承德醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供，Trizol試劑購自Invitrogen公司，IGFBP-6基因和β-actin 均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，超凈工作臺(tái)(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀ELX808(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2免疫組織化學(xué)法檢測乳腺組織中IGFBP-6的表達(dá) 采用免疫組化Maxvision法檢測乳腺癌及癌旁乳腺組織中IGFBP-6的表達(dá)，根據(jù)步驟依次進(jìn)行，加一抗(稀釋1∶100)，二抗，DAB顯色。結(jié)果根據(jù)Volm雙評(píng)分法判定。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞MCF-7用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，放置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，細(xì)胞每2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種到6孔板中，每孔加2 ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染IGFBP-6。操作步驟按照Transemate試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4MTT法檢測上調(diào)IGFBP-6對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 將實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組細(xì)胞接種與96孔板，每孔接種細(xì)胞1×104個(gè)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入15 μl二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀上震動(dòng)10 min，測定波長在490 nm處各孔細(xì)胞的光密度(OD)值。

1.5qRT-PCR法檢測IGFBP-6 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后36 h收集細(xì)胞，按照Trizol說明書提取總RNA，評(píng)價(jià)RNA純度，根據(jù)天跟FastQuant 試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。PCR所用引物由上海生工設(shè)計(jì)，引物序列：H-GAPDH正義鏈為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，H-GAPDH反義鏈為5′-TGGTGAAGACGACAGTGGA-3′；IGFBP-6正義鏈為5′-AGGAATCCAGGCACCTCTACCAV-3′，IGFBP-6反義鏈為5′-AGCACTGAGTCCAGATGTCTACGG-3′，將PCR體系加入8聯(lián)排，反應(yīng)條件參照說明書在CFX96定量PCR儀中運(yùn)行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。轉(zhuǎn)染48 h后取所有組別的細(xì)胞，提取RNA，采用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后RNA相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt為mRNA的相對(duì)表達(dá)量，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組〔Ct(IGFBP-6)-Ct(GAPDH)〕-空白對(duì)照組〔Ct(IGFBP-6)-Ct(GAPDH)〕。

1.6Rt-PCR法檢測乳腺癌組織中IGFBP-6 mRNA的表達(dá) 采用TRIzol一步法對(duì)組織提取RNA，所用組織為乳腺癌及癌旁乳腺組織，所用引物為IGFBP-6和GAPDH。取擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色跑膠20 min后在紫外熒光數(shù)字成像儀下攝像，進(jìn)行定量分析，以IGFBP-6與相應(yīng)GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物條帶累積吸光度的比值作為IGFBP-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行秩和檢驗(yàn)、兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌及癌旁組織中IGFBP-6的表達(dá) IGFBP-6主要表達(dá)于癌旁乳腺組織及乳腺癌細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒狀，著色不一。在乳腺癌標(biāo)本80例中，IGFBP-6表達(dá)陰性18例(22.50%)，弱陽性55例(68.75%)，中度陽性6例(7.50%)，強(qiáng)陽性1例(1.25%)；癌旁組織50例中，IGFBP-6表達(dá)陰性1例(2.0%)，弱陽性7例(14.0%)，中度陽性13例(26.0%)，強(qiáng)陽性29例(58.0%)。可以看出乳腺癌中IGFBP-6表達(dá)陽性率及染色強(qiáng)度較癌旁組織顯著降低(P<0.05)，推斷IGFBP-6在乳腺癌中低表達(dá)。見圖1。

圖1 IGFBP-6癌旁組織及乳腺癌組織中的表達(dá)(Maxvision法，×40)

2.2上調(diào)IGFBP-6抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力 轉(zhuǎn)染24 h、48 h后，MTT法檢測顯示實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖活性均顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.3轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞IGFBP-6的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組IGFBP-6表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。見表1。

2.4乳腺癌組織及癌旁組織IGFBP-6 mRNA表達(dá)比較 乳腺癌組織IGFBP-6 mRNA表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(0.44±0.04 vs 0.83±0.08,P<0.05)。

3 討 論

乳腺癌治療以手術(shù)為主要方法，并結(jié)合放化療,內(nèi)分泌治療等綜合治療方法，但乳腺癌生物行為有待研究，治療效果欠佳，預(yù)后難料〔8〕。這可能與乳腺癌的生物學(xué)異質(zhì)性有關(guān)。近年來腫瘤的生物學(xué)治療得到越來越多的關(guān)注，乳腺癌靶向治療成為臨床研究熱點(diǎn)，其治療效果也得到顯著提高〔9〕。因此，需要新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)來指導(dǎo)和改進(jìn)乳腺癌患者的治療方法。

對(duì)IGF軸進(jìn)行異常刺激可以導(dǎo)致癌癥的發(fā)展和進(jìn)展〔10〕。研究表明與非腫瘤組織相比，胃腺癌組織中IGFBP-6的表達(dá)降低，且分化程度越低，IGFBP-6表達(dá)越低〔11〕；一項(xiàng)體外研究表明IGFBP6是鼻咽癌的抑癌因子，IGFBP-6陽性表達(dá)與降低局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。Cox模型的多因素分析表明IGFBP-6是鼻咽癌局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物〔12,13〕。

本研究通過免疫組織化學(xué)及RT-PCR法研究發(fā)現(xiàn)IGFBP-6蛋白及mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，細(xì)胞中研究表明在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中轉(zhuǎn)染IGFBP-6后可明顯抑制細(xì)胞增殖，本研究結(jié)果與Kaulsay等〔14〕結(jié)果一致，與良性乳腺腫瘤患者的血清相比，乳腺癌患者血清IGFBP-6濃度較低。

Xu等〔15〕發(fā)現(xiàn)IGFBP-6和趨化因子(C-C motif)配體(CCL)18是前列腺癌新的血清生物標(biāo)志物。二乙基己烯雌酚處理后IGFBP-6水平升高，重組IGFBP-6對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用〔16〕。這些發(fā)現(xiàn)可提示IGFBP-6可能作為多種腫瘤的標(biāo)志物〔17〕。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同的乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞降低了細(xì)胞的增殖率。表明IGFBP-6對(duì)乳腺癌的增殖起到抑制作用，但其主要機(jī)制還在進(jìn)一步研究中，具體主要從兩個(gè)方面：一，抑制血管生成；二促進(jìn)凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明IGFBP6可能作為一種新的乳腺癌預(yù)后標(biāo)志物。在臨床治療中起到一定的指導(dǎo)作用。