巨英超 張新飛 李星 劉亮

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 1實驗動物中心，河北 石家莊 050011；2肺瘤研究所)

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率及病死率較高〔1,2〕，嚴重威脅人們的生命健康。早期肝癌癥狀不明顯，患者確診時多為中晚期，已失去手術的最佳時期，往往會選擇放化療及介入治療，但治療效果均不佳。臨床上尋找高效低毒的肝癌治療方法具有重大意義。中藥治療腫瘤已有悠久的歷史〔3～5〕，傳統(tǒng)的中藥服藥方法多為口服，口服中藥會對患者胃及肝臟造成損傷，尋找新的給藥方式對于提高中藥治療腫瘤效果及降低毒副作用具有重要意義。呼吸道給藥可以很好解決這些問題，而且易于患者接受，且呼吸道給藥具有悠久的歷史。本研究將中草藥經(jīng)過炮制后制成膏劑，采用中藥膏劑呼吸道用藥，治療肝癌細胞昆明小鼠皮下移植瘤，觀察中藥呼吸道用藥抑制肝癌皮下移植瘤生長作用，并初步研究藥物對機體的毒副作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 CD4-FITC/CD8-FITC/CD3-PE 抗體購自美國Biolegend 公司；碘化丙啶染液購自美國BD公司； FC500型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.2藥物主要成分配制和給藥方式 取蟲草1 g、甲珠15 g、 蜈蚣23條、 蝎子15 g、 丹參15 g、 桃仁15 g、 姜蠶15 g、 紅花16 g、 山茨菇15 g、 白芥子15 g、 水牛角絲15 g、 枸杞子15 g、 甘草15 g， 經(jīng)過炮制后制成中藥藥膏。吸入中藥的給藥方式：上述多種中草藥經(jīng)過炮制后制成的膏劑能散發(fā)氣味，將50 g藥物裝入揮發(fā)管中，將膏狀藥物打孔確保揮發(fā)充分。將荷瘤小鼠放入口鼻暴露裝置中，口鼻朝向揮發(fā)管，連接揮發(fā)管后打開儀器，使空氣流向動物方向，攜帶藥物散發(fā)的氣體供動物吸入。

1.3實驗動物 從河北省實驗動物中心購買昆明小鼠20只，雌雄各半，體重16～20 g，許可證編號：SCXK(冀)2013-1-003。飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境，空氣潔凈度為7 級，換氣次數(shù)為15次/h，溫度21～25℃，相對濕度45%～65%。

1.4模型的建立及分組 將鼠源性肝癌H22細胞接種至昆明小鼠腹腔，待形成腹水后，用20 ml注射器抽取腹水；用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2遍后進行細胞計數(shù)，按5×106個/ml，接種0.2 ml細胞懸液至昆明小鼠右前肢肩甲處皮下。荷瘤小鼠隨機分為兩組(n=10)，每組雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。中藥組：將50 g藥物裝入揮發(fā)管中，將膏狀藥物打孔確保揮發(fā)充分，將荷瘤小鼠放入口鼻暴露裝置中，口鼻朝向揮發(fā)管，連接揮發(fā)管后打開儀器，使空氣流向動物方向，攜帶藥物散發(fā)的氣體供動物吸入，每天呼吸道給藥1次，持續(xù)6 h，連續(xù)給藥21 d；對照組：放置于與實驗組相同的裝置中，但管中沒有中藥，只通相同時間的空氣。所有動物停藥第2日(23 d)取材檢測各項指標。實驗期間每天觀察小鼠一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、排便及活動等，接種H22細胞7 d開始，每周測量移植瘤長短徑及鼠重1次。

1.5標本采集及檢測

1.5.1血液標本 腹腔注射2%戊巴比妥麻醉動物，經(jīng)內(nèi)眥取血，抗凝。

1.5.2腫瘤標本 脫頸處死動物，剝離皮下移植瘤，稱重后，分別用70%乙醇和4%多聚甲醛固定，部分組織剝離后及時用網(wǎng)搓法制備成單細胞懸液。

1.5.3移植瘤生長抑制情況 移植瘤體積生長趨勢：實驗期間，每周測量瘤體最長徑和最短徑，計算瘤體積(瘤體積=長徑×短徑2/2)，比較各組移植瘤生長狀況。計算腫瘤質(zhì)量/體積抑制率：腫瘤質(zhì)量/體積抑制率=(對照組腫瘤質(zhì)量/體積-實驗組腫瘤質(zhì)量/體積)/對照組腫瘤質(zhì)量/體積×100%。

1.6小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)病理學檢測 多聚甲醛(4%濃度)固定標本進行脫水，石蠟包埋，行常規(guī)病理切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色觀察移植瘤組織形態(tài)。

1.7小鼠皮下移植瘤細胞凋亡及周期檢測 取70%乙醇固定的移植瘤標本，利用網(wǎng)搓法制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107/ml，取0.1 ml細胞懸液，加入碘化丙啶染液0.5 ml，染色30 min，PBS洗滌細胞1次，加入1 ml PBS，于流式細胞儀檢測移植瘤細胞的DNA，Expo 32 ADC軟件分析熒光數(shù)據(jù)，以亞二倍體細胞峰代表細胞凋亡峰計算細胞凋亡率；MultiCycle AV軟件分析細胞周期，細胞增殖狀態(tài)以增殖指數(shù)表示，增殖指數(shù)(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.8荷瘤小鼠T細胞免疫功能檢測 流式細胞術檢測小鼠靜脈血CD4+、CD8+及CD3+T淋巴細胞比例，停用藥物第2日， 經(jīng)小鼠內(nèi)眥靜脈取血0.5 ml，抗凝，取100 μl抗凝血，向其中分別加入10 μl CD4-FITC、CD8-FITC和CD3-PE 抗體， 室溫避光放置30 min， 裂解紅細胞后用流式細胞儀檢測。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1荷瘤小鼠一般情況和體重變化 中藥組荷瘤小鼠一般狀態(tài)良好，精神及活動正常，進食、飲水無明顯變化，毛色光潔，體重變化平緩，無明顯不良反應。對照組皮下移植瘤生長迅速，后期活動減少，進食、飲水無明顯變化，體重持續(xù)增長，21 d、23 d對照組體重顯著高于中藥組(P<0.05)，見表1。其中第16 天兩組各死亡 1 只荷瘤小鼠，均因腫瘤生長包裹頸部和面部引起窒息導致小鼠死亡。

表1 各組給藥后不同時間體重比較

2.2昆明小鼠皮下移植瘤的生長抑制情況 23 d中藥組皮下移植瘤體積顯著小于對照組(P<0.05)，瘤體積抑制率為37.43%，中藥組移植瘤質(zhì)量〔(4.96±1.16)g〕顯著低于對照組〔(7.79±2.33)g，P<0.01〕，瘤質(zhì)量抑制率為36.33%。兩組各時間點移植瘤體積見表2。

2.3昆明小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學觀察 HE染色結(jié)果顯示，中藥組可見纖維組織增生，瘤細胞散在排列，瘤組織內(nèi)壞死廣泛分布，無明顯區(qū)域性，瘤組織周圍淋巴細胞浸潤較多。對照組瘤組織壞死主要局限于中央?yún)^(qū)域，周邊區(qū)域壞死較少，瘤細胞豐富，細胞間排列緊密，細胞異型性明顯，大小不一，細胞核大小、形狀和染色不一，病理性核分裂象多見。見圖1。

圖1 昆明小鼠皮下移植瘤組織形態(tài)學觀察(HE,×200)

2.4兩組皮下移植瘤細胞凋亡及細胞增殖的影響 中藥組移植瘤細胞凋亡率〔(20.81±2.24)%〕顯著高于對照組〔(13.22±3.27)%，P<0.01〕。中藥組皮下移植瘤細胞增殖指數(shù)〔(55.26±2.34)%〕顯著低于對照組〔(59.48±0.99)%，P<0.01〕。

2.5中藥呼吸道用藥對荷瘤小鼠免疫功能的影響 中藥組荷瘤小鼠靜脈血中CD3+、CD4+、CD8+T細胞比率〔(66.20±5.62)%〕、〔(48.23±6.99)%〕、〔(19.04±4.89)%〕與對照組〔(50.69±3.71)%〕、〔32.36±2.92)%〕、〔(13.58±2.28)%〕相比，顯著增高(P<0.05)。中藥組CD4/CD8 比值(2.73±1.02)高于對照組(2.44±0.43)，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討 論

肝癌目前治療方法包括手術、放化療及介入治療，但治療效果均不佳。中藥治療腫瘤具有悠久的歷史〔6～11〕，具有毒副作用低，價格低廉等優(yōu)點。但傳統(tǒng)的中藥服藥方法多為口服，口服中藥會對患者胃及肝臟造成損傷〔12〕。呼吸道給藥可以很好解決這些問題，而且易于患者接受〔13,14〕。呼吸道給藥具有悠久的歷史，《本草綱目》中記載用巴豆油紙拈，燃煙熏鼻，治療中風痰厥、氣厥、中毒等病癥；漢代《傷寒雜病論》即開鼻藥治療急癥之先河，其治“卒死”系以“韭?lián)v汁，灌鼻中”，開竅回蘇。呼吸道給藥主要藥物吸收部位在鼻腔和肺部，鼻腔深12～14 cm，中部鼻甲骨部膨大，鼻腔壁上有黏膜，鼻黏膜中有豐富的由靜脈血管組成的海綿狀組織或海綿體，鼻腔黏膜的表面積很大，大大增加藥物吸收的有效表面積，鼻黏膜內(nèi)有豐富的毛細血管，能使藥物從鼻腔內(nèi)吸收后直接進入體循環(huán)，而不經(jīng)過門肝系統(tǒng)，避免了肝臟的首過效應；肺腔具有很大的吸收面積，具有豐富的毛細血管，又沒有消化酶對藥物的破壞。研究發(fā)現(xiàn)中藥膏劑呼吸道給藥可以抑制S180荷瘤小鼠的瘤體生長〔15〕。本研究結(jié)果提示中藥組對小鼠皮下移植瘤具有生長抑制作用，其作用機制與提高小鼠T細胞免疫功能及誘導皮下移植瘤細胞凋亡相關。