張寨南 林茂 胡云 王春梅

(遵義醫(yī)科大學(xué)珠海校區(qū) 1生理學(xué)教研室，廣東 珠海 519000；2生物工程系)

阿爾茨海默病(AD)是一種多發(fā)于老年期、以漸進(jìn)性記憶和認(rèn)知功能減退為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病〔1〕。核心致病學(xué)說“淀粉樣級(jí)聯(lián)假說”認(rèn)為，β淀粉樣蛋白(Aβ)在AD致病過程中起著關(guān)鍵作用，由于病理改變等原因，導(dǎo)致淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)的數(shù)量異常增多，增多的Aβ進(jìn)而激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)突觸造成直接損害，最終Aβ在腦內(nèi)沉積形成老年斑，導(dǎo)致AD神經(jīng)元變性和癡呆產(chǎn)生〔2〕。因此，認(rèn)為Aβ的沉積是AD病理過程的關(guān)鍵因素與環(huán)節(jié)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，中樞胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損與Aβ異常代謝互相關(guān)聯(lián)〔3〕。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要是指胰島素與胰島素受體(InR)結(jié)合導(dǎo)致受體的酪氨酸激酶被激活，激活的酪氨酸激酶由此啟動(dòng)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將信號(hào)傳導(dǎo)至靶點(diǎn)并介導(dǎo)啟動(dòng)多種生理學(xué)效應(yīng)的過程〔4〕。胰島素信號(hào)通路主要有3條：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)途徑、PI3K/PKC途徑和有絲裂原活化蛋白酶(MAPK)途徑〔5〕。Aβ參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與蛋白酪氨酸激酶(PTK)有關(guān)，PTK能激活糖原合成酶激酶(GSK)-3β，GSK-3β位于胰島素PI3K/PKB信號(hào)通路中，是Tau蛋白磷酸化的重要激酶，能夠引起Tau蛋白磷酸化〔6，7〕。本文通過建立AD小鼠模型，研究Aβ1～42在PI3K/PKB信號(hào)通路的影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1儀器與材料 萬分之一天平(上海精密科學(xué)有限公司)，DYY-8c型電泳儀(北京六一公司)，G-Box HR全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)，Centrifuge 5415R冷凍高速離心機(jī)(美國Gene)，STT-2型小鼠跳臺(tái)儀(北京科學(xué)院研究所)。Aβ1～42、鏈脲佐菌素(STZ)、人工胰島素購自Sigma公司；p-Tau抗體、p-PKB抗體、p-GSK-3β、β-actin抗體購自Abcam公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)有限公司。SD小鼠，雄性，體重(20±2)g，廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

1.2模型制備與動(dòng)物分組 側(cè)腦室注射STZ 3 mg/kg制備AD模型，隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、Aβ1～42低劑量(0.015 mg/kg)組、Aβ1～42中劑量(0.050 mg/kg)組、Aβ1～42高劑量(0.150 mg/kg)組、胰島素組，每組10只，造模14 d，Aβ1～42低、中、高組側(cè)腦室注射不同劑量的Aβ1～42，胰島素組側(cè)腦室注射人工胰島素1 U(100 U/m1)；假手術(shù)組和模型組注射等體積的生理鹽水。

1.3跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠認(rèn)知功能 末次給藥后，先將小鼠放置于跳臺(tái)儀內(nèi)適應(yīng)4.0 min，隨即將跳臺(tái)儀通電。小鼠遭受電擊，正常反應(yīng)為躲避電擊跳上絕緣臺(tái)。小鼠5.0 min內(nèi)跳下絕緣臺(tái)次數(shù)記錄為學(xué)習(xí)成績。第2天同一時(shí)間再次將小鼠放置于絕緣臺(tái)，其5.0 min內(nèi)第1次從臺(tái)上跳下時(shí)間記錄為潛伏期。同時(shí)小鼠于5.0 min內(nèi)跳下絕緣臺(tái)總次數(shù)記錄為錯(cuò)誤次數(shù)。

1.4ELISA試劑盒檢測(cè)小鼠海馬InR 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)后各組小鼠斷頭取腦，剝離海馬，取適量海馬組織勻漿，4℃ 3 000 r/min離心10 min取得待測(cè)樣本，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測(cè)InR含量。

1.5Western印跡法檢測(cè)小鼠海馬p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β 提取各組小鼠海馬組織蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%BSA室溫下封閉1 h，分別加入一抗p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β、β-Actin，4℃封閉過夜。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加二抗，室溫孵育1 h。在全自動(dòng)凝膠成像儀中曝光、顯影，以目的條帶灰度值與內(nèi)參(β-actin)條帶平均灰度值的比值統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

1.6數(shù)據(jù)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組練習(xí)錯(cuò)誤和記憶錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多、潛伏期顯著縮短(P<0.05)；與模型組比較，Aβ1～42不同劑量組練習(xí)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加、潛伏期顯著縮短(P<0.05，P<0.01)，胰島素組練習(xí)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少、潛伏期顯著增加(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)成績結(jié)果

2.2Aβ1～42對(duì)各組小鼠海馬InR含量的影響 與假手術(shù)組〔(24.56±0.713)ng/ml〕比較，模型組InR表達(dá)量〔(13.38±0.923)ng/ml〕明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，Aβ1～42低、中、高劑量組InR表達(dá)量〔(8.88±0.576)ng/ml、(7.08±0.540)ng/ml、(5.36±0.817)ng/ml〕明顯降低(P<0.01)；胰島素組InR表達(dá)量明顯升高〔(19.88±1.858)ng/ml,n=5,P<0.01〕。

2.3Aβ1～42對(duì)各組小鼠海馬p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β蛋白表達(dá)量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組p-PKB、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量明顯降低，p-Tau表達(dá)量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，Aβ1～42不同劑量組p-PKB、p-GSK-3β蛋白表達(dá)量明顯降低，p-Tau表達(dá)量明顯升高(P<0.05，P<0.01)；胰島素組p-PKB、p-GSK-3β的表達(dá)量升高，p-Tau表達(dá)水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)。見圖1、表2。

1～6：假手術(shù)組、模型組、Aβ1～42低劑量組、Aβ1～42中劑量組、Aβ1～42高劑量組、胰島素組圖1 各組海馬p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β蛋白表達(dá)

表2 各組海馬p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β蛋白表達(dá)比較

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)AD早期病理紊亂信號(hào)常表現(xiàn)為葡萄糖代謝減弱及胰島素信號(hào)通路障礙〔8，9〕。本研究中采用了雙側(cè)側(cè)腦室注射STZ誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能障礙模型。通過側(cè)腦室內(nèi)注射STZ可持續(xù)的減少腦內(nèi)葡萄糖攝入，使得葡萄糖代謝減弱，進(jìn)而使腦內(nèi)的胰島素受體不敏感，引發(fā)胰島素信號(hào)障礙，最終誘導(dǎo)類似于AD的病理學(xué)和行為學(xué)特征，如神經(jīng)元變性、突觸缺失、Aβ異常增加、神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生、認(rèn)知功能減弱等〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙側(cè)側(cè)腦室注射 STZ 導(dǎo)致小鼠腦內(nèi)特征病理蛋白tau蛋白明顯升高，記憶學(xué)習(xí)功能減退，提示本研究模型制備成功。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Aβ1～42能夠?qū)D早期病理改變、學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能產(chǎn)生影響，且可以干擾胰島素信號(hào)通路功能，該影響的具體機(jī)制與抑制PI3K/PKB信號(hào)通路相關(guān)蛋白InR、p-PKB、p-GSK-3β的表達(dá)有關(guān)。

AD致病過程中Aβ可形成多種動(dòng)態(tài)過渡結(jié)構(gòu)，包括復(fù)雜的單體、不同類型的寡聚體及原纖維，這些動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)最終自發(fā)性聚集形成老年斑，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。其中，屬Aβ1～42具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性〔10〕。Aβ可提高小膠質(zhì)細(xì)胞中p38MAPK的活性，且可通過PI3K/PKB信號(hào)通路途徑誘導(dǎo)tau蛋白過磷酸化，發(fā)揮神經(jīng)毒性〔5〕。本實(shí)驗(yàn)中不足之處在于只針對(duì)胰島素信號(hào)通路的PI3K/PKB途徑進(jìn)行了探討，對(duì)MAPK及PI3K/PKC途徑未做深入研究，胰島素信號(hào)通路異常僅引起蛋白異常反應(yīng)或是基因靶點(diǎn)異常也無法明確，因此，針對(duì)Aβ1～42在AD致病過程是如何通過影響胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生毒性作用值得我們進(jìn)行深入的多角度的綜合性研究。

胰島素信號(hào)通路是一種復(fù)雜的、跨越多種疾病的生理信號(hào)通路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素信號(hào)通路異?？捎|發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生異常蛋白反應(yīng)〔11〕。除了廣泛研究的糖尿病之外，許多其他疾病也與異常蛋白折疊反應(yīng)及蛋白質(zhì)表達(dá)失衡密切相關(guān)，這些疾病包含神經(jīng)退行性疾病，如肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥和AD〔12，13〕。此外，新的研究發(fā)現(xiàn)腸道胰島素/胰島素生長因子(IGF)1信號(hào)通過叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)1調(diào)節(jié)上皮完整性和對(duì)結(jié)腸癌的易感性〔14〕。因此，通過研究和理解胰島素信號(hào)通路在維持蛋白質(zhì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮的更廣泛的作用，可能也會(huì)開發(fā)出治療神經(jīng)退行性疾病及其他疾病的新方法。