王建營(yíng) 李晶 于飛 姚光 解立杰 張全意

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 濱州 256603)

心肌梗死(MI)屬于冠心病的危急重癥之一，是因冠狀動(dòng)脈硬化、堵塞而導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈的血流量下降、心肌組織缺血缺氧壞死性疾病，其發(fā)病率和死亡率上升，嚴(yán)重影響人們的生命健康〔1，2〕。積極尋找有效的治療MI的方法，一直是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一〔3〕。冠狀動(dòng)脈阻塞和粥樣硬化導(dǎo)致的心肌組織缺血可觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，適當(dāng)?shù)腅RS可保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷，而長(zhǎng)期嚴(yán)重的ERS反而會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重組織損傷〔4〕，而ERS介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，在心肌缺血、心室重構(gòu)等心血管病理發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控作用越來(lái)越受到臨床研究的重視〔5，6〕。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT) 信號(hào)通路可調(diào)控ERS，誘導(dǎo)和促進(jìn)ERS標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP)78蛋白表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程〔7，8〕。但PI3K/AKT/GRP78通路在MI心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程的作用研究較少。白芨多糖是從中藥白芨塊莖中提取分離得到的一種新型葡萄甘露聚糖活性物質(zhì)，有促進(jìn)造血、修復(fù)潰瘍組織損傷等多種藥理作用，并逐漸受到科研探討和藥物研發(fā)的關(guān)注〔9〕。但白芨多糖對(duì)MI的保護(hù)作用，及PI3K/AKT/GRP78通路介導(dǎo)的 ERS心肌細(xì)胞凋亡的影響未見(jiàn)報(bào)道，本文對(duì)此進(jìn)行探討，以期為白芨多糖在MI領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料及方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠62只，體重 200～220 g，清潔級(jí)由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，批號(hào)SYXK(魯)20180022。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，批號(hào)為〔2019〕倫審字(KT-002)。白芨多糖(批號(hào)：20180624008，購(gòu)自愛(ài)必信上海生物公司，規(guī)格：20 mg)；三苯基氯化四氮唑(TTC)試劑盒(貨號(hào)：YANJ-298-96-4，購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物公司)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(批號(hào)：20190721003，購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程公司)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(貨號(hào)：CSB-E14402，購(gòu)自上海振譽(yù)生物公司)；心肌肌鈣蛋白(cTn)I試劑盒(貨號(hào)：JC-E8061，購(gòu)自上海機(jī)純實(shí)業(yè)公司)；PI3K(貨號(hào)：ab39307)、AKT磷酸化(p-AKT,貨號(hào)：ab38449)、GRP78抗體(貨號(hào)：ab191023)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)磷酸化(p-PERK)抗體(貨號(hào)：ab192591)、真核細(xì)胞翻譯起始因子(eIF)2α磷酸化(p-eIF2α)抗體(貨號(hào)：ab32157)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-12抗體(貨號(hào)：ab140882)均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；XSP-2CA光學(xué)顯微鏡購(gòu)自上海坤誠(chéng)。

1.2方法

1.2.1模型制備及分組處理 參照文獻(xiàn)〔10〕將52只大鼠開(kāi)胸暴露心臟，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支構(gòu)建MI模型，以結(jié)扎后心前壁變白、心電圖ST段抬高視為結(jié)扎成功，術(shù)后大鼠成活視為造模成功(50只成功，2只結(jié)扎失敗死亡)。隨機(jī)分為模型組、白芨多糖低、中、高劑量組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只；另取10只大鼠，不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支作為假手術(shù)組。術(shù)后第2天開(kāi)始給藥，白芨多糖低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組〔10〕均參照文獻(xiàn)〔11〕設(shè)置劑量(白芨多糖100 mg/kg、白芨多糖200 mg/kg、白芨多糖400 mg/kg及卡托普利2.25 mg/kg)并灌胃給藥4 w，1次/d，假手術(shù)組與模型組給予等量生理鹽水。

1.2.2血清心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè) 麻醉大鼠，取頸動(dòng)脈血約2 ml，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法測(cè)CK-MB、cTnI水平。

1.2.3各組MI面積測(cè)定 隨機(jī)取6只大鼠，麻醉處死，解剖心臟，生理鹽水漂洗干凈后，沿冠狀面切成5片(厚度大致相同)，TTC染液(2%濃度)避光染色30 min(37℃水浴)后，拍照，以Image pro軟件分析檢測(cè)MI面積：MI面積=淡白色區(qū)域面積/全心臟切片面積×100%。

1.2.4各組心肌組織細(xì)胞損傷及凋亡病理染色 隨機(jī)取6只大鼠，麻醉處死，解剖得完整心臟，剪取約0.5 g心尖組織于-80℃保存?zhèn)溆?。剩余組織于多聚甲醛中固定24 h后，常規(guī)制成厚度為5 μm的石蠟切片，按HE及Tunel染色試劑盒說(shuō)明書(shū)染色處理后，在光鏡下觀察染色情況。Tunel染色的切片，于高倍顯微鏡下觀察并用Image Pro Plus5.0系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目，并計(jì)算凋亡率=陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目/(未染色細(xì)胞數(shù)目+陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)目)×100%。

1.2.5Western印跡檢測(cè) PI3K、p-AKT、GRP78、p-PERK、p-eIF2α蛋白及caspase-12蛋白相對(duì)表達(dá)水平取冰凍心肌組織，4℃解凍后，機(jī)械勻漿、分離得均漿上清液，軸提蛋白后用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)蛋白濃度，取50 μg蛋白進(jìn)行垂直電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，5%脫脂奶粉封閉2 h(室溫)及緩沖液清洗后，滴加1∶1 000稀釋的一抗(PI3K、p-AKT、GRP78、p-PERK、p-eIF2α、caspase-12)及1∶2 000稀釋的內(nèi)參(β-actin)抗體，4℃孵育過(guò)夜，滴加1∶1 000稀釋的羊抗兔二抗孵育2 h(室溫)，加入顯影液顯影，顯影系統(tǒng)曝光并拍照，Image-J軟件分析蛋白條帶的相對(duì)灰度值，以相對(duì)灰度值代表各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1白芨多糖對(duì)大鼠MI面積的影響 TTC染色可見(jiàn)模型組心肌組織淡白色染色較多，與假手術(shù)組MI面積〔(0.06±0.01)%〕比較，模型組〔(29.03±2.38)%〕白芨多糖低、中、高劑量組〔(22.12±2.24)%、(16.62±2.11)%、(10.51±2.02)%〕及陽(yáng)性對(duì)照組〔(10.08±2.00)%〕均顯著升高(均P<0.05)；與模型組比較，白芨多糖低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組MI面積均顯著降低，且白芨多糖劑量越高，MI面積降低越顯著(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組MI面積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組MI TTC染色

2.2各組心肌組織HE染色病理?yè)p傷形態(tài)觀察 假手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)完整清晰，組織無(wú)損傷；模型組心肌組織纖維變性、間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理?yè)p傷嚴(yán)重；白芨多糖劑量越高上述病理?yè)p傷緩解越明顯，白芨多糖高劑量組對(duì)心肌損傷的改善作用與陽(yáng)性對(duì)照組相近。見(jiàn)圖2。

圖2 各組心肌組織(HE染色，×100)

2.3各組心肌組織Tunel染色及細(xì)胞凋亡率比較 凋亡細(xì)胞被染成棕色，模型組心肌細(xì)胞棕色染色加深，與假手術(shù)組心肌細(xì)胞凋亡率〔(19.23±3.69)%〕比較，模型組、白芨多糖低、中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組〔(66.68±5.21)%、(50.12±5.04)%、(41.05±4.81)%、(30.61±4.02)%、(29.08±3.99)%〕均顯著上升，且白芨多糖劑量越高心肌細(xì)胞凋亡率降低越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組心肌細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組心肌組織(Tunel染色，×100)

2.4各組血清中CK-MB、cTnI水平 與假手術(shù)組比較，其余各組CK-MB、cTnI水平均顯著升高(P<0.05)。白芨多糖各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組血清CK-MB、cTnI水平均顯著低于模型組(P<0.05)，且白芨多糖劑量越高心肌損傷相關(guān)酶水平降低越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組CK-MB、cTnI水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組血清CK-MB、cTnI水平比較

2.5各組心肌組織PI3K、AKT、GRP78蛋白達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，其余各組心肌組織PI3K、p-AKT蛋白水平均顯著降低，(P<0.05)，GRP78蛋白水平均顯著上升(均P<0.05)。白芨多糖各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組PI3K、p-AKT蛋白水平均顯著高于模型組，而GRP78水平均顯著低于模型組(均P<0.05)；且白芨多糖劑量越高，PI3K、p-AKT上調(diào)及GRP78下調(diào)趨勢(shì)越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組PI3K、p-AKT、GRP78水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)圖4，表2。

1～6：假手術(shù)組、模型組、白芨多糖、低劑量組、白芨多糖中劑量組、白芨多糖高劑量組；圖5同圖4 Western印跡檢測(cè)PI3K、p-AKT/AKT、GRP78蛋白的表達(dá)

2.6各組心肌組織PERK、p-eIF2α、caspase-12其余各蛋白水平比較 與假手術(shù)組比較，其余各組心肌組織p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白水平均顯著升高(均P<0.05)；白芨多糖各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白水平均顯著低于模型組(均P<0.05)，且白芨多糖劑量越高上述蛋白降低越明顯(均P<0.05)；白芨多糖高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組PERK、p-eIF2α、caspase-12水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表2，圖5。

圖5 Western印跡檢測(cè)p-PERK、p-eIF2α、caspase-12蛋白的表達(dá)

3 討 論

MI在細(xì)胞水平的病理變化包括心肌細(xì)胞凋亡或壞死、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積等〔12〕，MI為心臟突然停止供血疾病之一，中醫(yī)治療MI常以活血化瘀為主，并取得較好的療效〔13〕。白芨多糖有促進(jìn)造血、抗炎抗菌、修復(fù)受損組織的作用〔9〕。王剛等〔14〕發(fā)現(xiàn)白芨多糖可通過(guò)抗氧化、抗炎反應(yīng)修復(fù)人受損傷的角質(zhì)細(xì)胞；李浩宇等〔11〕發(fā)現(xiàn)白芨多糖可抑制大鼠肺纖維化過(guò)程。而MI是因冠狀動(dòng)脈血管阻塞，組織缺血而發(fā)生氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)〔15〕，本研究結(jié)果提示白芨多糖可改善MI大鼠心肌細(xì)胞損傷、凋亡及組織壞死，表明白芨多糖對(duì)MI有一定的治療作用。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致心肌缺血壞死的重要機(jī)制之一，而ERS介導(dǎo)的相關(guān)凋亡途徑參與了心肌組織缺血壞死過(guò)程〔16〕。GRP78被認(rèn)為是ERS的標(biāo)志蛋白，當(dāng)機(jī)體處于ERS狀態(tài)時(shí)，過(guò)表達(dá)的GRP78可促進(jìn)PERK解離、活化，解離、活化PERK又可促進(jìn)eIF2α發(fā)生磷酸化，磷酸化的eIF2α可促使 ATF4 發(fā)生轉(zhuǎn)錄翻譯而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔17〕。蘇學(xué)旭等〔18〕發(fā)現(xiàn)芪蛭三七湯可抑制MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡，并推測(cè)其抑制MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡和心室重構(gòu)作用，可能與抑制GRP78/PERK/eIF2α信號(hào)通路激活誘導(dǎo)的ERS凋亡相關(guān)。本研究提示GRP78/PERK/eIF2α信號(hào)通路激活，MI大鼠心肌細(xì)胞嚴(yán)重，與文獻(xiàn)〔18〕研究一致，表明MI過(guò)程中，心肌組織發(fā)生ERS凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路不僅參與調(diào)控細(xì)胞炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡途徑，還參與ERS細(xì)胞凋亡過(guò)程〔8〕。崔偉等〔19〕發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過(guò)激活PI3K/AKT通路，降低GRP78及caspase-12表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞ERS，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷；陽(yáng)光等〔20〕發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路在肝纖維化大鼠肝細(xì)胞ERS和凋亡過(guò)程發(fā)揮重要作用；Liu等〔7〕發(fā)現(xiàn)GRP78與PI3K/AKT之間存在雙向調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果表明白芨多糖改善MI大鼠心肌細(xì)胞凋亡壞死作用，可能是通過(guò)激活PI3K/AKT通路，抑制GRP78/PERK/eIF2α信號(hào)通路蛋白表達(dá)，降低心肌細(xì)胞ERS凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。綜上，白芨多糖可激活PI3K/AKT通路，抑制GRP78/PERK/eIF2α信號(hào)通路蛋白表達(dá)，降低心肌細(xì)胞ERS凋亡，改善MI大鼠心肌壞死。為白芨多糖在MI領(lǐng)域的治療提供一定依據(jù)。但MI心肌細(xì)胞ERS凋亡途徑復(fù)雜，涉及多個(gè)因子多條通路共同調(diào)節(jié)，白芨多糖對(duì)PI3K/AKT及GRP78/PERK/eIF2α信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，還應(yīng)設(shè)置通路抑制劑進(jìn)行深入驗(yàn)證。