趙燕妮， 張 坤， 許牡丹， 雷 靖, 劉 歡,劉 寧, 陳雪峰, 張 迪

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院, 陜西 西安 710021; 3.陜西省農(nóng)村科技開(kāi)發(fā)中心 陜西省獼猴桃工程技術(shù)研究中心, 陜西 西安 710054)

0 引言

獼猴桃，屬獼猴桃科(Actinidiaceae)、獼猴桃屬(Actinidia)，是一種藥食兩用的鮮香可口水果，富含豐富的膳食纖維、微量元素、有機(jī)酸、多糖、胡蘿卜素、葉黃素、酚類、葉綠素、黃酮類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，素有“水果之王”、“維C之冠”的美稱，具有抗氧化、抗輻射、抗衰老、增強(qiáng)人體免疫力等功效，深受消費(fèi)者喜愛(ài).我國(guó)是獼猴桃的發(fā)源地，目前我國(guó)獼猴桃種植面積和產(chǎn)量均居世界第一.獼猴桃資源種類繁多，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界獼猴桃屬植物共有54個(gè)種21個(gè)變種，75個(gè)分類單元[1-5].其中海沃德(Hayward)獼猴桃作為新西蘭高檔獼猴桃主栽品種之一，有濃厚的清香味和較高含量的糖類化合物[6]，其最大特點(diǎn)是果型美、品質(zhì)優(yōu)、耐貯藏、貨架期長(zhǎng)；徐香獼猴桃是我國(guó)陜西省眉縣獼猴桃主栽品種之一，香味濃厚，酸甜可口，是繼海沃德之后最具市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的世界獼猴桃優(yōu)勢(shì)品種之一；啞特獼猴桃是我國(guó)陜西省周至縣主栽獼猴桃品種之一，果肉碧綠、肉質(zhì)細(xì)膩，具有抗衰老、排毒嫩膚等功效.

化學(xué)成分是構(gòu)成和影響果品風(fēng)味特征的物質(zhì)基礎(chǔ).目前，有關(guān)不同品種獼猴桃果實(shí)的化學(xué)成分差異的研究大多局限于常規(guī)成分的分析，如蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、纖維素、維生素、微量元素和灰分等[7-9]，缺乏對(duì)不同品種獼猴桃果實(shí)化學(xué)成分差異的全面系統(tǒng)研究.代謝組學(xué)作為新興的組學(xué)技術(shù)之一，可準(zhǔn)確高效地定性、定量地分析生物體內(nèi)小分子化合物受品種、環(huán)境等影響的變化，廣泛應(yīng)用于食品、植物、微生物等研究領(lǐng)域[10-18].目前，基于代謝組學(xué)技術(shù)的獼猴桃品質(zhì)特征及化學(xué)成分的研究已成為獼猴桃研究的熱點(diǎn)之一.

Capitani等[19]基于核磁共振(NMR)的代謝組學(xué)方法對(duì)獼猴桃果肉的代謝特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)8月份采摘獲得的獼猴桃果實(shí)中蘋果酸和檸檬酸含量最高，采摘時(shí)間越晚，越有利于糖類化合物的累積.Lim等[20]基于GC-MS代謝組學(xué)方法研究了“Jecy”綠色獼猴桃在自然成熟(NR)和乙烯誘導(dǎo)成熟(ER)下的差異代謝物，發(fā)現(xiàn)獼猴桃成熟過(guò)程中NR果實(shí)中蔗糖、肌醇、檸檬酸和蘋果酸含量顯著高于ER果實(shí)，而ER果實(shí)中果糖、葡萄糖和奎寧酸含量顯著高于NR果實(shí).

綜上所述，目前關(guān)于獼猴桃果實(shí)化學(xué)成分的研究主要集中在常規(guī)化學(xué)成分的分析，如蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物等.獼猴桃代謝組學(xué)的研究也主要關(guān)注貯藏方法、貯藏時(shí)間等對(duì)獼猴桃品質(zhì)影響的研究，而采用代謝組學(xué)技術(shù)分析不同獼猴桃品種間化學(xué)成分差異的系統(tǒng)研究較少.本文以陜西省三個(gè)主栽獼猴桃品種(海沃德、徐香、啞特)的果實(shí)為研究對(duì)象，采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法對(duì)不同品種獼猴桃果實(shí)的代謝輪廓進(jìn)行分析，揭示不同品種的代謝特征.本研究可為獼猴桃品種品質(zhì)的評(píng)價(jià)及綜合利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用八成熟獼猴桃(海沃德、徐香、啞特)于2018年10月采自陜西省周至縣陜西佰瑞獼猴桃研究院.獼猴桃采摘當(dāng)天快速低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，立即去皮、去籽、破碎后，置于冷凍干燥機(jī)干燥成粉，隨后存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱備用.

甲醇，Merck公司；2-巰基吡啶、甲胺鹽酸鹽及N-甲基-N-(三甲基硅)三氟乙酰胺(MSTFA)，Sigma-aldrich公司，均為色譜級(jí).

1.2 主要儀器

Trace 1300-ISQ GC/MS，賽默飛世爾科技有限公司；JA2003型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；HWS-24型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；移液器及5424R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；SIM FD5-series冷凍干燥機(jī)，美國(guó)西盟公司；VORTEX-5渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)其他儀器.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

稱取100 mg獼猴桃干粉，加入1.5 mL的80%甲醇水混合溶液，渦旋振蕩5 min，14 000 rpm下離心10 min，靜止2 min，取上清液500μL凍干.凍干樣加入100μL甲氧胺鹽酸鹽-吡啶溶液(20 mg/mL)，渦旋3 min至樣液混勻，在37 ℃水浴衍生90 min，10 000 rpm離心5 min后，加入50μL MSTFA，37 ℃水浴衍生60 min.取120μL上清液待測(cè).

1.3.2 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 MS(30 m×250μm×0.25μm，J&W Scientific，F(xiàn)olsom，CA)；載氣為氦氣，采用恒流模式，線速度40.0 cm/s，分流比10∶1；程序升溫條件：70 ℃保持3 min，以5 ℃/min速度升至300 ℃，保持10 min.進(jìn)樣口和傳輸線溫度分別為300 ℃和250 ℃.

質(zhì)譜條件：溶劑切割時(shí)間為5.5 min，離子源溫度為230 ℃，EI能量為70 eV，全掃質(zhì)量掃描范圍：33～600(m/z),掃描周期(Even time)為0.2 s.

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Xcalibur(version 4.0，Thermo，USA)軟件中轉(zhuǎn)化成CDF格式，隨后導(dǎo)入XCMS程序進(jìn)行濾噪，保留時(shí)間對(duì)齊，色譜峰檢測(cè)及匹配等，獲得定量表.通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)(如NIST、Fiehn、Wiley等)匹配進(jìn)行初步定性分析，然后利用標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn).

采用SIMCA 14.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘判別分析(PLS-DA)；t檢驗(yàn)用于篩選差異代謝物(p<0.05)；聚類分析由MeV 4.8.1軟件完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 基于GC-MS的獼猴桃果實(shí)內(nèi)含成分分析

獼猴桃果實(shí)經(jīng)去皮、去籽、打漿冷凍干燥成粉、衍生化后進(jìn)行GC-MS分析.GC-MS分析的獼猴桃果實(shí)的總離子流色譜圖如圖1所示.

圖1 基于GC-MS獼猴桃化合物總離子流色譜圖(以QC樣為例)

通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索(如NIST、Mainlib等)及標(biāo)樣驗(yàn)證對(duì)獼猴桃果實(shí)中的代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，共定性出76個(gè)代謝物，其中66個(gè)代謝物經(jīng)過(guò)了標(biāo)樣驗(yàn)證，主要包括糖類26個(gè)，脂肪酸7個(gè)，有機(jī)酸11個(gè)，氨基酸19個(gè)等.其中氨基酸類主要包括纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸等；糖類包括核糖、果糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等；有機(jī)酸類包括阿魏酸、丙酮酸、乳酸等；脂肪酸包括棕櫚酸、亞油酸、α-亞麻酸等，如圖2所示.

圖2 代謝物個(gè)數(shù)和百分比分布圖

2.2 基于GC-MS的不同獼猴桃果實(shí)化學(xué)成分差異分析

為了監(jiān)控樣品分析過(guò)程中的系統(tǒng)穩(wěn)定性，將質(zhì)量控制樣品(QC)均勻插入到分析序列中，通過(guò)XCMS對(duì)QC樣品代謝產(chǎn)物進(jìn)行峰匹配，獲得峰表.計(jì)算歸一化峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如圖3所示，85%的代謝產(chǎn)物的RSD小于30%，累積占總峰面積的93%.結(jié)果表明該分析過(guò)程穩(wěn)定良好，數(shù)據(jù)可靠，滿足代謝組學(xué)樣品分析要求.

圖3 QC樣品中代謝物的RSD分布圖(藍(lán)色柱形圖和紅色折線分別表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差占總峰個(gè)數(shù)的百分比和峰面積累計(jì)值所占的百分比)

為了研究不同品種獼猴桃果實(shí)的化學(xué)差異性，將3個(gè)品種的獼猴桃果實(shí)的代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行總峰面積歸一化后，導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)(如圖4所示).從圖4中可以看出,不同品種獼猴桃樣品處于95%的置信區(qū)間內(nèi)(Hotelling T2的橢圓內(nèi))，說(shuō)明樣品中不存在異常值.PLS-DA分析發(fā)現(xiàn)啞特與其他兩個(gè)品種(徐香和海沃德)在第一個(gè)PLS主成分上具有明顯分離趨勢(shì)，徐香和海沃德在第二個(gè)PLS主成分上具有明顯分離趨勢(shì).

圖4 不同獼猴桃品種樣本的PLS-DA得分圖

為了尋找與品種密切相關(guān)的重要化合物，將任意兩個(gè)品種進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明三組之間兩兩比較共有20個(gè)差異化合物，其中主要包括碳水化合物、脂肪酸和有機(jī)酸等.具體結(jié)果如表1所示.

表1 不同品種間鑒定的差異化合物

對(duì)20種差異化合物進(jìn)行皮爾森相關(guān)系數(shù)的聚類分析(HCA)，結(jié)果如圖5所示.根據(jù)差異代謝物的聚類情況，代謝物可直觀地分為3組.具體來(lái)說(shuō)，A組的大多數(shù)代謝物在徐香中含量最低，主要包括單糖(如葡萄糖、半乳糖、果糖等)和TCA循環(huán)中間體(如異檸檬酸)等.B組和C組的化合物在徐香中含量最高，主要包括二糖(如纖維二糖、海藻糖、麥芽糖)和氨基酸(如丙酮酸、天冬氨酸等)等.

圖5 差異化合物的熱圖分析

為了進(jìn)一步了解不同獼猴桃品種間的代謝途徑差異，通過(guò)MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行代謝途徑分析，結(jié)果如圖6所示，三個(gè)不同品種的獼猴桃果實(shí)主要差異化合物涉及到亞油酸代謝通路、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝、甘油脂代謝、TCA循環(huán)、淀粉和蔗糖代謝和磷酸肌醇代謝等途徑.

圖6 差異化合物的代謝通路富集分析

有機(jī)酸是影響果實(shí)風(fēng)味的主要因素之一，獼猴桃果實(shí)富含多種有機(jī)酸(如蘋果酸、檸檬酸、抗壞血酸等).蘋果酸為天然果汁的重要成份，酸味清爽可口，并有果味的香甜，味道柔和.本研究發(fā)現(xiàn)大部分有機(jī)酸(蘋果酸、丙酮酸、甘油酸)在徐香中含量最高，啞特中含量最低，這提示著徐香的酸味最明顯(圖7).抗壞血酸又稱為維生素C，廣泛存在于新鮮果實(shí)和蔬菜中，能結(jié)合氧而成為除氧劑，可以抑制果蔬的酶促褐變、防止變色、風(fēng)味變壞等問(wèn)題.本研究中啞特中含有較高的抗壞血酸，可有效保持果實(shí)的新鮮香味.

圖7 獼猴桃中差異化合物相對(duì)含量變化情況(藍(lán)色、綠色、黃色和紅色分別代表有機(jī)酸類、單糖類、雙糖類、氨基酸類；*、**、***分別代表0.01

獼猴桃的糖類化合物包括單糖、雙糖及聚合物，含量約為8%～14%，其組分及含量決定了果實(shí)甜味、粘度[21,22].單糖中果糖的甜度是蔗糖的1.8倍，是所有天然糖中甜度最高的糖之一；在相同濃度下雙糖相對(duì)于單糖粘度較高，部分雙糖(麥芽糖、海藻糖)甜度低.本研究中雙糖(如纖維二糖、麥芽糖、海藻糖等)在徐香中含量高于其他兩個(gè)品種，單糖(如果糖、半乳糖等)在徐香中含量最低，而在海沃德中含量較高(圖7)，這提示本研究中海沃德的甜味更佳，徐香粘度較高.這與李躍紅等[23]研究結(jié)果一致.

獼猴桃富含亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、丙氨酸等多種氨基酸，其中天冬氨酸和丙氨酸被稱為呈味氨基酸，天冬氨酸呈鮮味、丙氨酸呈甜味[24].本研究發(fā)現(xiàn)呈味氨基酸(天冬氨酸和丙氨酸)在徐香中含量最高(圖7)，這在一定程度上表明徐香果實(shí)味道更鮮美.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用基于GC-MS代謝組學(xué)方法對(duì)徐香、啞特和海沃德三個(gè)品種的獼猴桃果實(shí)的化學(xué)成分差異進(jìn)行研究，通過(guò)峰匹配、濾噪，保留時(shí)間對(duì)齊，色譜峰檢測(cè)及匹配等，獲得定量表.通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索(如NIST、Mainlib等)及標(biāo)樣驗(yàn)證共定性出76個(gè)物質(zhì)，其中66個(gè)物質(zhì)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證，定性出的物質(zhì)主要包括糖、脂肪酸、有機(jī)酸、氨基酸等.多變量分析表明不同品種獼猴桃的差異較為顯著，其中啞特與其他兩個(gè)品種(徐香和海沃德)在主成分一上具有明顯分離趨勢(shì)，徐香和海沃德在第二主成分上具有明顯分離趨勢(shì).單變量分析獲取三個(gè)品種獼猴桃間的差異化合物，研究發(fā)現(xiàn)海沃德中單糖(如葡萄糖、果糖、半乳糖等)含量最高，表明海沃德甜味更佳；徐香中雙糖、有機(jī)酸、TCA循環(huán)中間體和氨基酸含量最高，表明徐香粘度高，風(fēng)味更佳；啞特中抗壞血酸含量最高，可有效保持果實(shí)的新鮮香味.