孔 陽， 閆 輝， 許 江， 馬 超， 王麗紅

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.安康市振興實(shí)業(yè)有限公司， 陜西 安康 725000)

0 引言

獨(dú)活別名玉活、獨(dú)滑、長(zhǎng)生草等[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[2].獨(dú)活品種繁多，我國(guó)各地及日本、韓國(guó)、朝鮮等東南亞國(guó)家有70余種植物當(dāng)作獨(dú)活使用[3].《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，獨(dú)活正品為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸AngelicapubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan的干燥根，主產(chǎn)于四川、湖北、陜西、安徽等地[4].獨(dú)活的化學(xué)成分有香豆素類、揮發(fā)油類和植物甾醇等多種化合物[2-5]，在獨(dú)活的香豆素類中蛇床子素含量最高[6].現(xiàn)代藥理研究表明，獨(dú)活具有抗炎、鎮(zhèn)靜催眠、降壓、抗心律失常、抗凝血、抗腫瘤等藥理活性[4,7]，其中部分藥理活性與獨(dú)活中含大量香豆素類化合物有關(guān)[8].

蛇床子素又名歐芹酚甲醚、甲氧基歐芹酚，化學(xué)名稱為7-甲氧基-8異戊烯基香豆素[9].蛇床子素具有抗骨質(zhì)疏松癥[9-11]、抗炎[12,13]、抗氧化[14]、抗腫瘤[15]、抗凝血[16]等藥理活性.蛇床子素全合成和半合成工藝不成熟，江東新[17]以7-羥基香豆素為起始原料探索出2條合成蛇床子素的路線,但合成效率低，合成難度大.

獨(dú)活是陜西省安康市的道地藥材，產(chǎn)量高質(zhì)量好，但是深加工水平很低，僅以原藥材出售，經(jīng)濟(jì)效益差.《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定獨(dú)活的主要鑒別成分為蛇床子素，其含量不低于0.50%[4].但是目前，關(guān)于獨(dú)活中蛇床子素的提取工藝報(bào)道不多，趙美榮[18]分別用微波輔助法和纖維素酶法從獨(dú)活中提取蛇床子素，最佳提取得率分別為1.03%和0.926%.陳慧等[6]對(duì)獨(dú)活中蛇床子素的超聲輔助提取工藝進(jìn)行了研究，最佳條件下得率為0.987%.然而超聲和微波很難運(yùn)用于工業(yè)化生產(chǎn)，纖維素酶法提取雜質(zhì)較多，后續(xù)分離純化工藝復(fù)雜.

因此本文選用陜西安康鎮(zhèn)坪縣產(chǎn)的正品獨(dú)活重齒毛當(dāng)歸為原料，對(duì)其提取和大孔吸附樹脂分離純化工藝作了研究，以期為中藥獨(dú)活的高產(chǎn)值綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

獨(dú)活藥材由陜西利康制藥有限公司提供，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定為AngelicapubescensMaxim.f.biserrataShan et Yuan.

蛇床子素(標(biāo)準(zhǔn)品)，上海麥克林生化科技有限公司；甲醇(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯(分析純)，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；甲醇(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑廠；大孔吸附樹脂(D101、AB-8、LSA-10、LSA-21、LSA-40)，西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，美國(guó) Waterse2695；SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-250DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BS2202S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；B-220恒溫水浴鍋，上海亞榮生化儀器廠；UV-5100紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；TS-100C臺(tái)式恒溫?fù)u床，上海百典儀器設(shè)備有限公司；DZF-6050真空干燥箱，上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取分離純化流程

獨(dú)活→發(fā)汗→粉碎過篩→乙醇提取→乙酸乙脂萃取→大孔吸附樹脂分離純化→計(jì)算蛇床子素含量.

1.3.2 蛇床子素含量測(cè)定

按照文獻(xiàn)[19]的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蛇床子素質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)、吸光度Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蛇床子素線性回歸方程為：

Y=61.336 7X+0.259 82R2=0.999 47

(1)

(2)

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)考察料液比對(duì)蛇床子素得率的影響

固定提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min、乙醇濃度60%，按照1.3.1的方法，分別考察料液比為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30時(shí)對(duì)蛇床子素得率的影響.

(2)考察提取溫度對(duì)蛇床子素得率的影響

固定料液比1∶20、提取時(shí)間60 min、乙醇濃度60%，按照1.3.1的方法，分別考察提取溫度30 ℃、60 ℃、75 ℃、90 ℃時(shí)對(duì)蛇床子素得率的影響.

(3)考察提取時(shí)間對(duì)蛇床子素得率的影響

固定料液比1∶20、提取溫度60 ℃、乙醇濃度60%，按照1.3.1的方法，分別考察提取時(shí)間30 min、45 min、60 min、90 min時(shí)對(duì)蛇床子素得率的影響.

(4)考察乙醇濃度對(duì)蛇床子素得率的影響

固定料液比1∶20、提取時(shí)間60 min、提取溫度60 ℃，按照1.3.1的方法，分別考察乙醇濃度50%、60%、70%、90%時(shí)對(duì)蛇床子素得率的影響.

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)為自變量，以蛇床子素得率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示.

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)表

1.3.5 大孔吸附樹脂純化工藝

(1)大孔吸附樹脂篩選

分別稱取2 g經(jīng)過預(yù)處理的D101、AB-8、LSA-10、LSA-21、LSA-40于具塞錐形瓶中，分別加入40 mL 2.0 mg/mL獨(dú)活浸膏溶液，35 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附12 h，過濾，測(cè)定蛇床子素濃度.吸附飽和樹脂經(jīng)純凈水洗凈后，加入100 mL 60%乙醇，相同條件下振蕩解吸12 h，測(cè)定解吸前后溶液中蛇床子素濃度，按照下列公式[20]計(jì)算比吸附量(Q)、吸附率(E)和解吸率(D).

(3)

(4)

(5)

式(3)～(5)中：C0、C1為吸附前、后溶液中蛇床子素的質(zhì)量濃度，mg/mL；C2為解吸液中蛇床子素的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為獨(dú)活浸膏溶液的體積，mL；V2為60%乙醇溶液的體積，mL；m為大孔樹脂的質(zhì)量，g.

(2)上樣質(zhì)量濃度考察

稱取3份各2 g預(yù)處理過的LSA-21樹脂于具塞錐形瓶中，分別加入40 mL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、3.0 mg/mL的獨(dú)活浸膏溶液，35 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩吸附6 h，計(jì)算大孔樹脂的吸附率，考察上樣質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響.

(3)解吸液乙醇濃度考察

稱取5份各2 g吸附飽和的LSA-21樹脂于具塞錐形瓶中，分別加入100 mL濃度為20%、40%、60%、80%、99.7%乙醇溶液，35 ℃下以200 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩解吸6 h，計(jì)算大孔樹脂的解吸率，考察乙醇濃度對(duì)解吸率的影響.

(4)泄漏曲線

稱取2.5 g預(yù)處理過的LSA-21型大孔吸附樹脂，濕法裝柱，將質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL獨(dú)活浸膏溶液分別以7.5 mL/min、3.75 mL/min、2.5 mL/min的流速上樣.分段收集流出液，測(cè)定蛇床子素含量，繪制泄漏曲線.當(dāng)流出液質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液質(zhì)量濃度的10%時(shí)，為大孔吸附樹脂的泄漏點(diǎn)，當(dāng)流出液質(zhì)量濃度達(dá)到上樣液質(zhì)量濃度的100%時(shí)，為大孔吸附樹脂的飽和吸附點(diǎn)[21].

(5)洗脫曲線

根據(jù)得到的最佳流速上樣吸附，吸附完成后，用純凈水沖洗樹脂至表面無獨(dú)活浸膏溶液，再用60%的乙醇，分別以流速為7.5 mL/min、3.75 mL/min、2.5 mL/min進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫，分段收集流出液，測(cè)定蛇床子素含量，繪制洗脫曲線.

(6)純化工藝驗(yàn)證

對(duì)最佳純化工藝的實(shí)驗(yàn)效果進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)已經(jīng)優(yōu)選的最佳純化參數(shù)對(duì)獨(dú)活粗提物進(jìn)行大孔樹脂吸附與解吸附，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，然后通過高效液相色譜進(jìn)行純度檢測(cè).色譜條件是固定相C18，流動(dòng)相為甲醇∶水=80∶20，柱溫35 ℃，流速1 mL/min.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)蛇床子素得率的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比為1∶15時(shí)得率達(dá)到最大值1.62%，因?yàn)榱弦罕仍龃髸r(shí)溶劑和藥材中蛇床子素濃度差逐漸增大，因此蛇床子素得率增加.但是隨著料液比的繼續(xù)增加，得率反而降低，這是因?yàn)槠渌s質(zhì)也更加容易被提取出來，從而使蛇床子素得率降低.再綜合考慮經(jīng)濟(jì)效益，最終確定蛇床子素提取的料液比為1∶15.

圖1 料液比對(duì)蛇床子素得率的影響

2.1.2 提取溫度對(duì)蛇床子素得率的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高蛇床子素得率先增加后減小，當(dāng)溫度為75 ℃時(shí)達(dá)到最大值1.61%.隨著溫度的增加，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，加速細(xì)胞壁破裂，增加蛇床子素?cái)U(kuò)散速度，使蛇床子素得率增加.但是當(dāng)同溫度大于75 ℃時(shí)，得率逐漸降低，因?yàn)殡S著溫度升高耐熱性雜質(zhì)溶出量逐漸增加，并且過高的溫度會(huì)導(dǎo)致蛇床子素分解致使得率降低，因此確定最好的提取溫度為75 ℃.

圖2 提取溫度對(duì)蛇床子素得率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)蛇床子素得率的影響

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，蛇床子素的得率顯著增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，得率高達(dá)1.47%，60 min之后，蛇床子素的溶出達(dá)到平衡，繼續(xù)增加提取時(shí)間對(duì)提高蛇床子素的得率無明顯作用，還會(huì)因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間高溫加熱導(dǎo)致雜質(zhì)的增加及少量蛇床子素分解破壞，從而使得率略降.再綜合考慮生產(chǎn)效率和成本，確定最佳提取時(shí)間為60 min.

圖3 提取時(shí)間對(duì)蛇床子素得率的影響

2.1.4 乙醇濃度對(duì)蛇床子素得率的影響

由圖4可知，隨著乙醇濃度的增加，蛇床子素得率先增加后減小，濃度為60%時(shí)得率達(dá)最大值1.46%.隨著乙醇濃度繼續(xù)升高，脂溶性雜質(zhì)的溶出也隨之增加，使后續(xù)的分離純化工藝也更復(fù)雜，而蛇床子素的得率卻顯著降低.并且，高濃度乙醇提取會(huì)增加生產(chǎn)的成本，綜合考慮確定最佳的乙醇濃度為60%.

圖4 乙醇濃度對(duì)蛇床子素得率的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)為自變量，以蛇床子素得率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，分析方案及結(jié)果如表2所示.以A、B、C為自變量，以Y為響應(yīng)值得二次回歸方程模型為：

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

由表3可知，回歸模型P<0.01，失擬檢驗(yàn)P>0.05，表明模型顯著.決定系數(shù)R2=0.940 5，說明該模型能夠解釋94.05%的響應(yīng)值變化.模型一次項(xiàng)中料液比(A)和提取溫度(C)對(duì)蛇床子素得率的線性效應(yīng)為差異高度顯著P<0.01，提取時(shí)間(B)對(duì)蛇床子素得率的線性效應(yīng)為差異顯著P<0.05，F(xiàn)A=52.83，F(xiàn)B=9.10，F(xiàn)C=26.60，即各因素對(duì)蛇床子素得率的影響程度大小為料液比(A)>提取溫度(C)>提取時(shí)間(B).模型二次項(xiàng)中A2和B2對(duì)蛇床子素得率的影響為差異顯著P<0.05，C2對(duì)蛇床子素得率的影響為不顯著.模型交互項(xiàng)對(duì)蛇床子素得率的影響都不顯著.

表3 響應(yīng)面方差分析表

圖5為根據(jù)回歸方程所作響應(yīng)面圖.三個(gè)響應(yīng)曲面圖(5(a)、5(c)、5(e))的開口均向下，有極值，曲面較彎曲，顯著性較強(qiáng)，等高線圖中，料液比和提取時(shí)間交互作用較弱，料液比和提取溫度交互作用較強(qiáng)，提取時(shí)間和提取溫度交互作用也較強(qiáng).根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化得到最優(yōu)條件為料液比1∶10、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間58 min，預(yù)測(cè)得率1.745%.以最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得的實(shí)際得率為1.754%，與預(yù)測(cè)值僅相差0.009%，證明響應(yīng)面法優(yōu)化的最佳提取工藝條件合理可靠.

(a)料液比與提取時(shí)間響應(yīng)曲面圖

(b)料液比與提取時(shí)間等高線圖

(c)料液比與提取溫度響應(yīng)曲面圖

(d)料液比與提取溫度等高線圖

(e)提取時(shí)間與提取溫度響應(yīng)曲面圖

(f)提取時(shí)間與提取溫度等高線圖圖5 各因素交互作用響應(yīng)曲面和等高線圖

2.3 大孔吸附樹脂分離純化

2.3.1 樹脂類型篩選結(jié)果

以吸附量和解吸率為指標(biāo)，篩選最佳的純化蛇床子的大孔樹脂類型.結(jié)果由表4所示，LSA-21型大孔樹脂的比吸附量為27.41 mg/g、吸附率為99.13%，解吸率達(dá)到91.89%，在5種樹脂中都最高，因此選擇該樹脂分離純化獨(dú)活中蛇床子素.

表4 大孔吸附樹脂吸附與解吸結(jié)果表

2.3.2 質(zhì)量濃度對(duì)LSA-21樹脂靜態(tài)吸附的影響

如圖6所示，吸附率隨著上樣濃度的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL時(shí)，吸附率最高.之后繼續(xù)升高上樣濃度，吸附率反而下降，原因可能是由于質(zhì)量濃度太高，溶液粘度大，影響分子擴(kuò)散，或者樹脂過飽和之后發(fā)生泄漏，從而使吸附率下降，因此LSA-21樹脂分離獨(dú)活中蛇床子素的最適上樣質(zhì)量濃度為2 mg/mL.

圖6 質(zhì)量濃度對(duì)吸附率的影響

2.3.3 乙醇濃度對(duì)LSA-21樹脂靜態(tài)解吸的影響

如圖7所示，乙醇濃度為60%時(shí)，解吸率最高.當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)，不足以讓蛇床子素洗脫下來，當(dāng)乙醇濃度較高時(shí)，部分吸附雜質(zhì)也會(huì)競(jìng)爭(zhēng)脫附，同時(shí)濃度過大時(shí)還會(huì)引起解吸液中一些大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)等的溶解度減小而使沉淀析出[20]，進(jìn)而阻礙蛇床子素分子的擴(kuò)散，因此選擇解吸乙醇濃度為60%.

圖7 乙醇濃度對(duì)解吸率的影響

2.3.4 上樣流速對(duì)LSA-21樹脂動(dòng)態(tài)吸附的影響

如圖8所示，隨著流速的增加，大孔吸附樹脂泄漏點(diǎn)和飽和點(diǎn)都提前出現(xiàn).當(dāng)上樣流速分別為7.5 mL/min、3.75 mL/min、2.5 mL/min時(shí)，大孔吸附樹脂所對(duì)應(yīng)的上樣體積為10 mL、20 mL、60 mL，大孔吸附樹脂所對(duì)應(yīng)的飽和吸附點(diǎn)則分別為220 mL、240 mL、260 mL，為了保證能夠使上樣液中蛇床子素被大孔吸附樹脂盡可能吸附完全，確定上樣的最佳流速為2.5 mL/min，上樣液體積為3 BV.

圖8 泄漏曲線圖

2.3.5 洗脫流速對(duì)LSA-21樹脂動(dòng)態(tài)解吸的影響

如圖9所示，隨著流速的增加，洗脫曲線出峰時(shí)間提前，洗脫液體積消耗也相應(yīng)增加.當(dāng)洗脫流速為2.5 mL/min時(shí)，洗脫曲線對(duì)稱性較好，洗脫液體積較少，能夠?qū)ι叽沧铀剡M(jìn)行集中洗脫，因此確定最佳洗脫流速為2.5 mL/min，洗脫液用量為14 BV.

圖9 洗脫曲線圖

2.3.6 工藝驗(yàn)證

采用高效液相色譜對(duì)最佳分離純化工藝進(jìn)行驗(yàn)證.首先以上樣質(zhì)量濃度2.0 mg/mL、上樣體積3 BV、上樣流速2.5 mL/min、解吸液中乙醇濃度60%、洗脫流速2.5 mL/min、洗脫體積14 BV，對(duì)獨(dú)活浸膏溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附解吸，經(jīng)過一次LSA-21樹脂純化后，通過高效液相色譜進(jìn)行純度檢測(cè).檢測(cè)結(jié)果如圖10所示，蛇床子素在6.00～8.00 min位置出峰，與未經(jīng)純化的提取液相比蛇床子素的含量由2.51%提高到28.76%，提高了約12倍.表明在上述的工藝條件下，LSA-21型大孔吸附樹脂對(duì)獨(dú)活的富集純化效果穩(wěn)定，較適合工業(yè)化生產(chǎn).

(a)蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

(b)大孔樹脂純化前色譜圖

(c)大孔樹脂純化后色譜圖圖10 高效液相色譜含量檢測(cè)圖

3 結(jié)論

本文首先通過單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化了提取工藝，得到最優(yōu)提取條件為料液比1∶10、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間58 min，該條件下得率為1.754%.再對(duì)LSA-21型大孔吸附樹脂分離純化獨(dú)活中蛇床子素的工藝條件進(jìn)行了研究，得到最佳工藝為上樣質(zhì)量濃度2.0 mg/mL，上樣體積3 BV，上樣流速2.5 mL/min，解吸液中乙醇濃度60%，洗脫流速2.5 mL/min，洗脫體積14 BV，此時(shí)提取液中蛇床子素含量由2.51%提高到28.76%，提高了約12倍，表明LSA-21型大孔吸附樹脂在上述條件下能夠大量的富集和純化中藥獨(dú)活中的蛇床子素.

該工藝方法簡(jiǎn)單易操作，蛇床子素的得率和純度都有較明顯的提高.同時(shí)，工藝方案中有機(jī)溶劑用量很少且可以回收利用，溶劑對(duì)生產(chǎn)設(shè)備腐蝕性小要求低，篩選出的LSA-21型大孔樹脂吸附量大、解吸率好、可反復(fù)使用，從而降低生產(chǎn)成本，整套工藝綠色環(huán)保，適合工業(yè)化生產(chǎn).

陜西省安康市鎮(zhèn)坪縣是國(guó)家工信部確定的獨(dú)活種苗繁育及規(guī)范化種植基地.獨(dú)活是鎮(zhèn)坪的道地藥材，產(chǎn)量高質(zhì)量好，但是深加工水平很低，僅以原藥材出售，經(jīng)濟(jì)效益差.本研究結(jié)果為擴(kuò)大陜西獨(dú)活規(guī)范化栽培，提升改進(jìn)陜西安康地區(qū)藥廠生產(chǎn)蛇床子素的工藝，促進(jìn)陜西秦巴山區(qū)中藥材深加工和提高經(jīng)濟(jì)效益都有著重要意義，為獨(dú)活高產(chǎn)值綜合利用提供了理論依據(jù).