王丹鳳吳玉姝翁甜欣王 璐劉 敏

(1.聊城大學(xué)生物制藥研究院,山東 聊城 252059;2.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,山東 聊城 252059)

DNA 作為一種天然的生物大分子,其堿基配對(duì)原則及獨(dú)特的雙螺旋結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)使得我們能夠?qū)x定的DNA 序列進(jìn)行編輯、修飾等操作。20世紀(jì)80年代,Seeman教授[1]首次提出基于GC/AT 堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理,DNA 可以作為一種新的工具來(lái)構(gòu)建納米結(jié)構(gòu),并設(shè)計(jì)了十字叉狀的雙鏈DNA 結(jié)構(gòu)(圖1),從此開創(chuàng)了結(jié)構(gòu)DNA 納米技術(shù)這一新領(lǐng)域。這使得DNA 從傳統(tǒng)的基因圖譜被拓展成為建筑模塊,用于構(gòu)建特定形狀及功能的納米結(jié)構(gòu)。目前用于構(gòu)建DNA 納米結(jié)構(gòu)的兩種主要方法為模塊結(jié)構(gòu)組裝和DNA 折紙技術(shù)。相比于模塊結(jié)構(gòu)組裝方法,后來(lái)出現(xiàn)的DNA 折紙技術(shù)降低了制作納米結(jié)構(gòu)的難度,并能夠構(gòu)建出復(fù)雜且形狀多樣的結(jié)構(gòu)。以DNA 單鏈為模板自組裝形成的DNA 納米結(jié)構(gòu)已經(jīng)從簡(jiǎn)單的雙鏈發(fā)展到四面體、折紙結(jié)構(gòu)、立體籠狀等三維立體以及更復(fù)雜的結(jié)構(gòu),從靜態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)展到動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),被廣泛應(yīng)用于藥物運(yùn)輸、外科手術(shù)、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域。

圖1 Seeman教授構(gòu)建的十字叉狀DNA 納米結(jié)構(gòu)[1]

與雙螺旋DNA 相比,由于固定的Holliday連接的存在,DNA 納米結(jié)構(gòu)具有更復(fù)雜的剛性結(jié)構(gòu)。它的可控性以及基于堿基互補(bǔ)配對(duì)的自組裝特點(diǎn),使其成為一種具有潛力的載體材料,并且在載藥方面表現(xiàn)出較其他納米材料的優(yōu)越性。研究人員將具有靶向性的適體雜交到DNA 納米結(jié)構(gòu)上或設(shè)計(jì)到DNA 鏈中以實(shí)現(xiàn)靶向功能。在作為藥物遞送載體應(yīng)用于癌癥治療時(shí),DNA 納米結(jié)構(gòu)因具有良好的靶向性、特定的尺寸大小、易于化學(xué)修飾和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn),能夠提高抗癌藥物的溶解度、體內(nèi)穩(wěn)定性和腫瘤治療效果[2]。目前化學(xué)藥物、基因藥物、光敏劑以及輔助免疫藥物是研究較多的抗癌藥物,但是傳統(tǒng)的藥物治療存在許多缺陷,比如產(chǎn)生全身細(xì)胞毒性及藥物療效不理想等。使用DNA 納米結(jié)構(gòu)運(yùn)載抗癌藥物,可攜帶藥物分子靶向至病變部位,提高對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力[3],抵抗藥物被血清中的酶降解,克服癌細(xì)胞的多藥耐藥性,降低藥物的毒副作用[4]。小分子藥物、小干擾RNA(siRNA)、免疫刺激寡核苷酸CpG、光敏劑和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)已成功地通過(guò)DNA 納米載體遞送到細(xì)胞內(nèi),并表現(xiàn)出良好的治療效果[5]。此外,DNA 納米結(jié)構(gòu)作為載體用于藥物遞送時(shí),不僅可以運(yùn)載單藥,還可運(yùn)載雙藥及多種不同的藥物分子,從而實(shí)現(xiàn)多種藥物的聯(lián)合治療,發(fā)揮“1＋1＞2”的協(xié)同效果[6]。因此,DNA 納米結(jié)構(gòu)在腫瘤治療方面發(fā)揮了重要作用,其靶向能力、載藥能力及對(duì)藥物的控制釋放能力被廣泛研究。

1 靜態(tài)DNA納米結(jié)構(gòu)

靜態(tài)DNA 納米結(jié)構(gòu)作為藥物載體相對(duì)于其他納米材料表現(xiàn)出顯著的優(yōu)越性,已被廣泛用于遞送小分子藥物、寡核苷酸類藥物和蛋白藥物等。

1.1 DNA多面體

DNA 多面體在藥物的加載和釋放等方面顯示出巨大的潛力。根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,已經(jīng)有大量的DNA 多面體被構(gòu)建出,如DNA 四面體、DNA 八面體、DNA 二十面體等。

DNA 四面體作為最簡(jiǎn)單的三維DNA 納米結(jié)構(gòu),由于它的空間位阻和納米尺度上的剛性,對(duì)酶降解具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,為藥物的遞送奠定了基礎(chǔ)。DNA 四面體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及對(duì)藥物的高負(fù)載率使其在運(yùn)載抗癌藥物方面發(fā)揮了顯著優(yōu)勢(shì)。隨著化療藥物的多次使用,癌細(xì)胞會(huì)對(duì)一種或多種抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性,這種多藥耐藥性已成為制約化療效果的瓶頸[7]。而DNA 四面體能攜帶抗癌藥物靶向到達(dá)病變部位,克服多藥耐藥性,提高療效。由于蒽環(huán)類藥物能夠通過(guò)嵌插結(jié)合的方式插入DNA 中富含GC 的區(qū)域,基于這一特性,可利用DNA 納米結(jié)構(gòu)作為藥物遞送載體來(lái)克服藥物本身缺陷。Kim 等人[8]將抗癌藥物阿霉素(DOX)與DNA 四面體混合得到復(fù)合物(圖2a),藥物通過(guò)嵌插結(jié)合與DNA 四面體發(fā)生相互作用,并被納米結(jié)構(gòu)靶向帶到癌細(xì)胞中,發(fā)揮藥效。Liu等人[9]設(shè)計(jì)合成了DNA 四面體結(jié)構(gòu),并且連接了能夠靶向癌細(xì)胞表面酪氨酸激酶的適體sgc8c。DOX 通過(guò)嵌插結(jié)合與該納米結(jié)構(gòu)結(jié)合,并被攜帶靶向到達(dá)癌細(xì)胞。米托蒽醌作為一種抗癌藥物,給藥后廣泛分布,具有很強(qiáng)的全身毒性,特別是嚴(yán)重的心臟毒性,這些副作用限制了它的應(yīng)用。Bu等人[10]設(shè)計(jì)合成了連接葉酸的DNA 四面體結(jié)構(gòu)用來(lái)裝載抗癌藥物米托蒽醌,能夠靶向白血病細(xì)胞,降低對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。膠質(zhì)瘤作為最致命的腦瘤之一,由于血腦屏障和血瘤屏障的存在以及藥物靶向性不足,其治療效果較差。Wang等人[11]合成出DNA 四面體載藥體系,連接了能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞上血小板衍生生長(zhǎng)因子受體β的Gint4.T 適體,構(gòu)建了適體-DNA 四面體結(jié)構(gòu)。該載藥體系能在體內(nèi)穩(wěn)定存在,且裝載DOX 進(jìn)入細(xì)胞后,對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)。Yang等人[12]將合成的DNA 四面體上連接核定位信號(hào)肽(NLS),攜帶反義寡核苷酸藥物(ASOs)到達(dá)細(xì)胞核,提高細(xì)胞毒性作用。

Ma等人[13]構(gòu)建了DNA 二十面體(圖2b),它由連接端粒酶引物和端粒重復(fù)序列的兩個(gè)錐體DNA 籠組成,藥物被包裹在DNA 納米結(jié)構(gòu)的空腔中。由于癌細(xì)胞表面表達(dá)異常的端粒酶,因此該納米結(jié)構(gòu)可以靶向到達(dá)病變部位,通過(guò)釋放鉑納米顆粒到順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞中,提高藥效,克服腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性。除此之外,DNA 三棱柱、DNA 八面體等多面體結(jié)構(gòu)也被構(gòu)建出,這為癌癥的治療提供了新思路。

圖2 通過(guò)自組裝形成的納米結(jié)構(gòu)載藥示意圖(a)DNA 四面體[8];(b)DNA 二十面體[13]

1.2 DNA長(zhǎng)雙鏈納米結(jié)構(gòu)

DNA 長(zhǎng)雙鏈納米結(jié)構(gòu)可通過(guò)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)[14]形成,并且傳統(tǒng)抗癌藥物如蒽環(huán)類藥物能夠結(jié)合在其雙螺旋結(jié)構(gòu)上,因此可將其作為藥物載體。

由于蒽環(huán)類藥物能誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性,從而降低對(duì)癌癥的治療效果。Tan 課題組[15]基于HCR 反應(yīng)構(gòu)建出連接適體sgc8的DNA 納米“火車”(靶向癌細(xì)胞的適體為“車頭”,HCR 反應(yīng)形成的DNA納米鏈為“車廂”),裝載DOX 靶向到達(dá)癌細(xì)胞,有效克服多藥耐藥性。因此,DNA 納米“火車”作為藥物載體,在運(yùn)載抗癌藥物、克服多藥耐藥、提高腫瘤治療效果方面發(fā)揮了獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本課題組[16]通過(guò)HCR 反應(yīng)將靶向癌細(xì)胞核仁素的AS1411適體連接到DNA 納米結(jié)構(gòu)上得到適體DNA 納米“火車”(AS1411NTrs),并以此作為蒽環(huán)類藥物DOX、表阿霉素(EPI)及柔紅霉素(DAU)的載體(圖3),通過(guò)熱力學(xué)、釋放動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明AS1411NTrs運(yùn)載蒽環(huán)類藥物,載藥量高,能夠靶向到達(dá)癌細(xì)胞(He La細(xì)胞),提高藥效,對(duì)靶細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,且能減少對(duì)正常細(xì)胞(L02 細(xì)胞)的毒副作用。還使用合成的AS1411NTrs運(yùn)載化療藥物DOX 與光敏劑亞甲基藍(lán)(TBO),將化療與光療聯(lián)用,克服癌細(xì)胞的多藥耐藥性[17]。由于乳腺癌細(xì)胞能夠規(guī)避DOX 等傳統(tǒng)化療藥物的殺傷作用,因此Xu等人[18]利用HCR 反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種適體偶聯(lián)的DNA 納米“火車”,這種高度有序的DNA 雙鏈具有大量裝載DOX 和AKT 抑制肽(AKTin)的位點(diǎn)。將DNA 與AKTin偶聯(lián),利用引入靶向適體的DNA 納米“火車”進(jìn)行藥物遞送。AKTin通過(guò)AKT 信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)了乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥性,與DOX 具有協(xié)同作用,在體內(nèi)和體外均具有明顯的治療作用,極大地提高了療效。為了增強(qiáng)藥物與癌細(xì)胞的結(jié)合親和力,并提高細(xì)胞內(nèi)化,Li等人[19]以HCR 反應(yīng)形成的雙鏈DNA 為骨架(軀干),將特異性核酸適配體Zy1(腿)連接在骨架上,發(fā)展了一種骨架長(zhǎng)度可控、配體價(jià)數(shù)可調(diào)的多價(jià)結(jié)合模式,命名為DNA 納米“蜈蚣”。納米“蜈蚣”的軀干用來(lái)裝載藥物DOX,具有較高的載藥能力;腿可以牢固和選擇性地抓住目標(biāo)細(xì)胞,靶向給藥,這種設(shè)計(jì)不僅提高了對(duì)癌細(xì)胞的殺傷能力,還降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用,該多價(jià)DNA 納米載體將為構(gòu)建新型診療平臺(tái)提供有效思路。

圖3 用于藥物裝載的DNA 納米火車的自組裝[16]

1.3 DNA樹狀大分子和DNA水凝膠

DNA 樹狀大分子與DNA 水凝膠是通過(guò)模塊自組裝設(shè)計(jì)形成的復(fù)雜DNA 納米結(jié)構(gòu)。它們可以提供眾多的對(duì)接位點(diǎn)來(lái)裝載藥物或其他功能元素,并且穩(wěn)定地防御酶降解,增強(qiáng)對(duì)腫瘤的靶向功能等。

DNA 水凝膠的制備在很多情況下是不可控制的,它們傾向于生長(zhǎng)成體積較大的水凝膠,因此,這在很大程度上限制了它們作為細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸載體的應(yīng)用,導(dǎo)致無(wú)法用于活細(xì)胞。此外由于DNA 水凝膠缺乏有效的釋放機(jī)制,這在很大程度上限制了它們的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用,因此Li等人[20]設(shè)計(jì)合成了一種蛋白支架DNA 納米水凝膠,具有可調(diào)節(jié)的大小和刺激響應(yīng)的特性,用于腫瘤細(xì)胞的可激活成像和治療。它還連接了靶向癌細(xì)胞的適體MUC1,能夠在富含ATP的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中通過(guò)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換選擇性地釋放藥物。Li等人[21]基于自組裝的方法設(shè)計(jì)合成了尺寸可控的DNA 納米水凝膠,能夠更有效地釋放藥物,應(yīng)用于靶向和刺激響應(yīng)的基因治療。DNA 樹狀大分子具有獨(dú)特的穩(wěn)定性、多孔性和高度支化結(jié)構(gòu),并且存在大量的雙鏈序列,具有較多的藥物結(jié)合位點(diǎn)。Taghdisi等人[22]設(shè)計(jì)了連接適體MUC1和AS1411的DNA 樹狀大分子納米結(jié)構(gòu),可以同時(shí)靶向癌細(xì)胞膜表面的異常糖基化粘蛋白與核仁素。它通過(guò)嵌插結(jié)合裝載大量的EPI,靶向到達(dá)癌細(xì)胞,提高了對(duì)乳腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷力。Choi等人[23]合成了連接葉酸適體的DNA 樹狀大分子,攜帶抗癌藥物和成像劑靶向癌細(xì)胞,使高效聯(lián)合診療成為可能。

1.4 大型DNA折紙結(jié)構(gòu)

Rothemund[24]率先開創(chuàng)了DNA 折紙技術(shù)這一領(lǐng)域,以一條長(zhǎng)的單鏈DNA 為支架,折疊成想要的形狀,結(jié)構(gòu)的固定是通過(guò)多個(gè)“訂書釘鏈”即短的DNA 鏈的自組裝完成的。這種方法能夠避免使用多條短鏈進(jìn)行合成時(shí)產(chǎn)生的化學(xué)計(jì)量和純化問(wèn)題,具有設(shè)計(jì)和制造簡(jiǎn)單、可編程性以及完全可尋址等突出優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)DNA 折紙技術(shù)可以設(shè)計(jì)合成更為復(fù)雜的DNA 納米結(jié)構(gòu),提高載藥量。

Jiang等人[25]提出了一種基于自組裝的、空間可尋址的DNA 納米結(jié)構(gòu)載藥系統(tǒng)(圖4),通過(guò)嵌插結(jié)合將DOX 連接到DNA 折紙結(jié)構(gòu)上形成復(fù)合物,這種復(fù)合物對(duì)正常和耐藥的人乳腺癌細(xì)胞均有明顯的細(xì)胞毒性作用。此外緊密堆積的雙螺旋結(jié)構(gòu)提供了大量的嵌插結(jié)合位點(diǎn),DOX 的高加載量可以彌補(bǔ)酶降解和藥物意外釋放對(duì)治療效果的影響,克服腫瘤多藥耐藥性。DNA 折紙系統(tǒng)的固有特性,如激活非特異性免疫系統(tǒng)而導(dǎo)致炎癥、在生理溶液中不穩(wěn)定、體內(nèi)壽命短等,成為了研究所要面臨的難題。為了克服這些弊端,Palazzolo等人[26]設(shè)計(jì)了一種長(zhǎng)30 nm、寬10 nm 的DNA 折紙結(jié)構(gòu),安裝在尺寸約為150 nm 的隱形脂質(zhì)體(LSTDO)內(nèi),用來(lái)遠(yuǎn)程裝載DOX。因?yàn)長(zhǎng)STDO 具有高度的穩(wěn)定性和良好的生物相容性,所以能夠降低免疫系統(tǒng)的識(shí)別,提高DOX 的生物分布和抗腫瘤效果,并降低DOX 的骨髓毒性。較小尺寸的DNA 折紙結(jié)構(gòu)具有內(nèi)吞功能,很容易內(nèi)化到癌細(xì)胞中,而對(duì)于大尺寸結(jié)構(gòu)的攝取,可能需要蛋白質(zhì)通道進(jìn)入細(xì)胞。Li等人[27]設(shè)計(jì)的矩形DNA 折紙結(jié)構(gòu),不但空間小,而且成本便宜,并且裝載藥物能有效地穿過(guò)卵巢癌細(xì)胞,但是熱力學(xué)穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。研究人員還通過(guò)DNA 折紙技術(shù)設(shè)計(jì)出了三維立體容器、納米管等更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)[28],例如DNA 納米管的中空心結(jié)構(gòu)可以用來(lái)構(gòu)建仿生膜通道,能夠作為多酶生物反應(yīng)器包裹蛋白質(zhì),或者選擇性地將藥物運(yùn)送到特定的靶細(xì)胞并發(fā)揮其活性。這些復(fù)雜的DNA 納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建,為藥物的遞送提供了更多有效的方法。

圖4 通過(guò)DNA 折紙技術(shù)設(shè)計(jì)的DNA 納米結(jié)構(gòu)[25]

DNA 折紙由于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)復(fù)雜、支架供應(yīng)有限、需要數(shù)百個(gè)“訂書針”,因此耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,這些限制了它的大規(guī)模生產(chǎn),并且阻礙了它們?cè)谏镝t(yī)學(xué)方面的探索,例如選擇性地輸送成像劑和治療劑等。

研究人員將DNA 折紙技術(shù)與其他方法聯(lián)用,可以更為簡(jiǎn)便地合成DNA 納米結(jié)構(gòu)。Chen等人[29]通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)方法得到產(chǎn)物ssDNA,將其作為支架,并結(jié)合DNA 折紙技術(shù)構(gòu)建了DNA 納米帶。這種改良之后的方法,使折疊短鏈的數(shù)量從數(shù)百條大幅減少到幾條,這使得DNA 納米帶的制備具有可擴(kuò)展性和較低的成本效益?；赗CA 的酶反應(yīng)合成的支架和主鏈,允許通過(guò)“一鍋法”合成DNA 納米帶,進(jìn)一步降低了成本。由于其獨(dú)特的周期性和剛性,DNA 納米帶可以有效地內(nèi)化到細(xì)胞內(nèi),成為潛在的顯像劑和治療藥物的納米載體。Ouyang等人[30]利用RCA 方法結(jié)合DNA 折紙技術(shù)設(shè)計(jì)出可調(diào)節(jié)長(zhǎng)度的DNA 納米帶,用于遞送Cp G 免疫刺激藥物。Kim 等人[31]設(shè)計(jì)的仿生DNA 納米球,連接靶向癌細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的CD44的適體透明質(zhì)酸,攜帶反義寡核苷酸藥物進(jìn)入癌細(xì)胞。研究人員還設(shè)計(jì)出DNA 納米花、DNA 納米籠等DNA納米結(jié)構(gòu)作為藥物載體提高載藥能力。

2 動(dòng)態(tài)DNA納米結(jié)構(gòu)

與靜態(tài)DNA 納米結(jié)構(gòu)相比,動(dòng)態(tài)DNA 納米結(jié)構(gòu)是指具有一定動(dòng)態(tài)行為的智能納米結(jié)構(gòu)。動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)能夠?qū)μ囟ǖ拇碳ぷ龀鲰憫?yīng)行為,更靈活地控釋藥物,降低藥物的毒副作用,并提高治療效果。

從靜態(tài)納米結(jié)構(gòu)到動(dòng)態(tài)納米結(jié)構(gòu)的發(fā)展為該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用開辟了新的途徑。動(dòng)態(tài)DNA 納米結(jié)構(gòu)的主要驅(qū)動(dòng)因素為化學(xué)或物理觸發(fā)器,以此來(lái)引起構(gòu)象的變化。DNA 納米機(jī)器人是出現(xiàn)較早的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),即具有機(jī)器人功能的DNA 納米盒子,能夠攜帶藥物,控制其釋放,具有分子傳感、邏輯計(jì)算和可控激活的功能。Li等人[32]利用DNA 折紙技術(shù)設(shè)計(jì)了一種DNA 納米機(jī)器人。平面的DNA 納米結(jié)構(gòu)上連接了眾多凝血酶,并使用含有適體AS1411的固定鏈將其折疊固定成桶狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)?shù)竭_(dá)靶細(xì)胞時(shí),核仁素靶向適體作為打開DNA 納米機(jī)器人的分子觸發(fā)器,使凝血酶暴露出來(lái),激活腫瘤部位的凝血。Andersen等人[33]將DNA 折紙方法擴(kuò)展到三維,創(chuàng)建出DNA 納米盒子,用鎖-鑰匙系統(tǒng)對(duì)盒子進(jìn)行功能化處理,利用外源DNA 作為鑰匙,控制釋放藥物。Douglas等人[34]創(chuàng)建了一個(gè)尺寸為35 nm×35 nm×45 nm 的六角形桶狀DNA 納米機(jī)器人,當(dāng)一端的兩個(gè)適體識(shí)別出它們的目標(biāo)時(shí),鎖定的雙鏈解離,釋放出抗原,與癌細(xì)胞表面受體結(jié)合抑制其生長(zhǎng)。若DNA 納米機(jī)器人上連接不同的分子觸發(fā)器,就可以同時(shí)響應(yīng)多個(gè)外部信號(hào)。DNA 納米鑷子是一種能夠連續(xù)切換成兩種狀態(tài)的分子機(jī)器,包括鑷子打開和關(guān)閉兩種形態(tài)。它能夠執(zhí)行捕獲、保持和釋放目標(biāo)分子這三個(gè)動(dòng)作。Zhou等人[35]設(shè)計(jì)了一種鑷子狀的DNA 納米機(jī)器(圖5),兩個(gè)DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)通Holliday連接體連接,中間安裝一個(gè)DNA 馬達(dá),在鏈置換反應(yīng)的驅(qū)動(dòng)下,結(jié)構(gòu)在莖-環(huán)和雙螺旋結(jié)構(gòu)之間循環(huán),鑷子打開,藥物被釋放出來(lái)。此外結(jié)合適體的DNA 鑷子還可以同時(shí)檢測(cè)不同的DNA 靶點(diǎn)、生物分子等。

圖5 DNA 納米機(jī)器人的自組裝[35]

隨著研究的不斷深入,各種各樣的動(dòng)態(tài)DNA 納米結(jié)構(gòu)被設(shè)計(jì)出,并對(duì)環(huán)境刺激顯示出良好的邏輯反應(yīng)。DNA 納米開關(guān)是一種在外部刺激下,能夠在幾種構(gòu)型之間進(jìn)行可逆異構(gòu)化的結(jié)構(gòu),可將其裝在納米結(jié)構(gòu)上,以實(shí)現(xiàn)藥物控制釋放。DNA 步行器能夠進(jìn)行定向的藥物運(yùn)輸,是一種很有前途的藥物傳遞平臺(tái)。它可以在特定的軌道上行走,由步行器、軌道、燃料分子三部分組成,類似于納米尺寸的微型機(jī)器人?？梢詰?yīng)用于核酸檢測(cè)、蛋白質(zhì)檢測(cè)、細(xì)胞成像和分析。為了克服傳統(tǒng)給藥系統(tǒng)的低效力,DNA 馬達(dá)被設(shè)計(jì)出,通過(guò)催化DNA 雜交來(lái)完成復(fù)雜和程序化的任務(wù)。它能夠?qū)植看碳ぷ龀龇磻?yīng)并相互傳遞控制信號(hào),推動(dòng)了分布式藥物制造和釋放反應(yīng)系統(tǒng)的開發(fā)。動(dòng)態(tài)DNA納米結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生,極大推動(dòng)了基于DNA 納米結(jié)構(gòu)的納米載藥體系以及用于體內(nèi)診斷和藥物控釋的智能傳感器的產(chǎn)生與發(fā)展。

3 藥物的控制釋放

相對(duì)于傳統(tǒng)給藥方式,DNA 納米結(jié)構(gòu)通常利用對(duì)p H、溫度、光、生物分子等的響應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物的控制釋放。

富含胞嘧啶(C)的序列可以折疊成i-motif結(jié)構(gòu),并隨p H 的變化而變化,在高p H 時(shí)為折疊狀態(tài),p H＝5.5時(shí)為完全展開狀態(tài)。利用這一特性,Xu等人[36]設(shè)計(jì)了質(zhì)子驅(qū)動(dòng)的富含端粒胞嘧啶的發(fā)夾DNA,用于藥物的結(jié)合和釋放,其中DNA 既作為藥物載體又作為控制藥物釋放的裝置,得到了由p H 控制的可逆結(jié)合和釋放的DNA 藥物載體。堿性條件下,存在DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu),抗癌藥物DOX 與其結(jié)合。酸性條件下,i-motif結(jié)構(gòu)形成,雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,藥物被釋放出來(lái)。Keum 等人[37]在DNA 四面體中引入i-motif結(jié)構(gòu),通過(guò)p H 調(diào)節(jié)四面體的組裝和解組裝,來(lái)控制藥物釋放。為進(jìn)一步提高DNA 納米結(jié)構(gòu)的載藥量,研究人員引入了納米金粒子,由于它毒性低,且表面能夠連接不同的有機(jī)體及配體,被應(yīng)用于癌癥治療。Alexander等人[38]使用連接了葉酸、溫度響應(yīng)型聚合物的多條DNA 雙鏈,將其結(jié)合在納米金粒子表面,提高了對(duì)DOX的載藥量。連接的溫度響應(yīng)型聚合物,可根據(jù)溫度的變化在腫瘤部位釋放藥物,使藥物療效更為顯著。因此,DNA 包裹的納米金粒子也成為了癌癥化療中有潛力的藥物遞送載體。

光響應(yīng)控釋藥物是一種通過(guò)光使DNA 發(fā)生解鏈[39]、斷裂[40]等行為來(lái)實(shí)現(xiàn)藥物釋放的方法。它通常是在DNA 結(jié)構(gòu)中加入光敏性物質(zhì),其中偶氮苯使用居多。研究人員將光響應(yīng)與p H 響應(yīng)相結(jié)合,設(shè)計(jì)合成出一種新型光驅(qū)動(dòng)?xùn)艩畹慕榭坠杓{米顆粒(MSN)輸送系統(tǒng)[41]。這種新型的結(jié)構(gòu)包括孔雀石綠碳醇?jí)A(MGCB)和i-motif結(jié)構(gòu)。MGCB作為光誘導(dǎo)的氫氧化物離子發(fā)射器,在光照射后可產(chǎn)生OH－,改變環(huán)境p H,從而來(lái)改變i-motif結(jié)構(gòu),控制藥物釋放。生物分子響應(yīng)控制藥物釋放,目前經(jīng)常使用的是三磷酸腺苷(ATP)。將適體與DNA 納米結(jié)構(gòu)結(jié)合來(lái)裝載藥物,當(dāng)存在ATP時(shí),其與適體結(jié)合,造成原結(jié)構(gòu)的破壞,從而將藥物釋放出來(lái)[42]。在幾種控制藥物釋放的方法中,光響應(yīng)控制是最簡(jiǎn)單的。

4 DNA納米結(jié)構(gòu)的安全性

隨著DNA 納米結(jié)構(gòu)逐漸被廣泛應(yīng)用于藥物加載,其安全性也成為首要關(guān)注的問(wèn)題。研究人員從細(xì)胞、動(dòng)物等水平對(duì)其安全性進(jìn)行了研究。與其他無(wú)機(jī)納米材料不同的是,DNA 納米結(jié)構(gòu)的安全性與其尺寸大小沒(méi)有相關(guān)性。Schüller等人[43]證明與脂質(zhì)體相比,DNA 載體顯示沒(méi)有可檢測(cè)到的毒性,也不影響脾細(xì)胞的活性,是一種高效無(wú)毒的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(Cp G)寡核苷酸遞送系統(tǒng)。同時(shí),也表明DNA 折紙結(jié)構(gòu)在暴露于各種細(xì)胞系的細(xì)胞裂解物當(dāng)中時(shí)能夠保持其結(jié)構(gòu)的完整性,并表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。動(dòng)物水平的實(shí)驗(yàn)證明DNA 納米結(jié)構(gòu)毒性低,易于代謝和排泄,但結(jié)構(gòu)不同,在體內(nèi)的吸收和分布也不相同。所以,通過(guò)大量研究證實(shí),DNA 納米結(jié)構(gòu)細(xì)胞毒性較低、安全性較高,是一種安全高效的藥物載體。

5 DNA納米結(jié)構(gòu)載藥面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)展望

5.1 DNA納米結(jié)構(gòu)面臨的挑戰(zhàn)

DNA 納米結(jié)構(gòu)在載藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景,由于其與無(wú)機(jī)納米材料相比更高效、安全,所以被廣泛用作藥物載體。雖然眾多實(shí)驗(yàn)證明了DNA 納米結(jié)構(gòu)作為藥物載體的安全性,但是它仍有可能引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。已有實(shí)驗(yàn)通過(guò)改變DNA 序列以及對(duì)短鏈DNA 進(jìn)行修飾等方法降低其免疫原性,因此對(duì)它可能引起的免疫反應(yīng)及解決方法我們?nèi)孕柽M(jìn)一步的探究。除此之外,雖然DNA 納米結(jié)構(gòu)在室溫下是穩(wěn)定的,但是它進(jìn)入人體之后會(huì)面臨酶降解、蛋白質(zhì)吸收和調(diào)節(jié)等挑戰(zhàn),這影響了它的釋藥速率以及代謝時(shí)間。為了解決這一問(wèn)題,Perrault等人[44]使用聚乙二醇化脂質(zhì)雙分子層包膜DNA 納米結(jié)構(gòu),這種方法改善了對(duì)核酸酶消化的保護(hù),并且降低了該結(jié)構(gòu)的免疫激活能力。Ponnuswamy等人[45]將DNA 納米結(jié)構(gòu)表面覆蓋低聚賴氨酸涂層,用來(lái)防止生理鹽水濃度和核酸酶介導(dǎo)的降解而導(dǎo)致的變性。

DNA 納米結(jié)構(gòu)雖然在載藥方面的優(yōu)勢(shì)顯著,然而作為納米結(jié)構(gòu)的新成員,仍需要大量的關(guān)鍵信息來(lái)支持這種方法的臨床應(yīng)用,目前還未有獲批的上市結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)樵谒鼈兊膶?shí)際應(yīng)用中還需考慮DNA 納米結(jié)構(gòu)在細(xì)胞中的途徑和去向,內(nèi)吞作用機(jī)制,以及不同的結(jié)構(gòu)對(duì)其在細(xì)胞中行為的影響等。它們進(jìn)入細(xì)胞之后的半衰期以及可能引發(fā)的其他副反應(yīng)仍需要進(jìn)一步的研究。除了生物學(xué)方面面臨的挑戰(zhàn),DNA 納米結(jié)構(gòu)的高成本以及如何進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)也成為制約其發(fā)展的一大問(wèn)題[46]。

5.2 DNA納米結(jié)構(gòu)的未來(lái)展望

雖然DNA 納米結(jié)構(gòu)是一種具有潛力的藥物載體,但是仍有多方面原因限制了它的臨床應(yīng)用。對(duì)于未來(lái)的研究方向,除了已有使用脂質(zhì)體或屏蔽載體來(lái)包裹DNA 納米結(jié)構(gòu),提高其體內(nèi)穩(wěn)定性的方法,還應(yīng)開發(fā)出更簡(jiǎn)便、高效的保護(hù)方法。或者從DNA 納米結(jié)構(gòu)本身出發(fā),對(duì)序列進(jìn)行改變或修飾,來(lái)推進(jìn)DNA 納米結(jié)構(gòu)載藥的實(shí)際應(yīng)用。DNA 的規(guī)?；a(chǎn)可以使用高通量DNA 合成技術(shù),以此來(lái)擴(kuò)大生產(chǎn),降低成本,滿足臨床需要。同時(shí)還需要對(duì)DNA 納米結(jié)構(gòu)的藥效學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)做進(jìn)一步的研究,這對(duì)其臨床應(yīng)用至關(guān)重要。除此之外,DNA 納米結(jié)構(gòu)載藥進(jìn)入人體之后會(huì)面臨一系列的生物屏障,克服其引起的免疫反應(yīng)也是需要解決的一大問(wèn)題。對(duì)于DNA 納米結(jié)構(gòu)的載藥釋放,目前居多的為單刺激響應(yīng),但是在復(fù)雜的生理環(huán)境中,單一刺激可能會(huì)限制藥物的釋放,因此多響應(yīng)控制釋藥顯得尤為重要。雖然DNA 納米結(jié)構(gòu)載藥量多,但是合成復(fù)雜、費(fèi)用高,而且結(jié)構(gòu)不同,在體內(nèi)吸收和分布也不同,因此需要進(jìn)一步研究DNA 納米結(jié)構(gòu)與載藥量的關(guān)系,提高合成率并明確DNA 納米結(jié)構(gòu)在生物體中的去向,以更好地發(fā)揮其載藥能力和靶向釋藥能力。目前有很多研究表明DNA 納米結(jié)構(gòu)能夠與抗癌藥物結(jié)合,并在體內(nèi)外發(fā)揮較好的抗腫瘤效果,但關(guān)于DNA 納米結(jié)構(gòu)與藥物的相互作用的研究卻很少。研究DNA 納米結(jié)構(gòu)與藥物的相互作用能夠影響抗癌藥物在體內(nèi)外的吸收、分布、代謝和排泄(ADME),對(duì)進(jìn)一步了解DNA 納米結(jié)構(gòu)加載抗癌藥物發(fā)揮療效的機(jī)理有重要意義。此外,目前文獻(xiàn)中DNA 納米結(jié)構(gòu)加載的小分子化療藥物多為蒽環(huán)類藥物如DOX,對(duì)其他化療藥物如紫杉醇類、色霉素類和嘧啶類藥物的研究較少。盡管在很多方面仍需進(jìn)一步探索,但是DNA 納米結(jié)構(gòu)增加藥物的細(xì)胞攝取率,提高了藥物的藥效,并降低藥物的毒副作用,有望成為最有應(yīng)用前景的藥物遞送載體。