張莉 王海亮 馬雪兒 ?？←?陳程 張文舉

摘要 [目的]深入預(yù)測(cè)CCE001a蛋白結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。[方法]使用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)CCE001a基因所編碼的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)其功能與結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]該蛋白的總氨基酸殘基數(shù)為556個(gè)，分子式為C2865H4321N737O811S23，蛋白的等電點(diǎn)pI為5.32，帶正電的氨基酸殘基（Arg+Lys）為58 個(gè)，帶負(fù)電的氨基酸殘基（Asp+Glu）為75個(gè)，蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為35.22，脂肪系數(shù)為75.91，總平均親水性系數(shù)為-0.262;CCE001a蛋白有一個(gè)脫氫酶超家族（cl21494）結(jié)構(gòu)域;經(jīng)分析顯示，α-螺旋、無(wú)規(guī)律的卷曲是這種蛋白質(zhì)的主要二次結(jié)構(gòu)，分別占31.35%和46.49%，還包括3.96%的β-轉(zhuǎn)角和18.20%的擴(kuò)展延伸鏈。經(jīng)過(guò)三級(jí)結(jié)構(gòu)學(xué)預(yù)測(cè)表明，該蛋白包括α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角;該蛋白亞細(xì)胞被確認(rèn)為定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，存在著信號(hào)肽的序列，初步可以認(rèn)為是具有分泌力的親水蛋白，且沒(méi)有出現(xiàn)跨膜蛋白，共有37個(gè)磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。[結(jié)論]該研究可為研究CCE001a的解毒機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 CCE001a;羧酸酯酶;解毒;蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn);生物信息

中圖分類(lèi)號(hào) S 435.622+.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）01-0102-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.026

Bioinformatics Analysis of the Protein Structure and Function of Helicoverpa armigera CCE001a

ZHANG Li， WANG Hai-liang， MA Xue-er et al

（College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi， Xinjiang 832000）

Abstract [Objective]In order to further predict the protein structure and biological function of CCE001a.[Method]This study used a bioinformatics method to predict the protein encoded by this gene， and predict its function and structure. [Result] The prediction results show that the total number of amino acid residues of the protein is 556， its molecular formula is C2865 H 4321N737O811S23， the isoelectric point pI of the protein is 5.32， and the positively charged amino acid residues （Arg+Lys） are 58， which are negatively charged. There are 75 amino acid residues （Asp+Glu）， protein instability coefficient is 35.22， fat coefficient is 75.91， total average hydrophilicity coefficient is -0.262; CCE001a protein has a dehydrogenase superfamily （cl21494） domain; analysis shows that α-helix and irregular coils are the main secondary structures of this protein. They account for 31.35% and 46.49%， respectively， including 3.96% of β-turns and 18.20% of extended stretched chains. After tertiary structural prediction， it is shown that the protein includes α-helix and β-turn; the protein subcellular is confirmed to be located in the endoplasmic reticulum， and there is a signal peptide sequence， which can be initially considered as secretory Hydrophilic protein， and no transmembrane protein， a total of 37 phosphorylation sites， one N-glycosylation site. [Conclusion]This study can provide a theoretical basis for studying the detoxification mechanism of CCE001a.

Key words CCE001a;Carboxylesterase;Detoxification;Protein modification sites;Biological information

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金“棉鈴蟲(chóng)棉酚降解酶的高活性篩選及其酶學(xué)特性與降解機(jī)理”（31860660）;石河子大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)資金專(zhuān)項(xiàng)“基于棉酚降解相關(guān)基因的熱帶假絲酵母遺傳轉(zhuǎn)化及應(yīng)用項(xiàng)目”（RCZK2019）。

作者簡(jiǎn)介 張莉（1997—），女，甘肅天水人，碩士研究生，研究方向：飼料資源的開(kāi)發(fā)與利用。

通信作者：陳程，講師，從事飼料資源的開(kāi)發(fā)與利用研究;張文舉，教授，從事飼料資源的開(kāi)發(fā)與利用研究。

收稿日期 2021-05-24;修回日期 2021-06-11

羧酸酯酶（CarEs）是一類(lèi)主要的解毒酶，與各種昆蟲(chóng)的抗藥性有關(guān)[1]。羧酸酯酶普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中，在包括羧酸酯在內(nèi)的異生化合物水解成相應(yīng)的醇和羧酸的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。昆蟲(chóng)中參與多種類(lèi)型殺蟲(chóng)劑解毒作用的物質(zhì)可能是1個(gè)或多個(gè)酶系，這些殺蟲(chóng)劑包括擬除蟲(chóng)菊酯、有機(jī)磷和氨基甲酸酯。在人類(lèi)大量使用有機(jī)磷、擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑的形勢(shì)下，對(duì)棉花危害較大的害蟲(chóng)棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）產(chǎn)生了較嚴(yán)重的抗藥性[3]。CarEs是一類(lèi)主要負(fù)責(zé)異生素化學(xué)物質(zhì)的解毒酶，因此在棉鈴蟲(chóng)抗藥性中起關(guān)鍵作用[4]。次生代謝物是植食性昆蟲(chóng)及其寄主植物共同進(jìn)化中的一組重要介質(zhì)。由于其幼蟲(chóng)在棉花上覓食和生長(zhǎng)，棉鈴蟲(chóng)可通過(guò)解毒和螯合機(jī)制耐受棉花植物產(chǎn)生的主要防御代謝物棉酚[5]。當(dāng)受到昆蟲(chóng)攻擊時(shí)，宿主植物會(huì)產(chǎn)生次生代謝物作為防御的一部分，而昆蟲(chóng)在進(jìn)食時(shí)會(huì)產(chǎn)生解毒酶來(lái)抵消次生代謝物。通常情況下，代謝排毒途徑一般可以分為3個(gè)階段。第1階段的酶，細(xì)胞色素P450單加氧酶或羧酸酯酶直接作用于毒素分子，增加其官能團(tuán)的親水性和反應(yīng)性。第2階段，疏水性和毒性化合物通過(guò)谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）的作用轉(zhuǎn)化為親水性產(chǎn)物，促進(jìn)其排泄。最后，依靠ATP結(jié)合盒（ABC）和主要的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)將結(jié)合的異源物質(zhì)泵出細(xì)胞[6-7]。數(shù)據(jù)表明，在棉鈴蟲(chóng)中至少發(fā)現(xiàn)了40種羧酸酯酶[7]。目前，殺蟲(chóng)劑代謝產(chǎn)生活性CarEs的另一種方法是利用異源表達(dá)系統(tǒng)。迄今為止，已經(jīng)用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞（Sf9）中表達(dá)了來(lái)自棉鈴蟲(chóng)GR菌株的若干CarEs[8]，然而，由于昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢和表達(dá)水平低，只能產(chǎn)生有限數(shù)量的酶。一些昆蟲(chóng)基因已經(jīng)在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行了功能性表達(dá)。例如，利用這種異源表達(dá)系統(tǒng)，來(lái)自庫(kù)蚊的突變B1酯酶顯示出對(duì)4種有機(jī)磷酸酯殺蟲(chóng)劑的水解酶活性[9]。蘋(píng)果蠹蛾的CpCE-1能夠代謝乙酰甲胺磷[10]。靳明輝[11]采用qPCR技術(shù)篩選6個(gè)候選基因，采用qPCR技術(shù)對(duì)棉鈴蟲(chóng)取食棉酚后6個(gè)候選基因的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，CCE001a基因表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05），由此可知，基因CCE001a與棉鈴蟲(chóng)代謝棉酚有關(guān)。因此，了解棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶CCE001a蛋白質(zhì)生化特性和生物活性功能，可能會(huì)大大促進(jìn)對(duì)棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶解毒棉酚機(jī)制的理解。

1 材料與方法

棉鈴蟲(chóng)CCE001a蛋白的生物信息學(xué)分析內(nèi)容和使用的軟件及網(wǎng)站見(jiàn)表1[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCE001a蛋白理化性質(zhì)

CCE001a 蛋白酶的理化特性是通過(guò) ExPASy在線工具 Protparam 來(lái)分析，通過(guò)分析表明，棉鈴蟲(chóng) CCE001a 的相應(yīng)分子質(zhì)量為62 802.66。由表2可知，棉鈴蟲(chóng)CCE001a 共含20種氨基酸。該基因所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸總計(jì)556個(gè)，分子式為C2865 H 4321N737O811S23，蛋白等電點(diǎn)PI為5.32，不穩(wěn)定系數(shù)計(jì)算為35.22，故將其歸類(lèi)為穩(wěn)定性蛋白;帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg + Lys）為58個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp + Glu）為75個(gè)，脂肪系數(shù)為75.91;親水性的平均值（GRAVY）為-0.262，為親水性蛋白。

2.2 CCE001a蛋白保守區(qū)域預(yù)測(cè)

該蛋白的保守序列如圖1所示，發(fā)現(xiàn)22～530有1個(gè)共酯酶家族（PF00135）結(jié)構(gòu)域，在118～206有1個(gè)脫氫酶家族（PF07859）結(jié)構(gòu)域。

2.3 CCE001a蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

CCE001a蛋白二級(jí)組成體系運(yùn)用SOPMA 網(wǎng)絡(luò)軟件工具進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（alpha helix）占31.35%，β-轉(zhuǎn)角（beta turn）占3.96%，無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）占46.49%，擴(kuò)展鏈（extended strand）占18.20%（圖2）。該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）由Phyre2在線預(yù)測(cè)，該預(yù)測(cè)模型的蛋白覆蓋率為 100%，可信度為 92%。

2.4 CCE001a蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

使用PSOR在線工具分析該蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，CCE001a基因編碼蛋白主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有很多參與不同類(lèi)型解毒作用的酶系，從結(jié)合棉鈴蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑及植物次生代謝產(chǎn)物來(lái)看，CCE001a可能會(huì)參與解毒作用，通過(guò)氧化還原、水解或結(jié)合等反應(yīng)來(lái)代謝有毒的外源物質(zhì)，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化成為無(wú)毒物質(zhì)排出體外。

2.5 CCE001a蛋白氨基酸序列信號(hào)肽預(yù)測(cè)

使用SignalP4.0 Server在線分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在一個(gè)信號(hào)肽，存在位置為第17個(gè)氨基酸處（圖4），初步認(rèn)為該蛋白為分泌型蛋白。

2.6 CCE001a的蛋白質(zhì)親疏水性

經(jīng)在線分析，預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5。CCE001a蛋白的親水性均值（GRAVY）為-0.262，疏水指數(shù)最大值為3.011，位于第11位氨基酸上，最小為-2.922，位于第35位氨基酸上。CCE001a蛋白的親水性氨基酸范圍大于疏水性氨基酸范圍，故將該預(yù)測(cè)蛋白歸屬為親水性蛋白。

2.7 CCE001a的蛋白質(zhì)跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)

通過(guò)TMHMM在線軟件對(duì)該蛋白質(zhì)的跨膜螺旋區(qū)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，CCE001a蛋白的跨膜螺旋區(qū)間數(shù)為0，且其跨膜螺旋內(nèi)氨基酸的數(shù)目很小，故該蛋白質(zhì)未形成一定的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)，但由于CCE001a蛋白的特殊結(jié)構(gòu)，該預(yù)測(cè)結(jié)果結(jié)合親水性分析結(jié)果，表明棉鈴蟲(chóng)CCE001a基因編碼蛋白為親水性蛋白，不含有跨膜區(qū)。

2.8 CCE001a蛋白磷酸化位點(diǎn)

這一編碼蛋白包括15處絲氨酸（serine，s）、16處蘇氨酸（threonine，t）、6處酪氨酸（tyrosine，y）磷酸化定位（圖7）。蛋白N-糖基化位點(diǎn)經(jīng) NetNGlyc 1.0在線分析軟件預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示評(píng)分高于 0.50的位點(diǎn)僅有1個(gè)，位于114位的N-Gly（圖8）。

3 討論

棉鈴蟲(chóng)羧酸酯酶是重要的昆蟲(chóng)解毒蛋白。目前，學(xué)者已證實(shí)了羧酸酯酶基因CCE001a與棉鈴蟲(chóng)代謝棉酚有關(guān)。羧基酯酶多基因家族是α/β-水解酶折疊超家族。這個(gè)超家族的成員在一級(jí)序列中有一個(gè)高度保守的非鄰接殘基催化三聯(lián)體。三聯(lián)體通常是Ser、Glu和His，也可以是Ser、Asp和His或Cys、Asp和His。CarE屬于絲氨酸水解酶，其活性中心具有絲氨酸殘基，多數(shù)生物體中有多種CarE同工酶。這些同工酶參與藥物代謝、解毒作用和脂類(lèi)物質(zhì)代謝。該研究利用生物信息技術(shù)發(fā)現(xiàn)CCE001a是一個(gè)含有信號(hào)肽的親水性蛋白，無(wú)跨膜區(qū)。分析表明CCE001a在蛋白中存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，蛋白質(zhì)磷酸化是一種重要和廣泛應(yīng)用的翻譯后調(diào)節(jié)方法。蛋白磷酸化在真核生物中普遍對(duì)蛋白進(jìn)行翻譯修飾（磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰乙?；龋┯兄匾饔?，對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞起著主導(dǎo)作用[13]。磷酸化前后蛋白的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化會(huì)影響蛋白活性的改變，進(jìn)而影響信號(hào)通路中下游蛋白的活性，從而對(duì)生理生化過(guò)程進(jìn)行調(diào)控[14-15]。近年來(lái)，棉鈴蟲(chóng)具有較強(qiáng)的抗藥性，這在國(guó)內(nèi)外研究中得到了越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)，而其體內(nèi)的解毒酶含量和活力程度對(duì)于耐藥以及解毒效果都起著重要作用。而棉花色素腺體和棉酚能誘導(dǎo)棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的解毒酶活性增加。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，棉酚對(duì)棉鈴蟲(chóng)解毒酶的活力誘導(dǎo)作用中，多功能氧化酶具有主導(dǎo)作用，且羧酸酯酶也能幫助多功能氧化酶在新陳代謝過(guò)程中進(jìn)行水解[14]。劉杰[14]研究發(fā)現(xiàn)，適量的棉酚會(huì)在一定范圍內(nèi)刺激引起棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的不同種類(lèi)羧酸酯酶，且這些物質(zhì)還可以增強(qiáng)棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)羧酸酯酶的存在，但是這種新型的誘導(dǎo)酶類(lèi)作用于外源物質(zhì)的解毒及其效果，仍有待于進(jìn)一步研究才能確定。CCE001a蛋白的三

級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)合二級(jí)

結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白主要由31.35%的α-螺旋、3.96%的

β-轉(zhuǎn)角、46.49%的無(wú)規(guī)則卷曲和18.20%的延伸鏈組成，而其中無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)有助于CCE001a識(shí)別底物，因?yàn)棣谅菪挺抡郫B空間結(jié)構(gòu)不易發(fā)生改變而無(wú)規(guī)則卷曲空間結(jié)構(gòu)易于發(fā)生改變[12]。CCE001a存在1個(gè)高可信度的潛在N-糖基化位點(diǎn)，真核細(xì)胞中，大部分蛋白內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）通過(guò)N-糖基化修飾，蛋白質(zhì)的折疊和分選也與糖基化息息相關(guān)[16]，但單個(gè)糖基化位點(diǎn)的破壞不會(huì)影響 CCE001a 的正確加工和運(yùn)輸功能。

該研究從 CCE001a蛋白序列出發(fā)，運(yùn)用不同在線分析軟件進(jìn)行分析，深入了解該蛋白的性質(zhì)及功能，可為棉鈴蟲(chóng)抗藥和植物次生代謝產(chǎn)物提供參考。此外，仍需從多個(gè)角度來(lái)驗(yàn)證預(yù)測(cè)分析結(jié)果，以彌補(bǔ)生物信息學(xué)分析的局限性。

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