開偉華,戴 晨,查 誠(chéng),陳 建

(1.銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院;2.安徽安科恒益藥業(yè)有限公司,安徽 銅陵 244061)

糖尿病是一種慢性疾病,其并發(fā)癥具有較強(qiáng)的隱匿性,早期極易被忽略,待病癥顯露可以影響到全身的各個(gè)器官,往往會(huì)導(dǎo)致糖尿病患者失明和殘疾,甚至危及生命。中醫(yī)認(rèn)為,糖尿病多為燥熱陰虛,津液不足,以滋陰清熱,補(bǔ)腎益精為治。玉女煎一方出自《景岳全書》,由石膏、熟地黃、麥冬、知母、牛膝諸藥組成,方中石膏辛甘大寒,清胃火;熟地黃甘而微溫,滋腎水;知母苦寒質(zhì)潤(rùn)、滋清兼?zhèn)?麥冬微苦甘寒;牛膝補(bǔ)肝腎,降上炎之火,止上溢之血。本方以狀如“玉女”之石膏為主,宛若觀音大士用柳枝蘸凈瓶之水灑于大地,平息陰虛火亢之癥,故名“玉女煎”,在糖尿病治療中具有清胃瀉火,滋陰增液之功[1]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了系統(tǒng)生物學(xué)、多項(xiàng)藥理學(xué)、強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)通路的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)節(jié)作用綜合分析,系統(tǒng)觀察藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響[2-3]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討玉女煎治療糖尿病的生物學(xué)機(jī)制,為玉女煎治療糖尿病實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 玉女燕各中藥活性成分及靶點(diǎn)收集為收集玉女煎中5種藥材的化合物成分,利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以玉女煎全方“石膏”“熟地黃”“麥冬”“知母”“牛膝”為關(guān)鍵詞,以口服生物利用度(Oral bioavailability,OB)N30%,類藥性(Drug like property,DL)N0.18為參數(shù)篩選,收集玉女煎的有效化學(xué)成分信 息。并利用TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中未收 錄的中藥的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。

用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取各活性成分的SMILES號(hào),導(dǎo)入Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)各成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn),再統(tǒng)一經(jīng)過(guò)UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)進(jìn)行對(duì)照規(guī)范,來(lái)源物種校正為“humon”,獲取作用靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)名[4]。

1.2 糖尿病靶點(diǎn)的篩選分別在TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中以“diabetes”為關(guān)鍵詞檢索與糖尿病相關(guān)的靶點(diǎn),每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)取前300個(gè)靶點(diǎn)組建糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[1],合并去重,篩選處理后獲取疾病的作用靶點(diǎn)[5]。

1.3 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為闡明玉女煎活性成分與糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)間的相互關(guān)系,將篩選過(guò)的玉女煎活性成分與糖尿病靶點(diǎn)上傳至在線韋恩圖繪制網(wǎng)站繪制韋恩圖,獲取藥物與疾病共同靶點(diǎn)。采用Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 靶點(diǎn)相互作用關(guān)系為明確玉女煎對(duì)糖尿病靶點(diǎn)之間的相互作用,利用String 11.0網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)對(duì)共同靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI),其中蛋白種類設(shè)置“Homo sapiens",閾值設(shè)為中等置信度>0.4,其余參數(shù)默認(rèn)設(shè)置不變。這些網(wǎng)絡(luò)由“節(jié)點(diǎn)(node)”與“邊(edge)”組成,節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),邊表示分子間的相互作用,即節(jié)點(diǎn)之間的鏈接[6]。

1.5 GO功能分析和KEGG信號(hào)通珞富集分析將玉女煎和糖尿病獲取共同靶點(diǎn)導(dǎo)入David 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析,利用GraphPad Prism 7.0繪制GO富集柱狀圖,并分別展示玉女煎治療糖尿病最可能涉及的生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、分子生物學(xué)功能(molecular function,MF)和細(xì)胞組分(cellular component,CC),利用OmicShare云平臺(tái)繪制KEGG氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接使用Autodock Vina 1.1.2軟件進(jìn)行對(duì)接,在Mgtool工具中準(zhǔn)備蛋白質(zhì)和配體,在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載各靶點(diǎn)晶體結(jié)構(gòu),運(yùn)用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載各成分3D結(jié)構(gòu)的SDF格式,以靶點(diǎn)小分子配體為活性中心,對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行再對(duì)接,探討化學(xué)成分與靶點(diǎn)之間結(jié)合,用Auto工具計(jì)算對(duì)接結(jié)合能,Pytool工具繪制靶點(diǎn)蛋白與分子的對(duì)接圖。

2 結(jié)果

2.1 中藥活牲成分和靶點(diǎn)篩選本研究通過(guò)對(duì)玉 女煎活性成分進(jìn)行檢索,5味中藥去重篩選出活性成分257個(gè)(生石膏1個(gè),熟地黃15個(gè),麥冬55個(gè),知母154個(gè),牛膝41個(gè),見圖1)。

圖1 玉女煎中藥各活性成分?jǐn)?shù)量

收集各成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),選擇Swiss數(shù)據(jù)庫(kù)收錄且匹配程度高的基因名稱作為目標(biāo)成分的重要靶點(diǎn),去除無(wú)靶點(diǎn)的孤立成分,共收集活性成分133個(gè),對(duì)應(yīng)成分共有靶點(diǎn)6 713個(gè)靶點(diǎn)(知母活性成分71個(gè),對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)3 263個(gè);熟地黃活性成分14個(gè),對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)345個(gè);牛膝活性成分28個(gè),對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)1 981個(gè),麥冬活性成分29個(gè),對(duì)應(yīng)成分靶點(diǎn)169 4個(gè);生石膏主要成分CaSO4,無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),見圖2),以上靶點(diǎn)去重后共有982個(gè)。

圖2 中藥各活性成分-靶點(diǎn)數(shù)量圖

2.2 疾病-靶點(diǎn)的確定檢索與糖尿病相關(guān)靶點(diǎn),GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得14 950個(gè),TTD數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得225個(gè),DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得2個(gè),根據(jù)相關(guān)度每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)取前300個(gè)靶點(diǎn)組建糖尿病相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù),三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)合并去重共得疾病靶點(diǎn)495個(gè)。

2.3 中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將中藥靶點(diǎn)982個(gè)與疾病靶點(diǎn)495個(gè),經(jīng)Venny 2.1.0映射后得到134個(gè)共同靶點(diǎn)(見圖3),輸入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4),對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析顯示,degree值排名前四的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白為11β-HSD1、PTPN1、AD0RA1、SHBG,分別為40、38、38、35；degree值排名前五的活性成分為環(huán)(酪氨酸-亮氨酸)二肽[cyclo(Tyr-Leu)]、橙黃胡椒酰胺(aurantiamide)、金色酰胺醇酯(aurantiamide acetate)、異裁莫皂忒(smilagenin)、菠藝皂昔兀(sarsasapogenin),degree值分別為35、27、26、26、26。表明在玉女煎治療糖尿病中,這些連接靶點(diǎn)較多的活性成分可能具有重要作用。

圖3 中藥-疾病共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖4 中藥-活性成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 中藥-疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將134個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)進(jìn)行蛋白互作分析,構(gòu)建 PPI網(wǎng)路圖(見圖5),圖中共有134個(gè)節(jié)點(diǎn),1 493條 邊,平均節(jié)點(diǎn)度為22.4,網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),線條代 表靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的相互作用。

圖5 中藥-疾病共同靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析結(jié)果對(duì)玉女煎治療糖尿病134個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析,計(jì)算出BP、MF 和CC各有460、102、46條,P代表富集的顯著性,P越小顯著性越高,取前20條繪圖,結(jié)果如圖6所示。 其中BP主要涉及細(xì)胞增殖的正調(diào)控、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、炎癥反應(yīng)、基因表達(dá)正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等,MF主要涉及類固醇激素受體活性、蛋白酪氨酸激酶活性、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性、ATP結(jié)合等,CC主要涉及質(zhì)膜、質(zhì)膜的組成部分、膜筏、細(xì)胞表面等。

圖6 玉女煎-糖尿病GO富集分析

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果對(duì)玉女煎治療糖 尿病134個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,取排名 前20條通路,結(jié)果見圖7,P代表富集的顯著性。富 集程度高且富集基因數(shù)較多通路主要為:HIF-1信 號(hào)通路、恰加斯病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、 胰島素抵抗、癌癥的途徑、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、FoxO 信號(hào)通路等。表明玉女煎對(duì)活性成分可能作用于這 些信號(hào)通路來(lái)達(dá)到治療糖尿病的目的。

圖7 玉女煎-糖尿病KEGG富集分析

2.7 中藥主奏活性成分和核心靶點(diǎn)分子對(duì)接取中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中degree值≥25中藥主要活性成分cyclo(Tyr-Leu)、aurantiamide、aurantiamide acetate A smilageninA sarsasapogenin,degree值≥35的關(guān)鍵靶點(diǎn)11β-HSD1、PTPN1、ADORA1、SH-BG。將成分與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)合形成穩(wěn)定構(gòu)象時(shí)能量越低,結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定越契合,越能發(fā)揮藥效,對(duì)接結(jié)果見表1和圖8,如靶點(diǎn)HSD11B1與aurantiamide acetateA sarsasapogeninA smilagenin的對(duì)接結(jié)合能分別為-9.6 KJ/mol、-12.2 KJ/mol、-11.9 KJ/mol,靶點(diǎn)AD0RA1與sarsasapogenin、smilagenin 的結(jié)合能為-10.7 KJ/mol、-10.8 KJ/mol。因此,主要活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合情況與預(yù)測(cè)關(guān)系相符。

圖8 分子對(duì)接模式圖

表1 玉女煎有效活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能比較(KJ/mol)

3 討論

玉女煎治療以清胃熱,滋腎陰為主。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建玉女煎中“疾病-基因-靶標(biāo)-藥物”的互作網(wǎng)絡(luò),研究通過(guò)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)玉女煎治療糖尿病成分、靶點(diǎn)匹配和分子對(duì)接,發(fā)現(xiàn)玉女煎的主要活性成分smilagenin、sarsasapogenin,具有抗糖尿病、抗氧化、抗癌、抗炎等多種功效。主要靶點(diǎn)11β-HSD1是糖皮質(zhì)激素的代謝酶,11β-HSD1抑制劑能減少糖皮質(zhì)激素的生成及活化,提高脂肪組織、肝臟和骨骼肌胰島素的敏感性,影響機(jī)體內(nèi)的糖脂代謝[7-8]。ADORA1對(duì)糖尿病兼抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力損傷有正向的保護(hù)作用;升高SHBG水平能顯著改善胰島素抵抗水平,改善糖尿病患者肥胖及組織代謝異常情況[9-11]。信號(hào)通路中HIF-1α表達(dá)增加,可調(diào)控下游細(xì)胞因子VEGF表達(dá),促進(jìn)新生血管形成,改善腎臟微循環(huán),減輕腎臟缺氧及缺血。當(dāng)糖尿病腎病病情不斷惡化時(shí),高血糖抑制HIF-1α,損害腎臟作用增加,HIF-1α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用顯現(xiàn),且血糖升高時(shí)紅細(xì)胞攜氧能力減低,缺氧狀態(tài)明顯,VEGF高表達(dá),尿蛋白增多,腎臟將嚴(yán)重受損,疾病加劇進(jìn)展[12-13]。TLRs參與Ⅱ型糖尿病患者的胰島素抵抗、B細(xì)胞功能障礙及并發(fā)癥的發(fā)展,在II型糖尿病患者體內(nèi),TLR2信號(hào)通路等水平均顯著高于正常人群,并參與炎性反應(yīng)[14]。

綜上所述,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,建立了玉女煎“化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型,初步預(yù)測(cè)了玉女煎治療糖尿病的作用機(jī)制,但是其進(jìn)一步的機(jī)制研究還需要通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)來(lái)加以驗(yàn)證。