陳曉亞,劉善賀,胡玉珠,張高波,崔亭松,胡姍姍

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院眼科，黑龍江 牡丹江 157011)

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(Age-related-cataract，ARC)是晶狀體老化后的退行性改變，年齡、性別、外傷、氧化、輻射照射、酒精等均可以導(dǎo)致其發(fā)生[1]。ARC的發(fā)生是導(dǎo)致視力下降的主要原因,在全球范圍內(nèi)致盲性眼病中排首位。因此，深入研究并闡明ARC發(fā)生、發(fā)展過程中的具體分子機(jī)制，找到發(fā)病原因具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

哺乳動(dòng)物STE20樣激酶(Mammalian Ste20-likeprotein kinase，MST1)是人體普遍表達(dá)的一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要表達(dá)于免疫細(xì)胞，參與細(xì)胞存活、遷移、增殖、分化、凋亡和免疫應(yīng)答[2]。據(jù)報(bào)道，MST1在體外誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[3],但MST1在晶狀體上皮細(xì)胞(Lens epithelial cells,LECs)的表達(dá)情況以及是否參與ARC的發(fā)生尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。大腫瘤抑制激酶1/2(Large tumor suppressor kinase1/2，LATS1/2)是一種抑癌基因，可轉(zhuǎn)錄翻譯絲/蘇氨酸激酶，具有高度保守特征，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和維持基因穩(wěn)定性等方面發(fā)揮著重要作用[4-5]。研究表明，LATS1/2參與Hippo通路并且 受MST1的調(diào)控，Hippo通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等以及介導(dǎo)體內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在眼科領(lǐng)域中也起著重要的調(diào)控作用[6]。然而，LATS1/2否參與ARC的發(fā)生尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。ARC作為一種最常見的眼部衰老性疾病，對(duì)其細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究則更為重要。

本研究目的是通過觀察MST1及LATS1/2在正常人和ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平的差異，為ARC的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集于2020年12月至2022年6月期間在牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院就診并行白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)的年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者共20例，為ARC組。納入標(biāo)準(zhǔn):ARC組為皮質(zhì)性白內(nèi)障患者年齡在50～70歲，無高血壓、糖尿病、角膜或視網(wǎng)膜疾病，無眼部外傷或眼內(nèi)手術(shù)史。正常組為同期眼外傷發(fā)生晶狀體脫出的患者15例，年齡50～70歲，無高血壓、糖尿病、角膜或視網(wǎng)膜疾病。本研究收集的臨床樣本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并在患者知情同意的情況下簽署同意書。

1.2 組織的收集ARC組樣本的收集均由同一眼科醫(yī)生在行白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)中撕除晶狀體前囊膜時(shí)獲取，正常組樣本的收集均由同一眼科醫(yī)生在行晶狀體摘除術(shù)中撕除晶狀體前囊膜時(shí)獲取。將所得組織一分為二，一半置于4%的多聚甲醛組織固定液中浸泡，常溫放置，用于免疫組織化學(xué)染色；另一半置于液氮罐中冷凍，并轉(zhuǎn)移至-80 ℃的冰箱中保存，用于western blot實(shí)驗(yàn)操作。

1.3 試劑兔抗MST1一抗、兔抗LAST1/2一抗購自美國(guó)Abcam公司、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗、DAB顯色試劑盒購自北京中衫生物公司。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

1.4.1 實(shí)驗(yàn)步驟 術(shù)后組織標(biāo)本采用4%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片等處理，進(jìn)行染色步驟。切片于65 ℃恒溫箱下烘烤2 h以上，進(jìn)行二甲苯及梯度酒精脫蠟、檸檬酸鈉煮沸15 min抗原修復(fù)操作、3%過氧化氫室溫避光孵育10 min。PBS沖洗，重復(fù)3次，滴加FBS，室溫孵育30 min后，甩去多余液體。滴加一抗(1∶50)，4 ℃冰箱保存過夜。每張組織切片用PBS清洗，滴加二抗，37 ℃溫箱中孵育30 min，后PBS沖洗，DAB試劑顯色5 min，鹽酸乙醇及蒸餾水洗片，梯度酒精及二甲苯脫水，中性樹脂封片，正置顯微鏡觀察。

1.4.2 染色結(jié)果判定 染色結(jié)果由兩位實(shí)驗(yàn)人員雙盲法觀察判定，采用半定量分析法計(jì)分。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞所占百分比，取平均值，陽性細(xì)胞百分比<10%為0分,10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。按照染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:無顯色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分，棕褐色為3分，將陽性細(xì)胞百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相乘，0～1分為(-)，2～4分為(+)，5～8分為(++)，9～12分為(+++)；(+)～(+++)者為陽性表達(dá)。

1.5 Western blot用含有蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液裂解組織，離心、取上清，提取組織蛋白。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)組織蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h。加入一抗(1∶500)，4 ℃冰箱孵育并過夜。洗膜后，加入二抗(1∶3 000)，輕吹混勻，室溫?fù)u床1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，曝光拍照，ImageJ軟件分析掃描結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示n(%)，組間比較采用卡方檢驗(yàn)，雙向有序變量的相關(guān)性采用Kendall相關(guān)分析，以P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARC患者的晶狀體上皮細(xì)胞中MST1蛋白表達(dá)水平升高免疫組化顯示，ARC組LECs的陽性表達(dá)率為90.0%，而正常組的陽性表達(dá)率為53.3%，兩組表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.64，P<0.01)(圖1A、表1)。此外，Western blot顯示，與正常組相比，ARC組晶狀體上皮細(xì)胞中的MST1表達(dá)水平升高(圖1B)。

表1 免疫組化中MST1蛋白的表達(dá)水平比較

圖1 MST1基因的蛋白水平的在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中呈現(xiàn)高表達(dá)

2.2 ARC患者的晶狀體上皮細(xì)胞中LATS1/2蛋白表達(dá)水平升高免疫組化顯示,ARC組LECs的陽性表達(dá)率為85.0%,而正常組的陽性表達(dá)率為46.7%，兩組表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.36，P<0.01)(圖2A、表2)。此外,Western blot顯示ARC組晶狀體上皮細(xì)胞中LATS1/2的蛋白水平升高(圖2B)。

表2 免疫組化中LATS1/2蛋白的表達(dá)水平比較

圖2 LATS1/2基因的蛋白水平的在年齡相關(guān)性白內(nèi)障中呈現(xiàn)高表達(dá)

2.3 ARC患者中MST1和LATS1/2的相關(guān)性分析Kendall等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)顯示，MST1與LATS1/2在ARC表達(dá)中呈中度正相關(guān)(Kendall’s tau-b=0.438)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見表3。

表3 MST1和LATS1/2在ARC中的相關(guān)陽性表達(dá)

3 討論

ARC又稱老年性白內(nèi)障，是最為常見的白內(nèi)障類型，我國(guó)每年新增數(shù)十至數(shù)百萬的白內(nèi)障患者。隨著社會(huì)老齡化的加速，ARC發(fā)病率也將進(jìn)一步增長(zhǎng)。目前來看，手術(shù)仍是治療白內(nèi)障最有效的方法，盡管白內(nèi)障手術(shù)被認(rèn)為是非常成功的，但手術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥不可避免地會(huì)導(dǎo)致不可逆的失明，因此白內(nèi)障仍然是一個(gè)巨大的全球健康負(fù)擔(dān)[7-8]。目前，ARC確切病因尚未完全研究清楚，一般認(rèn)為年齡、性別、職業(yè)、放射(可見光，紫外線，X線等)、氧化、物理損傷、飲食和用藥等均是其危險(xiǎn)因素[9]。近年來的研究表明，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是白內(nèi)障形成的共同細(xì)胞基礎(chǔ)，而H2O2產(chǎn)生的氧化自由基可引起晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[10]。因此，氧化應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制越來越引起學(xué)者的廣泛關(guān)注。

MST1最初于酵母細(xì)胞中得到鑒定，果蠅模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MST1參與HIPPO-LATS-YORK-IE信號(hào)通路并與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[11]。而Hippo信號(hào)通路是體內(nèi)參與調(diào)控器官生長(zhǎng)發(fā)育、增殖凋亡、調(diào)節(jié)器官大小體積平衡的重要的生長(zhǎng)控制信號(hào)通路[12]。因此，MST1作為Hippo信號(hào)通路的核心組件，通過磷酸化、二聚化以及核內(nèi)外定位等方式，在細(xì)胞分化、控制穩(wěn)態(tài)、促進(jìn)細(xì)胞黏附和遷移、抑制自噬、促進(jìn)凋亡等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[13]。Wei等人[3]研究發(fā)現(xiàn)MST1在體外誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激致視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ARC作為人類一種最常見的眼部衰老性疾病，而MST1作為細(xì)胞增殖及凋亡影響較大的一類指標(biāo)，推測(cè)其可能與ARC的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。多種研究表明，LATS1/2也是Hippo信號(hào)通路核心組件之一，受MST1的調(diào)控。在外來刺激下，MST1/2可被激活，發(fā)生磷酸化，隨后激活LATS1/2，而后激活Yap磷酸化(Yap-ser127)，至使磷酸化Yap滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無法進(jìn)入核內(nèi)產(chǎn)生效應(yīng)，最終泛素化降解。這一過程阻斷了Hippo反應(yīng)基因的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞凋亡[14-15]。因此，LATS1/2是否通過MST1/2的調(diào)控參與Hippo信號(hào)通路介導(dǎo)ARC的發(fā)生有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究的結(jié)果顯示,MST1和LATS1/2的蛋白水平在ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，Kendall等級(jí)相關(guān)分析得出，MST1與LATS1/2的表達(dá)具有正相關(guān)性，提示兩者在ARC的發(fā)展中具有協(xié)同關(guān)系，并且大量文獻(xiàn)也表明MST1可以調(diào)控LATS1/2參與疾病的發(fā)生。通過以上研究論述，我們發(fā)現(xiàn)了ARC患者晶狀體上皮細(xì)胞中MST1和LATS1/2的表達(dá)，為進(jìn)一步研究ARC的發(fā)病機(jī)制以及預(yù)防和治療提供了新的方向。