孫加燕，任 煜，劉婷婷

(安慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院,安徽 安慶 246052)

目前臨床心內(nèi)直視術(shù)、冠狀動脈搭橋術(shù)、動脈搭橋、心臟外科體循環(huán)、心肺腦復(fù)蘇以及器官移植等為了修復(fù)損傷結(jié)構(gòu)、恢復(fù)組織與器官的功能的手術(shù)，心肌均會經(jīng)歷缺血后再灌注過程[1]，而因此造成的心肌損傷常常會導(dǎo)致手術(shù)的失敗或不良后果的發(fā)生[2]。其發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前認為主要與細胞內(nèi)氧自由基的大量產(chǎn)生造成的氧化應(yīng)激損傷有一定關(guān)系[3]。鐵死亡是一種新型細胞死亡方式，不同于細胞凋亡、細胞壞死、細胞自噬，其本質(zhì)是鐵離子依賴性的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物大量堆積引發(fā)的以線粒體改變?yōu)橹鞯难趸瘧?yīng)激損傷，進而使鐵離子的攝取與排放失衡，誘發(fā)機體產(chǎn)生大量活性氧類與脂質(zhì)過氧化物，最終導(dǎo)致細胞鐵死亡。有大量研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡與心血管疾病及缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系[4]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是從葡萄、虎杖及花生等植物中分離提取出的一種抗氧化劑[5]，能抑制血小板凝集、抗組織纖維化，從而抑制和減輕心血管病的發(fā)生與發(fā)展[6]。經(jīng)Res預(yù)處理后可以緩解大鼠心肌損傷，但具體機制尚未明確。本研究通過探究Res對大鼠心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion，I/R)損傷心肌細胞鐵死亡的影響，探討Res改善心肌損傷的機制，為臨床心血管手術(shù)預(yù)防及改善心肌損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與藥物RES(Solarbio，中國)；ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；SYBR Green染料購自北京索萊寶科技有限公司；RNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；TFRl、IREB2、FTH以及 β-actin抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；組織鐵測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，

1.2 實驗動物SD大鼠均由江蘇艾菱菲生物科技有限公司提供，清潔級，體質(zhì)量為(210±10)g。采用標(biāo)準(zhǔn)飼料與飲用水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度保持在(25±2)℃，相對濕度保持在(40±2)%。

1.3 方法

1.3.1 動物培養(yǎng)與分組 選取清潔級健康SD大鼠72只，隨機分為假手術(shù)組(Sham組，n=12)、心肌缺血再灌注組(I/R組，n=12)、心肌缺血再灌注+白藜蘆醇低、中、高3劑量組(I/R+ResL組，I/R+ResM組，I/R+ResH組，n=12)、促紅細胞生成素組(EPO組，n=12)3組，其中促紅細胞生成素組作為陽性對照組。Sham組行假手術(shù)，I/R組、I/R+Res3組與EPO組進行心肌缺血再灌注損傷模型的制備。I/R+Res3組在I/R模型建立前分別連續(xù)7 d向大鼠腹腔注射白藜蘆醇0.5 mg/100 g、1.5 mg/100 g、3 mg/100 g，EPO組注射促紅細胞生成素300 u/100 g，Sham組與I/R組大鼠腹腔注射等容量的生理鹽水。

1.3.2 動物模型的建立 給藥7 d后，所有大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉，固定于手術(shù)臺上，連接肢體心電圖電極，經(jīng)口行氣管插管，連接呼吸機。備皮并消毒后行開胸術(shù)，暴露左心耳，在其下約1 mm處，用縫線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，可見結(jié)扎線以下心肌變白。心電圖實時監(jiān)測并記錄，ST段持續(xù)抬高說明造模成功，缺血45 min后解除結(jié)扎線，再灌注2 h。以ST段下移及缺血心肌漸恢復(fù)紅潤為再灌注成功標(biāo)志。

1.3.3 TTC染色 待觀測大鼠心肌缺血再灌注情況完畢后當(dāng)日，將大鼠斷頭處死，取心肌組織用生理鹽水沖洗干凈后保存于-20 ℃冰箱中冷凍30 min，隨后取出大鼠心肌組織置于專用的槽中，以厚度為2 mm進行切片，之后避光放置于2% TTC溶液中37 ℃恒溫孵育20 min以確保進行均勻染色，染色后取出樣本置于10%甲醛溶液中固定24 h后進行拍照攝片。

1.3.4 HE病理學(xué)染色 待觀測大鼠心肌缺血再灌注情況完畢后當(dāng)日，收集各組大鼠心肌組織樣品，并在冰冷條件下完成均質(zhì)化，隨后進行切片制成組織標(biāo)本，然后通過蘇木精染液與伊紅染液進行染色，以此觀察心肌組織病理狀態(tài)。

1.3.5 免疫印跡試驗(Western Blot) 待觀測大鼠心肌缺血再灌注情況完畢后當(dāng)日，收集各組大鼠心肌組織樣品，將大鼠心肌組織500 mg通過組織破碎儀加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑提取總蛋白，提取出的蛋白放入10 mL EP 管中，然后向其中加入5倍體積的十二烷基磺酸鈉，混勻后放入95～100 ℃沸水中水煮變性，冷卻后放入-20 ℃?zhèn)溆?。每次向?zhǔn)備好的電泳配件中加入10 μL蛋白，設(shè)置 電泳條件為80 V恒壓，30 min，結(jié)束后改變電泳條件為120 V恒壓，50～60 min。當(dāng)所需的蛋白分子量所在區(qū)域有一定分離度時可提前停止電泳。之后進行轉(zhuǎn)模，條件為200 mA恒流，按分子量確定時間。轉(zhuǎn)膜后分別孵育轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFRl)、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2(IREB2)以及鐵蛋白重鏈(FTH)抗體與相對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后將含有蛋白標(biāo)記的膜洗凈，涂上化學(xué)發(fā)光顯影液通過顯影儀拍照，對結(jié)果用ImageJ軟件對灰度值進行系統(tǒng)性分析。

1.3.6 血清乳酸脫氫酶(LDH )和肌酸激酶同工酶(CK-MB )濃度的測定 待觀測大鼠再灌注過程2 h后，采集其腹主動脈血，以3 200～4 000 r/min條件離心后取上清液作為樣品，隨后通過ELISA試劑盒檢測各組樣品中心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH與CK-MB的濃度來確定大鼠缺血再灌注后心肌損傷的程度。同時通過免疫組化檢測心肌組織中LDH的表達，其陽性染色為黃色至棕色。

1.3.7 心肌細胞內(nèi)鐵沉積情況 待觀測大鼠心肌缺血再灌注情況完畢后當(dāng)日，收集各組大鼠心肌組織樣品，通過鐵測定試劑盒對手術(shù)后各組心肌組織樣本進行檢測。使用分光光度計記錄樣品在520 nm處的光密度(OD)值，通過比較各組OD值確定樣品中的組織鐵含量水平。

1.3.8 實時熒光定量試驗(Real-timePCR ) 待觀測大鼠心肌缺血再灌注情況完畢后當(dāng)日，收集各組大鼠心肌組織樣品，將大鼠心肌組織于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機進行勻漿處理。室溫放置后10 000 g離心15 min，轉(zhuǎn)移水相，加入等體積異丙醇后再次離心10 min，棄上清液。加預(yù)冷75%乙醇溶液洗滌，棄上清后風(fēng)干，加入40～200 μL的無酶水溶解制得RNA備用。通過制備的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與上下游引物混合離心(引物序列見表1)，隨后于PCR儀上進行擴增，循環(huán)完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值(Ct值)進行相對定量分析，比較各組心肌組織mRNA的表達水平。

表1 所選基因引物序列

1.3.9 流式細胞術(shù)檢測ROS 待觀測大鼠心肌缺血再灌注情況完畢后當(dāng)日,收集各組大鼠心肌細胞,處理后加入含有熒光探針的DCFH-DA孵育,清洗后流式細胞儀上機檢測細胞內(nèi)ROS含量(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理選用SPSS 24.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以 “均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 ”描述，使用t檢驗。當(dāng)P<0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TTC染色檢測心肌梗死水平Sham組大鼠心肌正常，I/R組(67.3±3.4)%及I/R+ResL組(44.5±5.8)%心肌梗死區(qū)域明顯，I/R+ResM組(12.6±1.4)%、I/R+ResH組(10.8±1.7)%與EPO組(5.3±0.8)%心肌梗死區(qū)域明顯低于I/R組(圖1)。

圖1 TTC染色結(jié)果

2.2 HE病理染色結(jié)果Sham組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，胞漿染色均勻，無明顯肌纖維裂狀；I/R組心肌細胞核不規(guī)則，可見纖維間中性粒細胞，且心肌細胞間間隔較大，胞漿染色不均勻；與I/R組相比，I/R+ResM組病理染色情況較為改善(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌細胞HE染色

2.3 RES對大鼠鐵死亡蛋白水平的影響與Sham組相比，I/R組與I/R+ResL組TFRl、IREB2以及FTH表達水平均明顯上升(P<0.05)；與I/R組相比，I/R+ResL組TFRl、IREB2以及FTH的蛋白表達水平無統(tǒng)計學(xué)差異，I/R+ResM組、I/R+ResH組與 EPO組蛋白表達水平均明顯下降，存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，且I/R+ResM組與I/R+ResH組間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)。

圖3 各組大鼠心肌細胞中TFRl、IREB2與FTH的蛋白水平

2.4 大鼠缺血再灌注后血清LDH與CK-MB濃度的測定與Sham組行假手術(shù)大鼠相比，I/R組、I/R+ResL、I/R+ResM、I/R+ResH組和EPO組大鼠血清中CK-MB與LDH的水平均明顯升高；同時I/R+ResL、I/R+ResM、I/R+ResH組和EPO組血清中CK-MB與LDH的水平均明顯低于I/R組(P<0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠血清LDH與CK-MB水平比較

2.5 各組大鼠心肌組織鐵含量檢測與Sham組相比,I/R組和I/R+ResM組心肌組織中鐵含量明顯升高，與I/R組相比，I/R+ResM組心肌組織中鐵含量明顯降低(見表3、圖4)。

表3 各組大鼠心肌組織鐵含量檢測情況

圖4 各組大鼠心肌細胞普魯士藍染色

2.6 Res對大鼠心肌細胞中TFRl、IREB2與FTH的mRNA水平影響采用RT-PCR技術(shù)觀察鐵相關(guān)基因轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(TFRl)、鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2(IREB2)以及鐵蛋白重鏈(FTH)的mRNA表達水平的變化，與Sham組相比，I/R組和I/R+ResM組TFRl、IREB2以及FTH水平均有所上升；與I/R組相比，I/R+ResM組TFRl、IREB2以及FTH的mRNA表達水平均明顯下降(圖5)。

圖5 各組大鼠心肌細胞中TFRl、IREB2與FTH的mRNA水平

2.7 Res對大鼠心肌細胞中ROS含量影響與Sham組相比，I/R組ROS熒光強度明顯增強，與I/R組相比，I/R+ResM組ROS熒光強度明顯降低(圖6)。

圖6 各組大鼠心肌細胞ROS含量

3 討論

目前缺血性心臟病以及急性心肌梗死等一些疾病仍是臨床心臟疾病患者死亡的主要原因,其主要病因多為冠狀動脈狹窄或堵塞導(dǎo)致的心肌缺血[7],對其早期治療方法主要為通過動脈搭橋、心臟外科體循環(huán)、心肺腦復(fù)蘇以及器官移植等方法使心臟組織缺血后重新得到血液再灌注[8]。大量的臨床研究表明，缺血再灌注可以通過恢復(fù)氧氣與血液供給、進行細胞代謝來修復(fù)損傷結(jié)構(gòu)、恢復(fù)組織與器官的功能，最終達到使患者病情好轉(zhuǎn)的目的[9]。但另一些臨床研究發(fā)現(xiàn)，缺血后再灌注同樣會造成組織、器官的功能紊亂與結(jié)構(gòu)損傷,甚至發(fā)生不可逆性損傷。缺血再灌注損傷的發(fā)生機制較為復(fù)雜，但大多涉及到活性氧突然大量增加，從而導(dǎo)致細胞膜磷脂的損傷、蛋白質(zhì)的聚合、肽鏈的斷裂以及細胞外基質(zhì)中膠原纖維的膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)，使透明質(zhì)酸降解，從而引起基質(zhì)變得疏松，彈性下降[10]。在心肌缺血再灌注過程中，心肌梗死標(biāo)記物CK-MB與LDH變化情況可作為心肌缺血再灌注模型建立的評價標(biāo)準(zhǔn)。本研究通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支后再灌注血液，心肌酶學(xué)變化結(jié)果表明，當(dāng)缺血再灌注后大鼠心肌組織中CK-MB與LDH濃度均明顯升高，提示心肌缺血再灌注模型制備成功。

白藜蘆醇作為非黃酮類多酚有機化合物，能通過清除氧自由基發(fā)揮抗氧化及心血管保護作用[11]。在本研究中，經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后缺血再灌注后大鼠心肌組織中CK-MB與LDH濃度有所下降，這一過程一方面可能與白藜蘆醇能通過影響缺血再灌注大鼠心肌組織中丙二醛的表達以及血紅素加氧酶-1的水平發(fā)揮其抗氧化作用，從而保護心肌組織有關(guān)[12]。另一方面，白藜蘆醇或許也能夠通過抑制心肌細胞內(nèi)Ca2+的濃度減弱應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮保護作用[13]。

鐵死亡是一種新型的鐵離子依賴性細胞死亡方式，其一大特征是細胞內(nèi)氧化堆積。有研究發(fā)現(xiàn)，鐵和脂質(zhì)過氧化物的水平與鐵死亡具有密切聯(lián)系，過量的鐵會引起細胞損傷，并參加脂質(zhì)過氧化物自由基的形成，從而引發(fā)細胞鐵死亡[14]。這一過程可能是由于心肌缺血再灌注導(dǎo)致的氧化堆積促使細胞外的鐵蛋白進入細胞內(nèi)，同時抑制鐵離子的正常代謝，造成細胞內(nèi)鐵含量蓄積升高，最終導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生鐵蛋白自噬[15]，引發(fā)細胞釋放大量的游離鐵，增加細胞損傷，最終造成細胞鐵死亡的發(fā)生。

為了探究白藜蘆醇對心肌細胞損傷鐵死亡的影響，本研究通過在大鼠缺血再灌注前應(yīng)用白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)與單純I/R組相比，白藜蘆醇的應(yīng)用能顯著抑制TFRl、IREB2與FTH的mRNA與蛋白水平的表達，結(jié)果表明抑制水平與劑量呈正相關(guān)，但當(dāng)白藜蘆醇濃度提升至1.5 mg/100 g后其可觀測到平臺期效應(yīng)。此外細胞內(nèi)鐵離子含量被觀測到顯著降低，這一過程可能是由于對于存在大量鐵離子的心肌細胞，白藜蘆醇能夠通過抑制心肌細胞鐵攝取速度與效果、提升細胞內(nèi)鐵代謝效率及抑制鐵蛋白自噬，從各種離子通道降低心肌細胞內(nèi)聚集的大量鐵離子，避免游離鐵被釋放造成損傷，從而避免引起大鼠心肌細胞鐵死亡的發(fā)生。組織鐵檢測試劑盒與ROS熒光結(jié)果也說明了白藜蘆醇能降低細胞內(nèi)的鐵含量。雖然應(yīng)用白藜蘆醇后心肌細胞內(nèi)鐵含量仍高于正常未損傷心肌細胞，但可以在一定程度上通過抑制鐵死亡來減輕心肌缺血再灌注引起的損傷。

綜上所述，本研究通過建立缺血再灌注大鼠模型，通過應(yīng)用白藜蘆醇發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以有效改善心肌細胞損傷后的鐵離子相關(guān)基因TFRl、IREB2與FTH的表達，從而抑制心肌細胞鐵攝取、提高鐵代謝以及抑制鐵蛋白自噬，改善心肌組織由于缺血再灌注導(dǎo)致的鐵過量引發(fā)心肌細胞鐵死亡造成的損傷，發(fā)揮保護心肌組織的作用。本研究為開展白藜蘆醇的心肌保護作用提供了新的思路與研究證據(jù)。