吳 丹，初文竹，邱羽菲，潘 宇，曹志琴1，，史嘉翊1，

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院；3.牡丹江市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科,黑龍江 牡丹江157011)

有規(guī)則的簇生間隔短回文重復(fù)(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)-Cas systems是一種細(xì)菌和古細(xì)菌的防御系統(tǒng),可以用于抵抗噬菌體入侵DNA[1-2]。CRISPR-Cas系統(tǒng)由兩個(gè)關(guān)鍵的部分組成，其可以對(duì)噬菌體和質(zhì)粒進(jìn)行免疫，一種為效應(yīng)模塊，它可以將遺傳物質(zhì)送入CRISPR陣列生成CRISPR RNAs(crRNAs)，另一種適和效應(yīng)模塊在crRNA的引導(dǎo)下，可以靶向并切割入侵的核酸[3-5]。

Cas9是一個(gè)分子量較大的多區(qū)域核酸酶，它可以通過(guò)識(shí)別目標(biāo)DNA上的前間區(qū)序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif，PAM)序列，極保守的識(shí)別并裂解目標(biāo)DNA[6-8]。C2c1在是CRISPR-Cas系統(tǒng)中的V-B亞型。C2c1可以通過(guò)雙RNA引導(dǎo)的DNA內(nèi)切酶，具有雙鏈DNA切割活性。生物化學(xué)研究表明，與最小的78 nt tracrRNA結(jié)合的crRNA或一個(gè)融合的sgRNA都足以使C2c1介導(dǎo)的DNA裂解。一個(gè)14nt直接重復(fù)序列(direct Repeat，DR)與tracrRNA雜交形成一個(gè)crRNA:tracrRNA雙鏈，然后裝載到C2c1上，引導(dǎo)識(shí)別和切割DNA。C2c1通過(guò)識(shí)別原間隔序列50末端富含t(T-rich)的PAM，介導(dǎo)DNA干擾，并且C2c1已被證明在人細(xì)胞裂解液中具有內(nèi)切酶活性[9]。

本研究在前期研究[10]基礎(chǔ)上對(duì)BthC2c1的基因剪切能力進(jìn)行了評(píng)估，以期為改造開(kāi)發(fā)新的基因編輯工具奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 材料BthC2c1蛋白(前期表達(dá)純化),293T人腎上皮細(xì)胞與DF-1雞成纖維細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)所用表達(dá)載體(醫(yī)藥研究中心所有)，本研究所用小鼠為DBF1小鼠。

1.2 主要試劑及儀器酵母提取物、蛋白胨(Oxoid)；基因組提取試劑盒(康為世紀(jì))，NaCl(Solarbio)；咪唑(Solarbio)；IPTG(biofroxx)；PMSF(Ther-mo Scientific);Ni-NTA Agarose(上海凱杰生物)；胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM(Hy-Clone)、蛋白分子量Marker(Bio-rad);凝膠成像系統(tǒng)G-BOX Chemi XR5(Gene Company Limited)；細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱(SANYO)；蛋白電泳裝置(Bio-rad)；離心機(jī)(Thermo)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存細(xì)胞，37 ℃水浴約2 min，迅速解凍細(xì)胞。以下操作皆在超凈臺(tái)中進(jìn)行：將3 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入細(xì)胞中；低速離心5 min后棄培養(yǎng)基，再加入4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后接于含有10%胎牛血清的DMEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，均勻搖晃后于飽和水分的37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞密度至70%～80%，在37 ℃下用0.25%的胰酶消化1 min，而后加入4 mL的含10%胎牛血清的DMEM來(lái)終止消化。重懸后稀釋到新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)皿中，及時(shí)更換培養(yǎng)基。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選擇兩種細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別為人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞和雞成纖維細(xì)胞DF-1。人源細(xì)胞選擇了EMX1基因，雞源細(xì)胞選擇了MSTN，在所選基因上選擇合適的靶點(diǎn)，根據(jù)靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)人工合成5′端帶有不同酶切位點(diǎn)識(shí)別序列的靶序列寡核苷酸引物，通過(guò)PCR對(duì)引物直接退火，合成出攜帶不同的黏性末端的靶序列DNA短片段，將其插入到載體pU6-BtsgRNA上，轉(zhuǎn)染所用BthC2c1蛋白表達(dá)載體為BthC2c1-NLS-Flag/PCDNA3.4,轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中選擇Cas9作為對(duì)照，轉(zhuǎn)染時(shí)具體所轉(zhuǎn)質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染順序見(jiàn)表1、表2。具體實(shí)驗(yàn)方法如下:以人腎上皮細(xì)胞293T為例，將CRISPR蛋白質(zhì)粒與含有相應(yīng)sgRNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入已經(jīng)鋪好293T細(xì)胞的12孔板，細(xì)胞濃度2×105/孔。設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照(轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染不含有sgRNA的空載體質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)染48～72 h。具體操作如下:(1)DNA 1.5 μg加無(wú)抗opti-MEM定容至100 μL；(2)lipo2000 5 μL加無(wú)抗opti-MEM定容至100 μL,5 min室溫靜置；(3)混勻步驟1和步驟2中的樣品，室溫放置30 min；(4)將孔中的培養(yǎng)基吸出，換成不含有胎牛血清或抗生素的DMEM/opti-MEM 150 μL；(5)將步驟3混勻的樣品加入孔中，輕轉(zhuǎn)搖勻，置于37 ℃培養(yǎng)箱；(6)4 h后，將無(wú)抗培養(yǎng)基吸出，每孔加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基1 mL。

表1 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒

表2 DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用質(zhì)粒

1.3.3 小鼠胚胎的獲取

1.3.3.1 超數(shù)排卵 (1)取健康、活潑的DBF1雌鼠，每只注射5 IU PMSG；(2)48 h后每只再注射5 IU hCG，注射后使其與活潑、健康的DBF1雄性小鼠交配過(guò)夜；(3)交配后次日，將檢測(cè)陰道栓后標(biāo)記小鼠。

1.3.3.2 受精卵的收集 (1)提前將M16、M2培養(yǎng)基和石蠟油37 ℃預(yù)熱；(2)在交配次日早上將標(biāo)記過(guò)的母鼠引頸處死，挑取輸卵管部位放入M2培養(yǎng)基中；(3)將成團(tuán)的受精卵移至1%透明質(zhì)酸酶中消化1～2 min；(4)將單個(gè)的受精卵移至預(yù)熱M2中，清洗3～5次；(5)將受精卵移入M16培養(yǎng)基中，至于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中約3 h，培養(yǎng)至原核清晰后進(jìn)行顯微注射。

1.3.4 T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)酶切活性

1.3.4.1 細(xì)胞酶切活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行收集。細(xì)胞全基因組利用柱式基因組提取試劑盒來(lái)提取。以提取的全基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增含有所選基因切割靶點(diǎn)的序列。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳。靶點(diǎn)片段膠回收。37 ℃ T7E1酶切反應(yīng)20～45 min，每個(gè)樣品均平行退火兩管，一管在退火后加入T7E1酶(標(biāo)示為1～8)，另一管不加T7E1酶作為對(duì)照(標(biāo)示為C1～C8)，酶切產(chǎn)物加10 μL 2×RNA loading，5%尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.3.4.2 小鼠胚胎酶切活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn) SpyCas9為對(duì)照。首先根據(jù)小鼠EMX1基因設(shè)計(jì)兩條BthC2c1的sgRNA，命名為Bth-EMX1-1、Bth-EMX1-2，根據(jù)小鼠Kdm2b基因設(shè)計(jì)SpyCas9的sgRNA，命名為Spy-Kdm2b-9，將sgRNA體外轉(zhuǎn)錄并純化出來(lái)。作為對(duì)照試驗(yàn)，純化BthC2c1野生型蛋白及SpyCas9野生型蛋白，先在體外進(jìn)行酶切驗(yàn)證。然后將BthC2c1、SpyCas9蛋白與相應(yīng)的sgRNA混合，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析裝配為蛋白-sgRNA復(fù)合物，通過(guò)超數(shù)排卵，將復(fù)合物通過(guò)顯微注射進(jìn)入小鼠胚胎中，培養(yǎng)72 h后裂解，通過(guò)T7E1實(shí)驗(yàn)觀察BthC2c1的酶切活性。BthC2c1在小鼠胚胎內(nèi)的酶切活性通過(guò)T7E1法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)靶片段進(jìn)行退火時(shí)，每個(gè)樣品均平行退火兩管，一管在退火后加入T7E1酶(標(biāo)示為1、2、9)，另一管不加T7E1酶作為對(duì)照(標(biāo)示為C1、C2、C9)。

2 結(jié)果

2.1 人腎上皮細(xì)胞293T細(xì)胞由圖1所示:在293T細(xì)胞中，Cas9對(duì)EMX1基因有明顯的切割，而B(niǎo)thC2c1對(duì)于EMX1基因的切割并不明顯，未見(jiàn)明顯條帶。

圖1 BthC2c1在293T細(xì)胞中酶切活性檢測(cè)結(jié)果

2.2 雞成纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞由圖2結(jié)果顯示:在DF-1細(xì)胞中，Cas9在guide2 sgRNA介導(dǎo)下對(duì)MSTN基因有明顯的切割，而B(niǎo)thC2c1對(duì)于MSTN基因的切割并不明顯，未見(jiàn)明顯條帶。

圖2 BthC2c1在DF-1細(xì)胞中酶切活性檢測(cè)

2.3 小鼠胚胎sgRNA體外檢測(cè)結(jié)果圖3結(jié)果顯示:BthC2c1的兩條sgRNA均可以介導(dǎo)蛋白剪切底物DNA，SpyCas9的sgRNA也可以介導(dǎo)蛋白剪切底物。

圖3 BthC2c1和SpyCas9體外酶切活性檢測(cè)

2.4 小鼠胚胎內(nèi)檢測(cè)結(jié)果在小鼠胚胎內(nèi)的酶切活性檢測(cè)結(jié)果表明:SpyCas9可以在sgRNA的介導(dǎo)下剪切靶基因片段，電泳后可以看到清晰的酶切產(chǎn)物兩條條帶，而B(niǎo)thC2c1對(duì)靶基因片段剪切不明顯(圖4)。

圖4 BthC2c1在小鼠胚胎中酶切活性檢測(cè)

3 討論

CRISPR-Cas系統(tǒng)是近年來(lái)熱門(mén)的基因編輯技術(shù)。C2c1作為更小分子，脫靶效應(yīng)更低和識(shí)別要求更高等特點(diǎn)的一類編輯系統(tǒng)有著廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)階段科研人員已完成了對(duì)C2c1系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的解析。通過(guò)改造CRISPR-C2c1系統(tǒng)也獲得了多種可以用于基因編輯的工具。Teng等開(kāi)發(fā)的AaC2c1能夠有效地在小鼠胚胎中引入有針對(duì)性插入缺失的突變，并成功地將種系其傳遞給下一代，且與在細(xì)胞系和小鼠中都均未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)[11]。而后又開(kāi)發(fā)了AmC2c1、BhC2c1、Bs3C2c1和LsC2c1四種CRISPR-C2c1系統(tǒng)可以對(duì)人類基因組進(jìn)行編輯，使用多個(gè)sgRNAs可以精確的同時(shí)編輯人類基因組中的多個(gè)位點(diǎn)[12]。Jonathan等通過(guò)突變BhC2c1，得到BhC2c1 v4可以促進(jìn)了人類細(xì)胞系和原代人T細(xì)胞的體外基因組編輯，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)其相比Cas9具有更高的特異性和更低的脫靶效應(yīng)[13]。WuF使用CRISPR-C2c1系統(tǒng)對(duì)擬南芥進(jìn)行了基因編輯，成功實(shí)現(xiàn)了多重基因組編輯和大片段的基因敲除[14]。而后緊接著Wang使用CRISPR-C2c1系統(tǒng)在棉花中成功進(jìn)行了基因編輯，并且在基因測(cè)序后未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)[15]。

前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)，BthC2c1剪切DNA的產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生黏性末端，斷裂位點(diǎn)遠(yuǎn)離PAM，與Cpf1相似，卻與Cas9剪切靶DNA位點(diǎn)鄰近PAM不同。同時(shí)，Cas9、NHEJ修復(fù)時(shí)會(huì)導(dǎo)致堿基插入或缺失，使得PAM鄰近序列被更改，使Cas9無(wú)法再次識(shí)別和剪切靶DNA。而B(niǎo)thC2c1和Cpf1剪切DNA位點(diǎn)遠(yuǎn)離PAM，NHEJ修復(fù)不會(huì)改變PAM鄰近序列，仍可識(shí)別和切割靶基因，使得基因編輯效率得到提高。此外，Cas9與Cpf1剪切靶DNA的斷裂位點(diǎn)都位于介導(dǎo)RNA-靶DNA異源雙鏈以內(nèi)，而B(niǎo)thC2c1剪切靶DNA時(shí)斷裂位點(diǎn)位于異源雙鏈以外，對(duì)異源雙鏈影響很小，這種穩(wěn)定的剪切模式可能還適用于對(duì)同一特定位點(diǎn)進(jìn)行多次剪輯[10]。

基于之前研究對(duì)CRISPR-C2c1編輯系統(tǒng)BthC2c1的結(jié)構(gòu)和作用原理的解析，本研究進(jìn)一步探討了CRISPR-C2c1編輯系統(tǒng)的基因剪切能力。兩種細(xì)胞中Spcas9可以通過(guò)T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到底物剪切，Bthc2c1剪切不明顯；為小鼠胚胎設(shè)計(jì)的Spycas9-sgRNA和Bthc2c1-sgRNA在體外均可以剪切底物，在體內(nèi)Spycas9系統(tǒng)可以檢測(cè)到剪切，Bthc2c1剪切不明顯。溫度可能會(huì)影響B(tài)thC2c1在動(dòng)物細(xì)胞基因編輯功能，前期研究發(fā)現(xiàn)42 ℃時(shí)BthC2c1具有更好的酶切效率，或許對(duì)于耐熱植物會(huì)有很好的編輯優(yōu)勢(shì)，所以接下來(lái)嘗試在一些耐熱植物中進(jìn)行編輯效率的評(píng)估?；诮Y(jié)構(gòu)信息，可以對(duì)BthC2c1系統(tǒng)進(jìn)行改造，以擴(kuò)大其編輯的應(yīng)用范圍。由于BthC2c1的剪切能力依賴于溫度，溫度可能作為啟動(dòng)基因編輯的開(kāi)關(guān)，通過(guò)溫度變化來(lái)進(jìn)行基因編輯的動(dòng)態(tài)控制，可能成為一種新的基因編輯控制工具，提供基因編輯新的思路。