代玉梅 張昭勇 （廣州醫(yī)科大學附屬婦女兒童醫(yī)療中心臨床檢驗部，廣州市兒研所，廣州510623）

肺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，已成為我國癌癥死亡的首要病因，且年發(fā)病率和病死率仍呈增長趨勢。過去20年，肺癌尤其是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）治療取得了重要進展，但總體治愈率和存活率仍較低，轉移性肺癌療效、預后更差［1］。

γδ T 細胞在機體抗腫瘤與抗感染免疫中發(fā)揮重要作用，主要包括Vδ1 T細胞和Vδ2 T細胞（即Vγ 9Vδ2 T 細胞）兩個最重要的亞群。前者主要存在于黏膜相關淋巴組織和上皮組織，經(jīng)膜抗原識別受體TCR 及NKG2D 直接識別并殺傷靶細胞，是抵御消化道、呼吸道、食管等黏膜相關淋巴組織惡變的第一道防線；后者是循環(huán)γδ T 細胞的主要組成部分，占外周血循環(huán)γδ T 細胞的50%～95%，經(jīng)與NK細胞相似的細胞毒作用、免疫分泌、免疫調節(jié)等多種方式參與免疫應答，在機體抗腫瘤及抗感染免疫應答中發(fā)揮重要作用。

諸多研究表明，人γδ T 細胞在體內發(fā)揮的重要天然免疫監(jiān)視作用受宿主細胞表面表達的多種保守的、腫瘤或感染相關內源性應激分子精密調控。這些內源性應激分子包括目前已知的主要組織相容性分子鏈相關抗原A/B（MICA/B）、UL 結合蛋白（UL binding protein，ULBP）、熱休克蛋白（hot shock protein，HSP）、低分子量磷酸化抗原（low molecular weight phospho-antigen，Low-MW pAg）等。人MutS同源蛋白2（human MutS homologue 2，hMSH2）是本課題組前期鑒定的能被Vγ9Vδ2 T 細胞識別的腫瘤相關內源性新蛋白配體，在正常上皮組織細胞表面表達較低或幾乎無表達，但在上皮來源腫瘤細胞表面存在較為普遍的膜異位表達，且不同組織來源上皮腫瘤細胞膜異位表達程度不一［2］。這種異位表達在上皮來源腫瘤細胞表面的hMSH2 被TCRγδ 和NKG2D 識別后可顯著上調Vγ9Vδ2 T 細胞對靶腫瘤細胞的殺傷作用，促進機體腫瘤免疫應答［2-3］。

本課題組前期在肺癌細胞系NCI-H520 的全細胞裂解液和培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)存在可溶性（soluble，s）hMSH2，推測肺癌患者血清可能存在hMSH2 的可溶形式并與肺癌的天然免疫監(jiān)視及免疫逃逸有關［4］。本研究檢測并比較肺癌、肺結節(jié)及健康人群血清shMSH2 表達，并進一步探討其表達與肺癌患者年齡、性別、吸煙史［5-6］、家族史及常見肺癌血清輔助診斷標志物C-反應蛋白（C-reaction protein，CRP）、血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、角質蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA21-1）、癌胚抗原（carcinoma-embryonic antigen，CEA）及神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）水平的相關性，為揭示shMSH2 在肺癌血清中的表達、影響因素及其在肺癌天然免疫中的作用和意義提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 血清樣本收集自中山大學腫瘤防治中心，-80 ℃分裝貯存。肺癌、肺結節(jié)及健康對照人群納入標準如下。肺癌組：①依據(jù)人民衛(wèi)生出版社第8版《內科學》所列肺癌診斷標準確診的肺癌患者；②有完整臨床病歷資料；③入組者依據(jù)2009年7 月國際肺癌研究學會（IASLC）公布的第7 版肺癌TNM 分期系統(tǒng)進行臨床分期。肺結節(jié)組：①依據(jù)人民衛(wèi)生出版社第8版《內科學》所列肺結節(jié)診斷標準確診的肺結節(jié)患者；②有完整臨床病歷資料。健康對照組：①影像學檢查無任何肺部腫瘤提示；②無家族遺傳病史；③基本資料完整。血清標本收集及臨床病歷資料采集均經(jīng)受試者同意并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑與儀器 hMSH2 ELISA 定量檢測試劑盒（OKEH01843，北京AVIVA 生物技術有限公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；KHBST-360 酶標儀（深圳愛康公司）；PW-960（D）洗板機（深圳匯深公司）。

1.2 方法 凍存樣本置于4 ℃過夜融化。shMSH2定量分析嚴格按ELISA試劑盒說明書進行。正式實驗前將所需試劑、微孔板預平衡至室溫并按要求提前2 h 預配制標準品（5 000 pg/ml 貯存液梯度稀釋）和足量Biotinylated MSH2 Detector Antibody（1×）、HRP-Avidin Conjugate（1×）、Washing Buffer（1×）、Streptavidin-HRP（1×）試劑。按說明書100 μl/孔加入標準品或血清樣品，設置2個平行復孔，37 ℃孵育2 h。開蓋棄液后加入100 μl 預配制的Biotinylated MSH2 Detector Antibody（1×）37 ℃孵育1 h。再次棄液后用Washing Buffer（1×）機洗3 次，300 μl/孔；拍凈余液后加入HRP-Avidin Conjugate（1×）37 ℃孵育1 h。機洗5次后加入90 μl TMB底物37 ℃避光孵育15～30 min 后加入50 μl 終止液，混勻后檢測A450/A540，根據(jù)標準曲線計算shMSH2的血清濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad Prism 7.2 軟件統(tǒng)計制圖。除肺癌血清常用腫瘤輔助診斷標志物表達以mean±SD顯示外，其他數(shù)據(jù)均以mean±SE顯示。組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗、Mann-Whitney檢驗或One-way ANOVA 等統(tǒng)計學方法進行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者血清shMSH2 表達 ELISA 結果顯示，肺癌、肺結節(jié)及健康對照人群血清均存在不同水平的shMSH2 表達。其中，肺癌患者血清shMSH2表達為（682±76）pg/ml，明顯低于肺結節(jié)組［（796±114）pg/ml］和健康對照組［（762±62）pg/ml］，但組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 肺癌患者血清shMSH2表達Fig.1 Serum shMSH2 expression in patients with lung cancer

2.2 影響肺癌患者血清shMSH2表達的因素

2.2.1 肺癌類型的影響 肺鱗癌、肺腺癌是肺癌的兩種主要組織類型。明確分型的39 例研究對象中，肺鱗癌約占12.8%（5/39），肺腺癌約占66.7%（26/39），提示華南地區(qū)肺癌分布的組織類型以腺癌為主。ELISA 定量分析結果顯示，肺鱗癌患者血清shMSH2 表達［（748±227）pg/ml］明顯高于肺腺癌患者［（608±123）pg/ml］。其他類型肺癌患者血清shMSH2 表達如下：小細胞肺癌（764±249）pg/ml，大細胞肺癌740 pg/ml，腺鱗癌926 pg/ml，淋巴上皮型肺癌847 pg/ml，外周型肺癌（563±395）pg/ml，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 肺癌組織類型對shMSH2表達的影響Fig.2 Effect of lung cancer different histotype on shMSH2 expression

2.2.2 肺癌轉移的影響 圖3 所示為肺癌轉移與肺癌患者血清shMSH2 表達的關系。除T3 外，T1a～T2b 至T4 期shMSH2 表達呈逐漸升高趨勢，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 肺癌轉移對shMSH2表達的影響Fig.3 Effect of lung cancer metastasis on shMSH2 expression

2.2.3 吸煙史、家族史的影響 將肺癌受試者按是否有吸煙史、家族史分組，比較組間血清shMSH2表達差異，結果顯示，有吸煙史肺癌患者血清shMSH2 表達［（592±99）pg/ml］明顯低于無吸煙史肺癌患者［（757±113）pg/ml］，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；有癌癥家族史肺癌患者血清shMSH2表達［（649±88）pg/ml］明顯低于無癌癥家族史肺癌患者［（714±164）pg/ml］，組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 肺癌患者吸煙史/癌癥家族史對shMSH2表達的影響Fig.4 Effect of smoking history/family history on shMSH2 expression

2.2.4 常用肺癌血清診斷標志物與shMSH2 表達常用肺癌診斷相關血清學診斷標志物LDH、CRP、SAA、CYFRA21-1、CEA 及NSE 分析結果見表1。其中，SAA、CYFRA21-1、CEA 三項指標均值均高出正常范圍。相關性分析結果顯示，肺癌患者血清shMSH2 表達與上述腫瘤相關血清標志物表達無顯著相關性（P＞0.05，圖5）。

表1 肺癌患者血清常見腫瘤標志物表達（）Tab.1 Common serum biomarkers in patients with lung cancer（）

表1 肺癌患者血清常見腫瘤標志物表達（）Tab.1 Common serum biomarkers in patients with lung cancer（）

Items LDH/（U·L-1）CRP/（mg·L-1）SAA/（mg·L-1）CYFRA21-1/（ng·ml-1）CEA/（ng·ml-1）NSE/（ng·ml-1）Concentration 187.14±87.50 7.19±14.42 27.67±50.86 6.59±12.23 16.75±39.24 14.42±13.34 Reference interval 109～245＜10 0.068～8.200＜3.3＜5.0＜16.3

圖5 肺癌患者血清shMSH2表達與常見腫瘤標志物的相關性分析Fig.5 Relationship between serum shMSH2 expression and common serum lung cancer biomarkers

3 討論

肺癌是癌癥死亡的主要原因。因肺癌病例異質性所致的可適性生長降低了治療成功率，但也促進了基于新抗原、肺癌基質、免疫細胞、靶向基因和白細胞分化抗原等個性化生物療法的出現(xiàn)和發(fā)展，以及對因治療誘導的肺癌進行性轉移及預后相關臨床結局生物標志物的探索研究［7-12］。

hMSH2 是本課題組前期研究鑒定出的一個內源性、應激性腫瘤和EBV 感染相關蛋白抗原，在上皮來源腫瘤及EBV 感染細胞表面存在較廣泛的異位表達［2-3，13］。這種異位表達的膜hMSH2 作為腫瘤及EBV感染相關的內源性配體參與Vδ2 T細胞介導的抗腫瘤免疫應答［2，13］。已有研究發(fā)現(xiàn)Vδ2 T 細胞識別的某些配體的可溶形式參與介導上皮來源腫瘤免疫逃逸，明確肺癌患者血清shMSH2 表達，闡述其可溶性表達的影響因素及與常用肺癌血清診斷標志物的相關性，對揭示shMSH2 在肺癌早發(fā)現(xiàn)、早診斷中的臨床應用價值，以及進一步鑒定其在肺癌血清中的存在形式、揭示其在肺癌天然免疫中的功能與機制有著非常重要的理論和現(xiàn)實意義［14］。

本研究首次對肺癌、肺結節(jié)及健康對照人群血清shMSH2 表達進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)其在肺癌、肺結節(jié)及健康人群血清均存在不同水平的可溶性表達。與sMICs、sHSPs等其他能被γδ T細胞識別的可溶性腫瘤相關蛋白配體不同的是，肺癌患者血清shMSH2 表達略低于肺結節(jié)及健康對照人群。推測生理條件下shMSH2 的產(chǎn)生可能與宿主細胞壞死、凋亡或機體既往病理應激有關。hmsh2是一個管家基因，在宿主細胞和組織中存在較廣泛的表達。正常細胞凋亡、崩解時內源性hMSH2 蛋白可能會分泌、釋放至體液，導致健康人群血清存在較高水平的shMSH2。這種shMSH2 可能會與宿主細胞膜上的相應受體及其他互作蛋白競爭性結合，參與相關信號通路轉導，從而調控宿主細胞的遺傳穩(wěn)定性、細胞損傷與凋亡及B 細胞抗體類別轉換。shMSH2在健康人群血清中的基線水平可能會對hMSH2 的亞細胞分布產(chǎn)生一定影響。

肺結節(jié)形成大部分由局部炎癥所致。hMSH2本身是一個感染相關的內源性、應激性免疫預警分子，肺結節(jié)患者血清shMSH2 表達最高可能與局部感染、炎癥時產(chǎn)生的各種刺激因子密切相關。癌癥狀態(tài)對宿主而言也是一種惡性應激，因機體的免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫清除能力減低，患者常伴隨不同程度發(fā)熱、體重減輕、炎癥等癥狀。本課題組前期在宮頸癌、胃癌、肺癌、卵巢癌等多種上皮細胞來源腫瘤細胞膜及腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)hMSH2 異位表達。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌患者血清shMSH2 表達較肺結節(jié)和健康對照人群呈降低趨勢，提示腫瘤應激狀態(tài)下惡變上皮細胞表面異常表達的hMSH2 可能多以糖基化（或其他修飾形式）的膜蛋白形式存在，以分泌或蛋白酶水解等方式產(chǎn)生的shMSH2 較少。當然，腫瘤發(fā)生時惡變細胞增殖及永生化能力增強、凋亡或壞死減少，可能也是導致肺癌患者血清shMSH2 表達偏低的重要因素。此外，紫外線、發(fā)熱、病毒感染、氧化應激等物理、生物、化學因素均可誘導hMSH2 在惡變細胞表面的異位表達。因正常情況下宿主細胞膜基本無hMSH2 異常表達，肺癌、肺結節(jié)患者血清中shMSH2 的產(chǎn)生可能還與惡變宿主細胞膜hMSH2脫落、降解有關。鑒于癌癥患者血清中的shMSH2可能會與膜hMSH2競爭性結合天然免疫細胞的抗原識別受體，利于腫瘤細胞免疫逃逸，對shMSH2 在肺癌血清中的存在形式和表達調節(jié)機制的相關研究結果將另外發(fā)表。

本研究分析肺癌組織類型對血清shMSH2 表達的影響時發(fā)現(xiàn)，肺鱗癌患者血清shMSH2 表達較肺腺癌患者高，無家族史肺癌患者血清shMSH2 表達較有家族史肺癌患者高，提示shMSH2 的血清表達與患者肺癌組織類型、家族史存在一定聯(lián)系。統(tǒng)計學分析無差異可能因分層后亞組樣本量少，受試者個體差異大所致。擴大研究規(guī)?？蛇M一步確定二者對肺癌血清shMSH2 表達的影響并排除統(tǒng)計學分析造成的假陰性。有研究發(fā)現(xiàn)煙草暴露所致的基因突變是肺癌發(fā)生的重要驅動因素［15］。全基因組和轉錄組測序結果證實NSCLC 患者吸煙和非吸煙人群基因克隆模式存在多樣性［6］。但依據(jù)當前研究結果，課題組認為暫時不宜得出肺癌患者血清shMSH2 表達受肺癌組織類型、吸煙史、家族史影響的結論。

炎癥是癌癥的主要伴發(fā)癥狀之一［16］。本研究同時對用于評估急性時相反應進程的CRP、SAA 進行了檢測（二者在炎癥及腫瘤惡性轉移時常會顯著升高），此外還分析了CYFRA21-1、CEA、LDH、NSE等對NSCLC 具有重要輔助診斷價值的血清腫瘤診斷標志物，結果發(fā)現(xiàn)，雖然肺癌患者血清SAA、CY?FRA21-1、CEA 表達明顯高于正常值，shMSH2 水平卻與這些指標無顯著相關性，提示將其聯(lián)合用于肺癌臨床輔助診斷的前景并不樂觀?？紤]到現(xiàn)有市售ELISA 檢測試劑盒可能存在方法學局限性，有必要進一步擴大研究規(guī)模（尤其是分層后各亞組樣本納入量），嘗試采用更先進、更靈敏、更特異的方法（如基因芯片、RNAseq、化學發(fā)光等）結合免疫印跡、免疫共沉淀等技術，對肺癌患者血清shMSH2 表達、存在形式、互作蛋白和臨床意義進行深入研究。

此外，γδ T 細胞識別的已知可溶性表達的腫瘤或感染相關內源性抗原MICA/B、HSPs 等，均可作為免疫細胞識別配體或Toll受體啟動機體天然或適應性免疫應答。shMSH2作為hMSH2在肺癌血清中的可溶形式，在Vγ9Vδ2 T細胞介導的肺癌免疫監(jiān)視和免疫逃逸中的作用和意義亦有待深入研究。

致謝：衷心感謝臨床檢驗部、臨床生物資源庫全體同事對本實驗的支持。