謝丹璇 周 龑 牟成金 周 璞 林 萌

（四川省醫(yī)學科學院，四川省人民醫(yī)院東院眼科，成都610100）

視網(wǎng)膜母細胞瘤是嬰幼兒時期最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，約占兒童腫瘤的3%，其中1/3 的患兒為雙眼發(fā)病，嚴重危害患兒的視力和生命安全［1］。視網(wǎng)膜母細胞瘤的具體病因尚不完全清楚，近年來，腫瘤干細胞理論為視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療提供了新思路，腫瘤干細胞是一類具有自我更新和分化能力的腫瘤細胞，其向周圍組織侵襲的生物學行為是決定惡性腫瘤不良預(yù)后的主要因素［2-3］。木犀草素屬于黃酮類化合物，研究證實其對多種惡性腫瘤有明顯的抑制作用［4］。HAN 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過上調(diào)FZD6抑制Wnt信號通路，從而抑制前列腺腫瘤干細胞特性。然而木犀草素對視網(wǎng)膜母細胞瘤干細胞的影響仍未見報道。本研究通過體外檢測木犀草素對視網(wǎng)膜母細胞瘤侵襲性和干樣特性的影響，進一步探究木犀草素發(fā)揮抗腫瘤作用的分子機制，為視網(wǎng)膜母細胞瘤的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 人源視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞Y79、SORB50（美國ATCC 細胞庫）；木犀草素對照品（純度＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；胎牛血清、PI3K抑制劑LY294002（美國Sigma-Aldrich）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco）；兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）單克隆抗體（美國Santa Cruz）；兔抗人SOX2、OCT4、CD44 單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology）；兔抗人波形蛋白（Vimentin）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、p-AKT、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）及p-mTOR單克隆抗體（美國Abcam）。

1.2 方法

1.2.1 CCK8 法檢測細胞活力 將生長狀況良好的細胞以5×103個/ml 接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后更換為含有0、0.75、1.5、3、6、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 木犀草素的培養(yǎng)基［6］，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再更換為含有10%CCK8 試劑的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h 后棄去CCK8 培養(yǎng)基，加入150 μl 二甲基亞砜，低速振蕩6 min，于490 nm 處檢測各孔吸光度值（A），計算細胞存活率（%）=A給藥/A空白×100%，繪制細胞活力曲線。

1.2.2 Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲能力 預(yù)先采用重組細胞基底膜包被Transwell 小室上室，放入6 孔板中，取生長狀況良好細胞分別以不同劑量木 犀 草 素、50 μmol/L LY294002 處 理24 h 后，以1×105個/ml 接種于上室，并在下室中添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化劑，培養(yǎng)48 h 后，吸棄Transwell 小室中培養(yǎng)基，輕輕拭去上室細胞，保留侵襲至濾膜下表面的細胞，于甲醇中固定1 min，經(jīng)結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過基質(zhì)膜濾膜底面的細胞。

1.2.3 免疫熒光法檢測細胞內(nèi)Vimentin 的表達將生長狀況良好細胞以5×104個/ml 接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后以不同劑量木犀草素處理細胞，并制備細胞爬片，固定于甲醇：丙酮混合液（體積比為3：1）中20 min，再加入過氧化氫封閉30 min，然后加入兔抗人Vimentin 蛋白一抗，4 ℃下孵育過夜，次日滴加FITC標記羊抗兔IgG蛋白二抗，37 ℃下孵育30 min，熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)Vimentin陽性表達情況。

1.2.4 克隆球形成實驗 取生長狀況良好細胞分別以不同劑量木犀草素、50 μmol/L LY294002 處理24 h 后，以4×103個/ml接種于含有20 μg/L 表皮細胞生長因子+10 μg/L 堿性成纖維細胞生長因子+2%B27 的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d 左右離心后重懸于無血清培養(yǎng)基中，再分別以不同劑量木犀草素處理細胞24 h，顯微鏡下觀察干細胞成球能力，并測量其直徑。

1.2.5 Western blot 檢測VEGF、干細胞標志物及PI3K/AKT/mTOR 信號通路蛋白表達 將生長狀況良好細胞以5×104個/ml 接種于6 孔板，培養(yǎng)24 h 后以不同劑量木犀草素處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后添加蛋白裂解液，冰上振蕩40 min，收集細胞裂解液以12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，采用BCA 試劑盒檢測樣品蛋白濃度，混入上樣緩沖液于100 ℃變性5 min，取30 μg 蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，再采用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)至PVDF 濾膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，加入蛋白一抗（1：1 000）中4 ℃下孵育過夜，再加入相對應(yīng)的蛋白二抗（1：8 000）室溫下孵育1 h，最后添加ECL 發(fā)光試劑進行化學發(fā)光顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，目標蛋白灰度值/GAPDH 灰度值表示VEGF、SOX2、OCT4及CD44的相對表達量，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR表示PI3K、AKT、mTOR磷酸化水平。

1.2.6 裸鼠異位腫瘤模型的建立 制備5×106個Y79細胞懸液，注射于裸鼠腋下，觀察到腫塊出現(xiàn)時提示接種成功，將接種成功的裸鼠隨機分為4組，每組5 只，分別尾靜脈注射不同劑量木犀草素，每3 d注射1 次，第21 天時處死裸鼠，剖取腫瘤組織，觀察比較各組腫瘤組織大小并拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以s表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的活力如圖1，使用0、0.75、1.5、3、6、12.5、25、50、100、200、400 μmol/L 木犀草素處理細胞24 h 后，CCK8實驗檢測，結(jié)果顯示，25、50、100、200、400 μmol/L 木犀草素處理Y79、SO-RB50 細胞活力受到明顯抑制（P＜0.05），考慮木犀草素濃度≥100 μmol/L 時，Y79、SO-RB50 存 活 率 均 低 于30%，故 選 取12.5、25、50 μmol/L 3個劑量進行后續(xù)實驗。

圖1 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞活力Fig.1 Luteolin inhibits activity of retinoblastoma cells

2.2 木犀草素抑制Y79 細胞裸鼠成瘤的生長 如圖2，采用12.5、25、50 μmol/L Luteolin 處理裸鼠，觀察裸鼠成瘤情況，結(jié)果顯示，25、50 μmol/L Luteolin可明顯抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤體生長。

圖2 木犀草素抑制Y79細胞裸鼠成瘤生長Fig.2 Luteolin inhibits growth of Y79 cells tumor formation in nude mice

2.3 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的侵襲能力 如圖3，用12.5、25、50 μmol/L 木犀草素處理細胞24 h，Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲能力，Western blot檢測細胞中VEGF蛋白表達，結(jié)果顯示，25、50 μmol/L Luteolin 可抑制Y79、SO-RB50 細胞侵襲能力，并降低VEGF蛋白表達（P＜0.05）。

圖3 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞的侵襲能力Fig.3 Luteolin inhibits invasion ability of retinoblastoma cells

2.4 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中Vimen?tin表達 如圖4，用12.5、25、50 μmol/L 木犀草素處理細胞24 h，免疫熒光法檢測細胞內(nèi)Vimentin 表達，結(jié)果顯示，25、50 μmol/L 木犀草素可降低Y79、SO-RB50細胞中Vimentin陽性表達細胞數(shù)（P＜0.05）。2.5 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤干細胞克隆成球能力 如圖5、表1，用12.5、25、50 μmol/L 木犀草素處理細胞24 h，克隆球形成實驗觀察干細胞成球能力，結(jié)果顯示，25、50 μmol/L 木犀草素可明顯抑制Y79、SO-RB50 干細胞克隆成球率和成球直徑（P＜0.05）。

表1 各組細胞成球率和成球直徑比較（xˉ±s）Tab.1 Comparison of cell pellet formation rate and pellet diameter in each group（xˉ±s）

圖4 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中Vimentin表達Fig.4 Luteolin inhibits expression of Vimentin in retinoblastoma cells

圖5 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤干細胞克隆成球能力Fig.5 Luteolin inhibits clone spheroidization ability of stem cells in retinoblastoma cells

2.6 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中干細胞標志物的表達 如圖6，用12.5、25、50 μmol/L 木犀草素處理細胞24 h，Western blot 法檢測細胞內(nèi)干細胞標志物蛋白的表達，結(jié)果顯示，25、50 μmol/L 木犀草素可明顯抑制Y79、SO-RB50 細胞中SOX2、OCT4、CD44蛋白的表達（P＜0.05）。

圖6 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中干細胞標志物表達Fig.6 Luteolin inhibits expressions of stem cells marks in retinoblastoma cells

2.7 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PI3K/AKT/mTOR 信號通路表達 如圖7，用12.5、25、50 μmol/L 木犀草素處理細胞24 h，Western blot 檢測細胞內(nèi)PI3K/AKT/mTOR 信號通路蛋白表達，結(jié)果顯示，25、50 μmol/L 木犀草素可明顯抑制Y79、SORB50 細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 及p-mTOR/mTOR 水 平（P＜0.05）。用50 μmol/L 木 犀 草 素、50 μmol/L LY294002 處理細胞24 h，Transwell 小室實驗檢測細胞侵襲能力，克隆球形成實驗觀察干細胞成球能力，結(jié)果顯示，與空白組比較，50 μmol/L木犀草素、50 μmol/L LY294002 均可抑制Y79、SORB50 細胞侵襲能力和干細胞成球能力（P＜0.05），且50 μmol/L 木犀草素和50 μmol/L LY294002 處理組上述指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖7 木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路蛋白表達Fig.7 Luteolin inhibits protein expressions of PI3K/AKT/mTOR signaling pathways in retinoblastoma cells

3 討論

木犀草素的抗腫瘤活性越來越受到關(guān)注，大量研究表明，木犀草素在肺癌、胰腺癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤功能［7-9］。細胞增殖對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要作用，YOU 等［10］研究顯示，木犀草素誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡和自噬，從而抑制腫瘤細胞的增殖。本研究結(jié)果顯示，木犀草素可明顯抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞Y79、SO-RB50 的增殖活性，還可抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤裸鼠成瘤。

目前，根據(jù)病變發(fā)展階段、腫瘤大小、位置和范圍應(yīng)用局部治療、靜脈化療。眼動脈介入化療等療法，以保存有用視力并避免眼球摘除，但腫瘤轉(zhuǎn)移風險高，部分患者因視網(wǎng)膜母細胞瘤眼外轉(zhuǎn)移而死亡［11］。血管生成是腫瘤生長、擴散中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，該過程涉及多種血管生成因子的共同參與，其中VEGF 是研究最為廣泛的內(nèi)皮生長因子［12］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化也是啟始腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的重要步驟，間質(zhì)樣細胞中標志性蛋白Vimentin被視為判斷腫瘤細胞侵襲能力的敏感指標［13］。本研究中，木犀草素處理后細胞侵襲能力明顯減弱，VEGF、Vimentin 表達明顯低于空白組，提示木犀草素可降低Y79、SO-RB50細胞侵襲能力，這與LI 等［14］研究顯示木犀草素在黑色素瘤中抑制細胞侵襲轉(zhuǎn)移結(jié)果相似。

腫瘤干細胞廣泛存在于視網(wǎng)膜母細胞瘤、肝癌、前列腺癌等腫瘤中，其鑒定主要通過分子標記和功能鑒別，常見的干細胞分子標志物有SOX2、OCT4、CD44等［15］。TSAI等［16］研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可抑制立體前列腺癌細胞的腫瘤干細胞特性和轉(zhuǎn)移。本研究重點探討木犀草素對視網(wǎng)膜母細胞瘤干細胞的影響，使用處理Y79、SO-RB50 細胞后可明顯抑制其干細胞克隆成球率和成球直徑，并下調(diào)SOX2、OCT4、CD44的表達，表明木犀草素可抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤的干樣特性。

PI3K/AKT/mTOR 信號通路在細胞生長、增殖、分化等多種生命過程，其異常表達可能與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)報道，PI3K 在腫瘤干細胞中活性異常升高，是維持其自我更新的重要調(diào)節(jié)因子［17］。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR 信號通路對于維持腫瘤干細胞特性有重要作用［18］。XIN 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過PI3K/AKT 通路，抑制MMP-2 和MMP-9 的表達，從而在體內(nèi)和體外抑制黑色素瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，木犀草素處理組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 及p-mTOR/mTOR 水平降低，高濃度作用效果與PI3K 抑制劑LY294002 相當，提示木犀草素可能通過阻滯PI3K、AKT、mTOR 磷酸化抑制Y79細胞侵襲性和干樣特性。

綜上所述，木犀草素抑制視網(wǎng)膜母細胞瘤侵襲性和干樣特性，可能與減弱VEGF、Vimentin、SOX2、OCT4、CD44 表達，降低PI3K、AKT、mTOR 磷酸化水平有關(guān)。但木犀草素是否還有其他途徑作用于視網(wǎng)膜母細胞瘤尚不明確，后續(xù)將深入分析木犀草素對視網(wǎng)膜母細胞瘤的影響。