任哲昕，姚思佳，葉韓薇，陳媛媛，唐云平

（浙江海洋大學食品與藥學學院/浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022）

氧化是許多生物體產(chǎn)生能量的一種基本反應過程，是所有生物體不能避免的。然而，在生物體內(nèi)氧化反應中產(chǎn)生過量的氧自由基，如過氧化氫（H2O2）、超氧化物陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）和過氧化自由基（-ROO）等［1］。氧自由基是人體代謝產(chǎn)物，化學性質(zhì)活躍，不僅與脂質(zhì)過氧化物密切相關，而且可以造成機體中細胞膜、DNA 和蛋白質(zhì)的活性損傷，能引起人體疾病、衰老和死亡，對人體的健康和長壽危害非常大［2，3］。因此，研究者們對抗氧化物活性物質(zhì)的研究產(chǎn)生了很大的興趣。

目前，來源于植物和動物的抗氧化活性肽方面的研究已有大量報道。植物蛋白源的酶解產(chǎn)物活性肽需經(jīng)蛋白酶消化后才能發(fā)揮其功能活性［4］。中國水產(chǎn)加工業(yè)發(fā)達，加工生產(chǎn)的水產(chǎn)下腳料可作為活性肽制備的原材料。水生動物抗氧化肽主要來源于魚類、貝類、蝦和海參等，而魚類蛋白是最豐富的，魚肉［5］、魚皮［6］、魚骨［7］和魚鰾［8］等都有關于活性肽制備和其功能研究的相關報道。

魚子是魚類加工過程中產(chǎn)生較多的一種加工副產(chǎn)物，魚子中富含礦物質(zhì)鹽、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、不飽和脂肪酸和磷脂等，具有珍膳海味的美稱［9］。目前，魚子主要用于加工魚子醬，但魚子醬的加工對魚子原料要求非?？量?，如魚子顆粒要求圓潤飽滿、顏色剔透，許多魚子不具有這些加工特性［10］。鮟鱇魚（Lophius litulon）屬軟骨魚類，歸類于鮟鱇目鮟鱇科，具有頭大、口大與肚大3 個明顯特征，是世界及中國重要經(jīng)濟魚種之一。鮟鱇魚子由于不滿足魚子醬的加工要求，絕大部分的鮟鱇魚子在加工過程中無法得到有效的加工和利用而被丟棄，造成資源浪費并污染環(huán)境［11］。為進一步利用鮟鱇魚魚子，本研究利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對鮟鱇魚子進行復合酶解，超濾后得到分子質(zhì)量小于1 kDa的活性肽（命名為MRP），并對其體外抗氧化能力進行測定。此外，通過測定細胞活性和抗氧化能力評價MRP 對H2O2誘導的RAW 264.7 細胞損傷的保護作用，以期為鮟鱇魚子的高值化利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鮟鱇魚子，浙江省舟山市國際水產(chǎn)城；胃蛋白酶、胰蛋白酶，北京亞太恒信生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT），上海碧云天生物技術公司；二甲亞砜（DMSO），美國Sigma公司；總蛋白定量測定試劑盒（BCA 法）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒，南京建成科技有限公司；其他化學試劑均為分析純級。

JJ-2 型組織攪碎機，上海比朗儀器有限公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；CF16RXII 型高速低溫離心機，日本HITACHI 公司；GM-18 型超濾機，濟南博納生物技術有限公司；ALPHA 1-4/LDplus 型冷凍干燥機，德國CHRIST 公司；SpectraMax2 型酶標儀，美國Bio-Rad公司。

1.2 MRP 的制備

參照Jiang 等［12］的方法并稍作修改，采用復合酶酶解法制備鮟鱇魚子肽。首先，將魚子勻漿，用95%乙醇脫脂，用純水洗凈。在魚子勻漿制備反應體系（m∶m=1∶10）中加入胃蛋白酶（1 500 U/g），調(diào)節(jié)pH至2.0，在37 ℃中水解反應4 h，然后用0.1 mol/L NaOH 將反應體系的pH 調(diào)節(jié)到8.0，使胃蛋白酶失活，同時將胰蛋白酶（1 500 U/g）加入到反應體系中，繼續(xù)水解反應4 h。隨后，加熱使酶失活、冷卻并調(diào)節(jié)pH 為7.0，在10 000 r/min 下離心10 min，取上清液用濾膜（0.22 μm）抽濾，最后用1 kDa 膜進行超濾，收集酶解液（＜1 kDa）并凍干，于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MRP 體外抗氧化能力的測定

參考Jiang 等［13］方法，分析MRP 對DPPH、ABTS和·OH 羥自由基的清除能力。

1.4 MRP 對H2O2氧化損傷RAW 264.7 巨噬細胞的保護作用

1.4.1 細胞培養(yǎng) RAW 264.7 細胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 完全營養(yǎng)液，溫度37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，換液1 次。培養(yǎng)瓶中細胞生長密度達80%～90%時，用彎頭吸管輕輕吹打貼壁細胞，按1∶3～1∶5 的比例加入新鮮培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 H2O2氧化損傷RAW 264.7 細胞模型的建立參照Li 等［14］的方法，在細胞中加入用DMEM 完全培養(yǎng)液配制的不同濃度H2O2溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 和0.9 mmol/L），培養(yǎng)一定時間（1、2、3、4 h）后計算細胞活性。

1.4.3 MRP 對受H2O2損傷細胞活性的影響 參照Zheng 等［15］的方法，細胞用不同濃度MRP 5、10、25、50、100、200、500、1 000 μg/mL 孵育24 h 后，棄上清液后加入濃度為0.8 mmol/L H2O2溶液（DMEM 完全培養(yǎng)液）孵育2 h，計算細胞活性。收集細胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書測定LDH 含量。

1.4.4 MRP 對受H2O2損傷細胞形態(tài)的影響 取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整RAW 264.7 細胞密度，每孔加入細胞懸液2 mL 于6 孔板，用50、100、200 μg/mL MRP 培養(yǎng)液孵育24 h 后，棄培養(yǎng)液，加入濃度為0.8 mmol/L H2O2溶液（DMEM 完全培養(yǎng)液）孵育2 h，利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.4.5 細胞中CAT、GSH-PX、SOD 和MDA 含量的測定 同“1.4.4”的方法培養(yǎng)細胞后，用2 mL PBS 清洗孔內(nèi)細胞，按每孔200 μL 細胞蛋白裂解液。將培養(yǎng)板置于冰浴中裂解，低溫超聲破碎，離心取上清液，參照試劑盒說明書測定細胞中CAT、GSH-PX、SOD和MDA 含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)應用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）多重比較進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 MRP 體外抗氧化能力

自由基清除活性與防止光老化和紫外線損害密切相關，對于開發(fā)藥妝產(chǎn)品具有重要意義。為了評估鮟鱇魚子活性肽MRP 的抗氧化活性，測定了其對DPPH、ABTS 和·OH 羥自由基的清除能力，并用谷胱甘肽（GSH）作為陽性對照。如圖1 所示，MRP 對這3種自由基的清除能力呈劑量依賴性，且對ABTS 和羥自由基的清除能力接近GSH。

圖1 MRP 對DPPH（A）、ABTS（B）和羥自由基（C）清除能力

2.2 MRP 對H2O2誘導RAW 264.7 巨噬細胞氧化損傷的保護作用

2.2.1 H2O2對RAW 264.7 細胞活性的影響 活性氧可能通過生物分子（脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或DNA）的直接氧化或觸發(fā)細胞內(nèi)途徑來破壞甚至殺死細胞［16］。巨噬細胞對于鑒定和消除宿主防御系統(tǒng)中的微生物病原體至關重要，且是促氧化劑的主要目標。因此，巨噬細胞常被用于細胞凋亡或氧化應激介導的細胞損傷研究［17，18］。如圖2 所示，隨著H2O2濃度的增加和處理時間的延長，RAW 264.7 細胞的活力明顯下降。用0.8 mmol/L H2O2處理細胞2 h 后的細胞活力為對照組的50.09%。用H2O2處理細胞時，濃度過低對細胞損傷能力較弱，濃度過高則會導致對細胞損傷程度過高，均不利于后續(xù)試驗。因此，利用0.8 mmol/L H2O2處理RAW 264.7 細胞2 h 為氧化損傷模型，研究MRP 對H2O2誘導的損傷影響。

圖2 H2O2對RAW 264.7 細胞活性的影響

2.2.2 MRP 對H2O2誘導RAW 264.7細胞活性及LDH釋放率的影響 MRP 對H2O2誘導RAW 264.7

細胞活性的影響結(jié)果如圖3A 所示，H2O2誘導的模型組細胞活性僅為正常組的（52.97±1.42）%。與模型組相比，用不同濃度MRP 處理可以緩解H2O2引起RAW 264.7 細胞的增殖抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性。當MRP 濃度為25、50、100、200、500 μg/mL 時，MRP能顯著提高H2O2誘導的氧化應激模型的細胞活性（P＜0.01）；當MRP 濃度達200 μg/mL 時，氧化受損細胞的活性最大。因此，選擇3 個具有組間差異（P＜0.01）的MRP 濃度（50、100、200 μg/mL）開展后續(xù)試驗。

LDH 是一種廣泛存在于細胞質(zhì)中的糖酵解酶，正常情況下僅存在于細胞質(zhì)中，能反映細胞膜的受損程度和結(jié)構(gòu)完整性。因此，測定細胞培養(yǎng)上清液中LDH 水平是細胞損傷程度的關鍵指標［19］。如圖3B 所示，與正常組相比，模型組細胞培養(yǎng)上清液的LDH 含量極顯著升高（P＜0.01），表明H2O2損傷了細胞并導致LDH 外漏。與模型組相比，50 μg/mL MRP 可顯著降低LDH 活力（P＜0.05），表明MRP 可以有效緩解細胞膜氧化受損程度，防止細胞內(nèi)LDH外漏。

圖3 MRP 對H2O2損傷RAW 264.7 細胞活性（A）及LDH 釋放率（B）的影響

2.2.3 MRP 對H2O2誘導氧化受損的RAW 264.7 細胞形態(tài)的影響 H2O2損傷是目前使用最廣泛的細胞氧化損傷模型。如圖4A 所示，正常RAW 264.7巨噬細胞的形狀呈圓形，且細胞邊界明顯。然而，用0.8 mmol/L H2O2處理RAW 264.7巨噬細胞2 h 后（圖4B），細胞明顯出現(xiàn)形態(tài)學變化，如細胞膜受損不清晰，細胞破碎，鼓脹壞死，甚至胞漿凝結(jié)，這表明H2O2導致了細胞的氧化損傷。在0.8 mmol/L H2O2處理后，不同濃度MRP（50、100、200 μg/mL）處理的細胞形態(tài)明顯改善（圖4C-E），可觀察到碎片細胞和脹大壞死細胞的數(shù)量減少，且200 μg/mL 劑量組細胞形態(tài)與正常組接近。因此，結(jié)果表明，MRP 能夠有效改善H2O2導致的細胞毒性。

圖4 MRP 對H2O2氧化損傷RAW 264.7 細胞形態(tài)的影響（×400）

2.2.4 MRP 對H2O2誘導氧化受損的RAW 264.7 細胞中抗氧化標志物的影響 H2O2可觸發(fā)脂質(zhì)過氧化反應從而破壞生物膜的完整性，還能降低細胞中抗氧化酶的活性［20，21］。CAT、SOD 和GSH-Px 都是細胞抗氧化防御系統(tǒng)中的關鍵物質(zhì)，它們對人體的氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)具有非常重要的影響［22］。CAT 可以將H2O2分解為水和氧氣。GSH-Px 可以促進H2O2和GSH 的還原反應，產(chǎn)生水和氧化型谷胱甘肽（GSSG）。SOD 可清除超氧陰離子自由基并防止細胞損傷。如圖5A-C 所示，與正常組相比，H2O2處理極顯著降低了細胞中抗氧化酶（CAT、GSH-Px 和SOD）的活性（P＜0.01）。與模型組相比，200 μg/mL MRP 預處理組可極顯著提高CAT、GSH-Px 和SOD的水平（P＜0.01）。

丙二醛（MDA）是自由基與體內(nèi)脂質(zhì)反應的主要產(chǎn)物之一，其含量間接反映自由基對細胞攻擊的嚴重程度［23］。H2O2誘導的模型組中MDA 水平極顯著高于對照組（P＜0.01），表明細胞受到H2O2刺激損傷嚴重（圖5D）。與模型組相比，MRP 預處理組中MDA 含量顯著降低并呈劑量效應關系。由此，MRP在一定程度上抑制了細胞內(nèi)脂質(zhì)的過氧化，增強了細胞的抗氧化能力。

圖5 MRP 對RAW 264.7 細胞損傷模型中CAT（A）、GSH-Px（B）、SOD（C）和MDA（D）水平的影響

3 小結(jié)

本研究利用胃蛋白酶和胰蛋白酶對鮟鱇魚子進行復合酶酶解，并收集小于1 kDa 部分進行研究。鮟鱇魚子肽（MRP）對DPPH、ABTS 和羥自由基的清除作用呈良好的劑量依賴性。MRP 對H2O2誘導RAW 264.7 細胞氧化損傷具有一定的保護作用，可極顯著提高H2O2誘導的氧化應激模型的細胞活性，緩解細胞膜氧化受損程度從而防止細胞內(nèi)LDH 外漏。此外，MRP 可提高細胞中CAT、SOD 和GSH-Px活力水平，降低MDA 含量。綜上所述，MRP 具有較好的抗氧化能力，可作為添加劑用于抗氧化相關產(chǎn)品研發(fā)。