曹磊 張成立 侯穎

肺癌是起源于肺部支氣管黏膜、腺體的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率及死亡率[1]。肺癌細胞的異常增殖及侵襲活動對肺癌的發(fā)展具有促進作用。微小RNA(microRNA，miR)是一類內源性非編碼RNA，其失調與肺癌細胞的增殖、侵襲活動密切相關[2]。有研究表明，miR-367-3p在非小細胞肺癌細胞中表達顯著降低，可調節(jié)癌細胞上皮間質轉化過程[3]。細胞周期素D2重組蛋白(recombinant cyclin D2 protein，CCND2)是D型細胞周期蛋白cyclin蛋白家族成員，與肺癌細胞的增殖、轉移活動聯(lián)系密切[4-5]，抑制CCND2表達可降低非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移能力[5]。靶基因預測顯示,miR-367-3p與CCND2存在結合位點。本研究探究miR-367-3p調控CCND2表達對肺癌細胞增殖、遷移的影響。

材料與方法

一、材料

人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細胞HLF-a于武漢普諾賽生命科技有限公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：將人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細胞HLF-a接種到RPMI1640培養(yǎng)基(含10%FBS)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換1次新鮮培養(yǎng)基。

2.肺癌細胞中miR-367-3p表達水平的測定：收集對數(shù)生長期人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647、人正常肺細胞HLF-a，提取細胞總DNA，經逆轉錄合成cDNA，以U6作為內參，進行qRT-PCR擴增。miR-367-3p引物序列5'-3'：上游AGTGCAGGGTCCGAGGTATT，下游CGACGAATTGCACTTTAGC；U6引物序列5'-3'：上游CGAGCACAGAATCGCTTCA，下游CTCGCTTCGGCAGCACATAT。根據(jù)2-△△CT算法分析miR-367-3p相對表達水平，實驗重復3次。

3.細胞分組及轉染：收集人肺癌細胞Calu，分為對照組(正常培養(yǎng))、miR-367-3p NC組(轉染miR-367-3p陰性對照)、miR-367-3p mimic組(轉染miR-367-3p模擬物)、miR-367-3p mimic+pc-CCND2組(共轉染miR-367-3p模擬物和pc-CCND2)。使用EntransterTM-R4000轉染試劑對各組細胞進行相應轉染。

4.肺癌細胞Calu的細胞活力測定：將Calu細胞按照1 500個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 小時后加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，全自動酶標儀測定各孔吸光度值，按照公式計算各組Calu細胞活力。細胞活力(%)=(A測定-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

5.肺癌細胞Calu凋亡情況測定：調整Calu細胞濃度為1×106個/ml，取100 μl置于流式管中，依次加入5 μl AnnexinV/Alexa Fluor、10 μl碘化丙啶(PI，20 μg/ml)溶液，混勻、避光室溫孵育15 分鐘后加入400 μl的PBS緩沖液，于流式細胞儀中檢測Calu細胞凋亡情況。

6.肺癌細胞Calu侵襲、遷移能力測定：調整Calu細胞濃度為1×105個/ml，在24孔板中放入鋪設好Matrigel膠的Transwell小室，取200 μl各組Calu細胞懸液添加至上室，取適量含20%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液于下室，培養(yǎng)24 小時，PBS緩沖液沖去上室殘留細胞后用多聚甲醛固定(20 分鐘)，結晶紫染色、干燥，顯微鏡拍照并計數(shù)侵襲細胞數(shù)。將Calu細胞接種于6孔板并培養(yǎng)至細胞融合率達到90%，用槍頭在6孔板底部作劃痕，培養(yǎng)24小時，顯微鏡下觀察并分析細胞遷移能力，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0小時劃痕寬度-24小時劃痕寬度)/0小時劃痕寬度×100%。

7.肺癌細胞Calu中CCND2、凋亡、侵襲相關蛋白測定：用高效RIPA裂解液提取Calu細胞中總蛋白質，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質含量，經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、封閉(1 小時)后，加入兔源CCDN2、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗，低溫孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫孵育1 小時，顯色、曝光、凝膠成像儀觀察并分析條帶。

8.miR-367-3p與CCND2靶向關系驗證：Targetscan數(shù)據(jù)庫查詢miR-367-3p和CCDN2結合位點，構建突變型(CCDN2-MUT)、野生型(CCDN2-WT)熒光素酶表達載體，將CCDN2-MUT、CCDN2-WT分別與miR-367-3p mimic NC、miR-367-3p mimic共轉染至Calu細胞中，培養(yǎng)24 小時后測定各組Calu細胞的相對熒光素酶活性，實驗重復3次。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

1.各細胞中miR-367-3p表達水平比較：與人正常肺細胞HLF-a相比，人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，Calu細胞中miR-367-3p表達相對較低(表1)，因此選取Calu細胞用于后續(xù)研究。

表1 各細胞中miR-367-3p表達水平比較

2.各組肺癌細胞Calu中miR-367-3p、CCND2表達水平比較：與對照組比較，miR-367-3p NC組miR-367-3p、CCND2差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞中miR-367-3p表達顯著升高，CCND2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組相比，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞中CCND2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組Calu細胞中miR-367-3p及CCND2表達水平比較

3.各組肺癌細胞Calu細胞活力比較：與對照組比較，miR-367-3p NC組Calu細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+ pc-CCND2組Calu細胞活力顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組Calu細胞的細胞活力比較

4.各組肺癌細胞Calu凋亡情況比較：與對照組比較，miR-367-3p NC組Calu細胞凋亡率、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞凋亡率、Caspase-3、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組Calu細胞凋亡情況比較

5.各組肺癌細胞Calu侵襲、遷移情況比較：與對照組相比，miR-367-3p NC組侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，miR-367-3p mimic組Calu細胞侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與miR-367-3p mimic組比較，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞侵襲、遷移能力、MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 各組Calu細胞侵襲、遷移情況比較

6.miR-367-3p與CCND2靶向關系測定：TargetScan數(shù)據(jù)庫結果顯示，miR-367-3p在CCND2的3'-UTR區(qū)存在相應結合位點(圖1)；熒光素酶實驗顯示，與CCND2 WT+miR-367-3p NC組(1.00±0.08)相比，CCND2 WT+miR-367-3p mimic組Calu細胞熒光素酶活性(0.43±0.07)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CCND2 MUT+miR-367-3p NC組(0.99±0.10)及CCND2 MUT+miR-367-3p mimic組(1.01±0.13)差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 miR-367-3p和CCND2的3'-UTR區(qū)序列相互結合

討論

目前，肺癌常用的治療手段有手術切除、放化療、分子靶向治療、藥物治療等。肺癌的治療已取得較大進展，但由于肺癌就診時多為晚期，大多數(shù)病人的生存質量及預后仍不理想[6-7]。miRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的參與肺癌等多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展的內源性非編碼單鏈RNA，主要通過與靶基因的3'-UTR區(qū)配對來調節(jié)靶基因的表達，進而發(fā)揮相應的促癌、抑癌作用[2]。miR-367-3p是miRNA302-367家族成員，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p與肺癌等多種腫瘤細胞的增殖、遷移活動聯(lián)系密切[8]，萬亮[3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-367-3p在非小細胞肺癌細胞中表達低于正常肺上皮細胞，Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，提高miR-367-3p的表達可顯著抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移。本研究結果顯示，人肺癌細胞Calu、MSTO-211H、NCI-H2347、NCI-H1437、NCI-H1944、NCI-H647中miR-367-3p表達水平顯著低于人正常肺細胞HLF-a，其中Calu細胞中miR-367-3p表達相對較低，因此選取Calu細胞用于后續(xù)轉染實驗。轉染實驗結果顯示，miR-367-3p NC組與對照組相比miR-367-3p及CCND2蛋白表達大致相同，miR-367-3p mimic組miR-367-3p表達顯著高于對照組，miR-367-3p mimic+pc-CCND2組Calu細胞中CCND2蛋白表達顯著高于對照組，提示實驗轉染效果較好。

惡性增殖、侵襲、轉移是惡性腫瘤導致病人分期較高、預后較差、死亡率高的主要原因，腫瘤的惡性程度越大，細胞的侵襲、轉移能力越強，鄰近的正常組織越易被侵犯，最終導致腫瘤面積擴大[10]。因此，探究miR-367-3p對肺癌細胞增殖、遷移能力的影響具有重要意義。Caspase-3、Bax為重要的促凋亡因子，Bax主要通過增強Caspase-3水平發(fā)揮作用，Bcl-2是重要的抗凋亡因子，具有阻止細胞凋亡的作用，測定細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平可間接反映細胞的凋亡能力[11]。MMP-2、MMP-9與腫瘤細胞的侵襲、遷移活動聯(lián)系密切，是MMPs家族成員，測定細胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平可反映細胞的侵襲、遷移能力[12]。本研究結果顯示，提高miR-367-3p表達，可顯著降低Calu細胞的細胞活力及侵襲、遷移能力，降低細胞中MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表達，提高細胞凋亡率及細胞中Caspase-3、Bax蛋白表達水平，提示miR-367-3p高表達可顯著降低肺癌細胞Calu的增殖及遷移能力，并促進其凋亡，但其機制仍不清晰。

CCND2是D型細胞周期蛋白cyclin蛋白家族成員，與肺癌等腫瘤細胞的增殖、轉移活動聯(lián)系密切。Jin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，上調CCND2表達可促進非小細胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展。多項研究表明，miRNA可靶向調節(jié)CCND2參與非小細胞肺癌的生長和轉移過程。Yao等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-671-3p可靶向抑制CCND2抑制非小細胞肺癌的發(fā)展。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)，miR-4317可靶向抑制CCND2抑制非小細胞肺癌的遷移及侵襲，提高CCND2表達后可減弱miR-4317的抑制作用。Targetscan預測結果顯示miR-367-3p與CCND2的3'-UTR區(qū)存在相應的結合位點，熒光素酶活性實驗結果顯示miR-367-3p過表達能顯著下調野生型CCND2-3'UTR熒光素酶活性，表明miR-367-3p可直接靶向調節(jié)CCND2的表達，并且，CCND2過表達可逆轉miR-367-3p過表達對Calu細胞活力、侵襲、遷移能力的抑制作用。提示miR-367-3p抑制肺癌細胞Calu的增殖、遷移能力可能是通過抑制CCND2表達實現(xiàn)的。

綜上所述，miR-367-3p過表達可抑制肺癌細胞Calu的增殖、遷移能力，可能是通過靶向抑制CCND2實現(xiàn)的。本研究存在不足之處，由于條件及時間限制，未做動物實驗進一步驗證研究結果。