王慧娟，王二強(qiáng)，符真珠，李艷敏，王曉暉，王占營(yíng)，袁 欣，高 杰，王利民，張和臣

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002；2. 洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023）

芍藥（Paeonia lactifloraPall.）屬芍藥科芍藥屬，多年生宿根草本，是我國(guó)的傳統(tǒng)名花，栽培歷史悠久。芍藥不僅具有風(fēng)姿綽約的觀賞特性，已發(fā)展成為世界流行的切花種類，而且其肉質(zhì)根可入藥，其種子可榨油，用途廣泛，具有很大的開發(fā)潛力。芍藥品種繁多，具有一定的地域性，并且近年來國(guó)外優(yōu)良芍藥品種不斷引進(jìn)，其親本來源豐富，遺傳背景更為復(fù)雜[1]，極大地豐富了我國(guó)芍藥育種資源的多樣性。

表型性狀是植物多樣性最直觀的反映，表型分析是研究物種變異和進(jìn)化的傳統(tǒng)方法，是衡量物種多樣性的重要指標(biāo)和主要研究?jī)?nèi)容，通過多樣性指數(shù)、相關(guān)性、主成分及聚類分析對(duì)種質(zhì)資源表型性狀遺傳多樣性進(jìn)行鑒定分析已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、林木等種質(zhì)分類及評(píng)價(jià)[2-6]。利用表型性狀對(duì)不同品種群芍藥種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，對(duì)于種質(zhì)資源的高效利用和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。關(guān)于芍藥種質(zhì)資源表型多樣性研究，前人多針對(duì)國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)種植的中國(guó)芍藥品種群品種，或僅針對(duì)花色等單一表型進(jìn)行多樣性研究。如劉春迎等[7]選取了56 個(gè)表型性狀對(duì)60 個(gè)芍藥栽培品種進(jìn)行數(shù)量聚類，分析得出花型是芍藥品種分類的重要標(biāo)準(zhǔn)；萬(wàn)映伶等[8]對(duì)菏澤市和洛陽(yáng)市栽培的240 個(gè)芍藥品種進(jìn)行多樣性分析并明確了影響芍藥表型的主要因子；郭先鋒等[9]運(yùn)用聚類分析揭示出27 個(gè)芍藥栽培品種與5 個(gè)野生種芍藥關(guān)系最近；王榮等[10]、劉蘇閩等[11]則主要針對(duì)揚(yáng)州芍藥品種進(jìn)行多樣性研究，通過聚類結(jié)果可以看出，揚(yáng)州芍藥品種的多樣性與芍藥株高有較大的相關(guān)性，篩選了針對(duì)不同育種目標(biāo)的品種群；王玉蛟等[12]、吳芳芳等[13]基于花色單一表型對(duì)芍藥種質(zhì)資源的表型多樣性進(jìn)行了數(shù)量分類研究。僅有楊柳慧等[14]對(duì)不同品種群的47 個(gè)芍藥品種的33個(gè)表型性狀進(jìn)行了多樣性分析，認(rèn)為國(guó)內(nèi)品種與大多數(shù)國(guó)外品種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。針對(duì)不同來源、不同品種群的芍藥種質(zhì)資源表型性狀多樣性還有待于深入研究。鑒于此，以109 份不同品種群的芍藥種質(zhì)資源為研究對(duì)象，通過對(duì)其38個(gè)表型性狀進(jìn)行變異、相關(guān)、主成分及聚類等多樣性分析，揭示表型變異特點(diǎn)，為充分挖掘和利用芍藥種質(zhì)資源及新品種培育提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括109 份國(guó)內(nèi)外芍藥種質(zhì)資源，其中中國(guó)芍藥品種群（Lactiflora group，LG）97 個(gè)（其中，國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)種植品種82 個(gè)，國(guó)外引進(jìn)品種15 個(gè)），雜種芍藥品種群（Hybrid group，HG）9 個(gè)，伊藤芍藥品種群（Iton group，IG）3 個(gè)，HG 和IG 均為國(guó)外引種。試驗(yàn)材料均為3 年生分株苗，栽植于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地芍藥資源圃中，株行距50 cm×100 cm。具體品種信息見表1。

表1 109份芍藥種質(zhì)資源Tab.1 109 herbaceous peony germplasm resources

1.2 表型性狀觀測(cè)

表型性狀于2020—2021年重復(fù)觀測(cè)。根據(jù)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南芍藥》（NY/T 2225—2012）[15]選取了38 個(gè)具有代表性且遺傳相對(duì)穩(wěn)定的表型性狀，其中數(shù)量多態(tài)性狀4個(gè)、定性多態(tài)性狀27 個(gè)、二元性狀7 個(gè)。每個(gè)品種隨機(jī)選擇6株進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，測(cè)定時(shí)期為2月下旬至5月上旬，株高、復(fù)葉頂小葉長(zhǎng)寬比值、莖粗、花徑等數(shù)量性狀用卷尺和游標(biāo)卡尺測(cè)量，葉片顏色、莖稈顏色和花色等質(zhì)量性狀直接觀測(cè)定性，花期以50%達(dá)到盛花期為準(zhǔn)。采用等級(jí)數(shù)量編碼方法進(jìn)行處理，表型性狀及其賦值規(guī)則見表2。

表2 芍藥表型性狀及其測(cè)量方法和賦值規(guī)則Tab.2 Phenotypic traits of peony and measurement method and assignment rules

表2 芍藥表型性狀及其測(cè)量方法和賦值規(guī)則Tab.2 Phenotypic traits of peony and measurement method and assignment rules

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Excel軟件結(jié)合SPSS 22.0分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。質(zhì)量性狀：計(jì)算其各級(jí)分布頻率的有效百分比。數(shù)量性狀：計(jì)算一般的描述性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，包括全距、極值、均值、變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，并參照孫珍珠等[16]的方法劃分等級(jí)，然后從第1 級(jí)［Xi＞（xˉ+2δ）］到第10 級(jí)［Xi＜（xˉ-2δ）］，每0.5δ 為1 級(jí)，計(jì)算各個(gè)級(jí)別數(shù)目及分布頻率。Shannon-Wiener遺傳多樣性指數(shù)（H＇）表示各表型性狀的多樣性程度，H＇=-Σ（Pi×lnPi），式中Pi為某性狀第i分級(jí)內(nèi)材料分布頻率的有效百分比。

利用SPSS 22.0分析軟件，通過方差齊性檢驗(yàn)整體變異分布情況，對(duì)表型性狀進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，根據(jù)平方歐式距離按照Ward法對(duì)性狀進(jìn)行R型聚類分析；運(yùn)用主成分分析，提取對(duì)芍藥種質(zhì)資源分類貢獻(xiàn)較大的性狀；最后采用R 語(yǔ)言對(duì)品種進(jìn)行層次聚類分析及可視化作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥數(shù)量性狀變異及多樣性

數(shù)量性狀的變異程度通過極差、極小值、極大值、均值、變異系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差等反映。表型性狀豐富程度與變異系數(shù)大小呈正相關(guān)[17]。由表3 可知，4個(gè)數(shù)量性狀中變異系數(shù)平均值17.59%，其中株高的變異系數(shù)最大（24.71%），具有豐富的多態(tài)性；莖粗的變異系數(shù)（18.12%）次之；而頂小葉長(zhǎng)寬比值和花徑的變異系數(shù)較小，只有14.45%和13.08%，說明其變異幅度較小，遺傳特性較為穩(wěn)定。數(shù)量性狀遺傳多樣性指數(shù)分布在1.83～2.10，平均值為2.00，其中株高、花徑、莖粗3個(gè)性狀的多樣性指數(shù)均在2.00以上，表明這些性狀在每一級(jí)中的分布比較均勻。

表3 芍藥種質(zhì)資源數(shù)量性狀多樣性Tab.3 Diversity of quantitative traits of peony germplasm resources

2.2 質(zhì)量性狀變異分布頻率及多樣性

對(duì)109 個(gè)芍藥品種34 個(gè)質(zhì)量性狀進(jìn)行多樣性分析（圖1，表4）。結(jié)果表明，供試芍藥以緊湊（34.86%）和半開張（33.03%）為主。莖色以綠色（78.90%）為主。芽叢顏色以紫紅色（77.06%）為主。75.23%葉緣具有鋸齒。花色以粉色（25.69%）和紫紅色（31.19%）為主，白色（11.93%）和復(fù)色（10.09%）次之，其他花色占比很少，均少于10%?；ㄐ鸵耘_(tái)閣花型（47.71%）為主，托桂型（19.27%）次之，單瓣型（8.26%）、皇冠型（6.42%）、繡球型（5.5%）較少，其他花型占比只有1%～3%。花期以中花（65.14%）為主，早花（17.43%）和晚花（16.51%）次之，極早花期（0.92%）極少。雄蕊正常（39.45%）和部分瓣化（21.1%）占多數(shù)，可作為雜交父本。雌蕊正常（52.29%）超過半數(shù)，可作為雜交母本。在生長(zhǎng)勢(shì)方面，62.38%生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，在資源圃生長(zhǎng)良好。

圖1 芍藥種質(zhì)資源質(zhì)量性狀變異分布頻率Fig.1 The variation distribution of qualitative traits of peony germplasm resources

34 個(gè)質(zhì)量性狀的遺傳多樣性指數(shù)介于0.28～1.82（表4），平均值1.06，低于數(shù)量性狀。多樣性指數(shù)較高（H＇＞1.20）的性狀有株型、花色、花型、花香、心皮數(shù)、心皮被毛、柱頭顏色，表明這些性狀指標(biāo)在不同描述類型中分布較均衡。側(cè)蕾多少、葉質(zhì)、蕾形、雄蕊狀態(tài)、心皮被毛、結(jié)實(shí)性、葉色等性狀的多樣性指數(shù)在1.00～1.20。莖被毛、蕾綻口、葉脈凹陷、花瓣有無(wú)雜色等性狀的多樣性指數(shù)＜0.50，表明供試芍藥品種在這4個(gè)性狀的表現(xiàn)型分布很不均衡。多樣性指數(shù)分析結(jié)果表明，供試材料花朵、株型及葉片具有豐富的遺傳多樣性。

表4 芍藥種質(zhì)資源質(zhì)量性狀的多樣性Tab.4 Diversity of qualitative traits of herbaceous peony germplasm resources

2.3 性狀相關(guān)性分析及R型聚類結(jié)果

對(duì)芍藥種質(zhì)資源的表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（圖2），結(jié)果表明，38個(gè)表型性狀中部分性狀之間存在不同程度的相關(guān)性，其中性狀間呈極顯著相關(guān)性的有67 對(duì)，顯著相關(guān)的有53 對(duì)。其中株高與莖粗（相關(guān)系數(shù)0.512）、頂小葉形狀與長(zhǎng)寬比值（0.400）、株型與莖態(tài)（0.544）、莖態(tài)與花態(tài)（0.497）、花型與株高（0.387）、花色與花瓣有無(wú)雜色（0.310）等表型性狀間存在極顯著的相關(guān)性。從圖2 還可以看出，花部各表型性狀與其他性狀之間存在復(fù)雜的相關(guān)性，如側(cè)蕾多少與株高、莖粗、頂小葉是否有裂、葉緣鋸齒、花型、生長(zhǎng)勢(shì)之間具有顯著的相關(guān)性，這些性狀多數(shù)為中國(guó)芍藥品種群的共同特性；花型與株高、葉緣鋸齒、花態(tài)、花色、花期、雌蕊狀態(tài)等性狀顯著相關(guān)；花色與花瓣有無(wú)雜色、花態(tài)、雌蕊狀態(tài)、柱頭大小等性狀極顯著相關(guān)；并且雌蕊、心皮、柱頭等生殖器官相關(guān)性狀之間互相存在顯著相關(guān)性。莖、葉部的表型性狀與其他性狀存在較少的極顯著相關(guān)性，例如莖色只與莖粗、葉質(zhì)只與葉片光澤等具有極顯著相關(guān)性，葉色、葉脈凹陷與其他性狀之間不存在極顯著相關(guān)性。

圖2 芍藥種質(zhì)資源表型性狀Pearson相關(guān)性分析Fig.2 Pearson correlation analysis of phenotypic traits of peony germplasm resources

根據(jù)平方歐式距離按照Ward 法進(jìn)行R 型聚類（圖3）。當(dāng)選取的標(biāo)尺為15 時(shí)，38 個(gè)表型性狀被劃分為4 類，第Ⅰ類11 個(gè)性狀主要包括株型、莖態(tài)、花態(tài)、葉態(tài)、芽形、蕾形等與植株形態(tài)相關(guān)以及莖色、瓣端缺刻等性狀。第Ⅱ類14 個(gè)性狀，主要包含花型、花期、雄蕊等花部7 個(gè)性狀及葉緣鋸齒、葉色等葉部7 個(gè)性狀。第Ⅱ類7 個(gè)性狀，包括了與顏色相關(guān)的芽叢顏色、花色、柱頭顏色等性狀及雌蕊相關(guān)的多數(shù)性狀。第Ⅳ類6 個(gè)性狀，包含了株高、莖粗、花徑3 個(gè)數(shù)量性狀以及莖被毛、葉面凹陷等植株表面相關(guān)性狀。R型聚類結(jié)果能夠一定程度上反映植株、花部及葉部性狀間的相關(guān)性。

圖3 芍藥種質(zhì)資源38個(gè)表型性狀R型聚類結(jié)果Fig.3 R cluster tree diagram of 38 phenotypic traits of peony germplasm resources

2.4 主成分分析結(jié)果

從相關(guān)性分析來看，部分性狀間的相關(guān)系數(shù)較高，因此有必要通過主成分分析，判斷各個(gè)性狀在反映種質(zhì)資源多樣性方面的重要性大小，從而突顯重要性狀，提高品種劃分的科學(xué)性。參照因子分析的標(biāo)準(zhǔn)[18]進(jìn)行主成分必要性檢驗(yàn)，KMO 統(tǒng)計(jì)量0.557＞0.5，偏相關(guān)性很弱；Bartlett 球形檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量的顯著性0.000＜0.01，可做主成分分析。

由主成分分析（表5）結(jié)果可知，以特征值＞1 為標(biāo)準(zhǔn)提取14 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率69.905%，表明這14 個(gè)主成分可以反映原始因子的大部分遺傳多樣性信息。對(duì)一個(gè)變量來說載荷絕對(duì)值較大的因子與它的關(guān)系更密切，從各因子旋轉(zhuǎn)后的載荷量來看，第1 主成分載荷量較大的有柱頭大小、心皮被毛，主要與雌蕊相關(guān)；第2主成分載荷量較大的有株高和莖粗，與植株長(zhǎng)勢(shì)狀態(tài)相關(guān)；第3主成分對(duì)應(yīng)載荷量較大的有花期、雄蕊狀態(tài)等與花器官相關(guān)的性狀；第4 主成分載荷量較大的為莖態(tài)、株型，與植株形態(tài)相關(guān)；第5～7 主成分中載荷量較大的性狀主要有葉脈凹陷、葉色、葉質(zhì)等葉片相關(guān)的性狀；第8～11主成分中結(jié)實(shí)性、蕾形、花色、花香等與花部器官相關(guān)的性狀起決定作用；第12主成分載荷量較大的性狀是芽形；第13 主成分中瓣端缺刻的載荷量較大；第14主成分載荷量較大的有葉緣波狀程度、花藥殘留等性狀。綜上可以得出，影響芍藥品種表型差異的主要性狀有株高、株型、柱頭大小、花期、莖態(tài)、葉脈凹陷、葉色、葉緣波狀程度、結(jié)實(shí)性等。

表5 各主成分的特征值、貢獻(xiàn)率及旋轉(zhuǎn)后各因子的載荷矩陣Tab.5 Eigenvalues，contribution rate and rotated component matrix of each principal components

2.5 聚類分析結(jié)果

根據(jù)表型數(shù)據(jù)對(duì)109個(gè)供試芍藥種質(zhì)資源進(jìn)行層次聚類，從聚類圖（圖4）可以看出，109 份芍藥資源分為4 類。第1 類數(shù)量較少，包括錦山紅、粉盤紅星、紫鳳羽等11 份資源，全部為國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種，典型的表型特征為植株高度較高，平均株高92.67 cm，花色以紫紅色為主；第2 類數(shù)量最多，除Kansas 這一個(gè)國(guó)外引種的中國(guó)芍藥品種外，其余全部為國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種，如胭脂紅、紅峰、紫霞迎雪、美菊、春曉等共42份資源，表型特點(diǎn)是株型緊湊，植株高度中等，平均株高74.54 cm，花色以粉紅色、紫紅色和和復(fù)色為主；第3 類24 份資源，多數(shù)為粉玉奴、粉面桃花、佛光珠影、仙鶴白、巧玲等國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)種植的中國(guó)芍藥品種，以及國(guó)外引種的3 個(gè)品種群品種各1 個(gè)，表型特征為莖稈較細(xì)，平均株高60.67 cm，花色比較豐富；第4 類32 份資源，涵蓋了9個(gè)國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種及幾乎全部國(guó)外引種的芍藥資源，平均株高45.65 cm，但莖稈較為粗壯，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)健，株型以半開張為主，葉緣多沒有鋸齒。由此可以看出，株高、株型、花色等性狀與品種聚類的相關(guān)性較大，證明所選擇的表型性狀具有較高的代表性。

圖4 109份芍藥種質(zhì)資源聚類結(jié)果Fig.4 Cluster dendrogram of 109 peony germplasm resources

3 結(jié)論與討論

我國(guó)菏澤、洛陽(yáng)、揚(yáng)州等地種植的多為傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種，僅有一個(gè)野生種參與品種的形成，且多是通過天然雜交實(shí)生選育而來，因此花色、花期、株型等表型性狀單一[19]。國(guó)外芍藥的雜交選育已有百年歷史，美國(guó)牡丹芍藥協(xié)會(huì)（American Peony Society）登錄的芍藥品種有5 000 多個(gè)，分為中國(guó)芍藥品種群、雜種芍藥品種群和伊藤芍藥品種群[20]。近年來隨著品種的不斷引進(jìn)，亟待對(duì)日益豐富的芍藥種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，從而為雜交育種工作提供參考。前人對(duì)芍藥表型性狀的多樣性研究多集中于國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)種植的中國(guó)芍藥品種，本研究則以不同品種群的109 份芍藥資源為研究對(duì)象，選擇38個(gè)表型性狀，以更大的品種群體研究分析不同品種群芍藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性，使研究結(jié)果與其他學(xué)者的相關(guān)研究互相補(bǔ)充。

利用Shannon-Wiener 指數(shù)表示不同種質(zhì)資源的遺傳多樣性，可反映出表型性狀分級(jí)多少和分布狀況，同時(shí)包含了多樣性的豐富度和均勻度[21]。本研究以該指數(shù)反映芍藥種質(zhì)資源表型性狀的遺傳多樣性狀況，多樣性指數(shù)介于0.28～2.10，其中數(shù)量性狀的多樣性指數(shù)均值（2.00）高于質(zhì)量性狀多樣性指數(shù)均值（1.06），直觀地反映了表型性狀多樣性程度。這與前人的研究結(jié)果一致[9-10]。

由于芍藥表型性狀較多，且彼此之間存在較為復(fù)雜的相關(guān)性，對(duì)評(píng)價(jià)和利用芍藥種質(zhì)資源產(chǎn)生一定的影響，有必要通過主成分分析，通過降維的方式篩選重要表型性狀，最大程度代表所有性狀并排除由于相關(guān)關(guān)系對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的干擾[22]。本研究表型性狀的相關(guān)性分析顯示，性狀間呈極顯著相關(guān)性的有67 對(duì)，顯著相關(guān)的有53 對(duì)，并且花部表型性狀與其他性狀之間存在復(fù)雜的相關(guān)性，而莖、葉部的表型性狀與其他性狀存在較少的極顯著相關(guān)性。進(jìn)一步進(jìn)行主成分分析，提取出14 個(gè)主成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率69.905%，能夠反映表型性狀的大部分信息，篩選出株高、株型、柱頭大小、花期、莖態(tài)、葉脈凹陷、葉色、葉緣波狀程度、結(jié)實(shí)性等對(duì)芍藥種質(zhì)資源表型差異具有較大貢獻(xiàn)的表型性狀，有利于今后對(duì)種質(zhì)資源進(jìn)行高效評(píng)價(jià)和利用。

本研究通過層次聚類研究不同品種群芍藥資源的遺傳關(guān)系和分類。聚類結(jié)果顯示，第1 類全部為國(guó)內(nèi)種植的傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種，第2 類、第3 類除包含國(guó)外引種的中國(guó)芍藥品種、雜種芍藥品種和伊藤芍藥品種以外，也全部為傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種，主要以株高、花色等表型性狀進(jìn)行聚類；而幾乎全部國(guó)外引種的中國(guó)芍藥品種群、雜種芍藥品種群和伊藤芍藥品種群品種均隸屬第4 類。雜種芍藥品種群、伊藤芍藥品種群與中國(guó)芍藥傳統(tǒng)品種分屬不同的聚類，這說明二者由于起源不同而與傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種群距離較遠(yuǎn)；國(guó)外引種的中國(guó)芍藥品種群品種與傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種同樣來源于P.lactiflora，但是卻由于距離較遠(yuǎn)分屬不同的聚類，這可能是基于不同的育種目標(biāo)長(zhǎng)期選擇的結(jié)果，我國(guó)傳統(tǒng)中國(guó)芍藥品種的選育以自然選擇為主，以風(fēng)姿綽約為美，而國(guó)外芍藥野生資源豐富，進(jìn)行品種雜交選育已愈百年，且以花姿挺拔為美，經(jīng)過長(zhǎng)期人為選擇而造成群體性狀的差異。

遺傳多樣性研究可在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化以及DNA 分子等水平上進(jìn)行[23]，這些方法各有優(yōu)勢(shì)及局限性，但同樣具有一定的一致性，通過相互驗(yàn)證可以保證結(jié)果更加科學(xué)可靠，整合多種類型數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多樣性分析已開始應(yīng)用于糧食作物、果樹、花卉等[24-26]。王淼等[27]、蔡健等[28]研究了基于分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)性狀的芍藥品種聚類分析間的相關(guān)性，但僅限于國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)種植的中國(guó)芍藥品種，今后仍有待于整合分子生物學(xué)、表型等水平進(jìn)行不同品種群芍藥種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，以期更加客觀地進(jìn)行評(píng)價(jià)和利用。