崔 筱，張玉亭，孔維麗，胡素娟，劉 芹，王彥坡，吳 杰，師子文

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002；2. 西峽縣食用菌生產(chǎn)辦公室，河南 西峽 474599）

平菇（Pleurotus ostreatus）是一種常見的藥食兩用的真菌，具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，已成為我國栽培最為廣泛的食用菌之一[1-2]。平菇菌絲的生長容易受到生長環(huán)境，尤其是外源調(diào)節(jié)劑的影響，進(jìn)而影響其子實(shí)體發(fā)育過程[3-4]。生長素（Auxin）是一種植物激素，吲哚乙酸（IAA）是一種重要的生長素，是細(xì)胞增殖與伸長的重要調(diào)節(jié)劑，對細(xì)胞的周期進(jìn)展及相關(guān)蛋白質(zhì)也具有重要的調(diào)控作用。研究表明，外源IAA 能夠反饋調(diào)節(jié)平菇內(nèi)源IAA 的分泌及生長素氧化酶的活性，影響菌絲的生長速度及平菇的生長發(fā)育過程[5]，且通過轉(zhuǎn)錄組分析證明，幾丁質(zhì)代謝、色氨酸代謝和MAPK 信號通路是IAA 影響平菇菌絲生長的潛在分子機(jī)制[6]。而子實(shí)體作為平菇主要的食用部分，外源IAA 對其生長發(fā)育的影響機(jī)制研究未見報(bào)道，但轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在食用菌的子實(shí)體發(fā)育及環(huán)境響應(yīng)機(jī)制研究中已被廣泛應(yīng)用。研究子實(shí)體對外源IAA響應(yīng)的機(jī)制，對平菇子實(shí)體階段的生長管理具有重要意義。鑒于此，設(shè)置高、低濃度外源IAA 處理不同生育階段的平菇，通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)篩選平菇不同生育階段對IAA 響應(yīng)的差異表達(dá)基因（DEGs），建立基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而揭示IAA 對平菇生長發(fā)育的影響機(jī)制，為外源IAA的施用提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株：平菇P99，由河南省食用菌種質(zhì)資源庫提供。供試母種培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。培養(yǎng)料配方：棉籽殼93%、麩皮5%、石灰2%。IAA購自Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度IAA 的配制 利用無水乙醇作為溶劑，配制成濃度分別為1×10-3（T3）、1×10-8（T8）、0（CK）mol/L 的IAA 溶液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后儲存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 樣品制備 菌絲體收集按照崔筱等[6]的方法。用直徑為5 mm 的打孔器將活化后的平菇菌株分別接種到直徑為15 cm、含有3 種不同濃度（T3、T8、CK）IAA 溶液的PDA 平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)7 d或15 d。試驗(yàn)設(shè)置6組處理，分別記為T37d、T315d、T87d、T815d、CK7d 和CK15d，每處理重復(fù)3 次，每個(gè)重復(fù)3 皿。取不同處理的菌絲體0.5 g，分別裝入5 mL 的無菌凍存管中，液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。子?shí)體收集方法具體為：選用14 cm×28 cm×0.005 cm聚丙烯栽培袋，每袋質(zhì)量250 kg，干料質(zhì)量150 kg，菌絲滿袋后，開口出菇，每袋噴施10 mL 不同濃度（T3、T8）的IAA 溶液，以不噴施生長素的菌袋作為CK，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。噴施IAA 后，保持菇房內(nèi)溫度15～20 ℃，相對濕度80%～90%，二氧化碳濃度1 178.57～1 571.42 mg/m3，光照強(qiáng)度150 lx，取不同處理的25 d、27 d、31 d 的樣品0.5 g，分別裝入5 mL的無菌凍存管中，液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總RNA 的提取、文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序 按照崔筱等[6]的方法，利用Trizol reagent（Takara）法提取各處理樣品總RNA，并將提取的不同重復(fù)RNA進(jìn)行等量混合，Nanodrop 2000分光光度計(jì)（美國，賽默飛）對所提RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，合格后送樣至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)獲取 研究數(shù)據(jù)為平菇組織的轉(zhuǎn)錄組原始測序數(shù)據(jù)（https://cloud.majorbio.com/）。共包含了15 個(gè)樣本，分別是CK 組（CK7d、CK15d、CK25d、CK27d、CK31d）、高濃度T3 處理組（T37d、T315d、T325d、T327d、T331d）、低濃度T8 處理組（T87d、T815d、T825d、T827d、T831d）。其中7 d、15 d 是菌絲體階段，25 d、27 d、31 d 是子實(shí)體階段，25 d 是子實(shí)體發(fā)育階段中的原基分化期。

1.2.5 DEGs 篩選 利用DESeq2[7]（Version 1.34.0，https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）按照時(shí)間梯度分別對CK7d vs T37d、CK15d vs T315d、CK25d vs T325d、CK27d vs T327d、CK31d vs T331d 及CK7d vs T87d、CK15d vs T815d、CK25d vs T825d、CK27d vs T827d、CK31d vs T831d 的基因進(jìn)行差異分析，所有基因經(jīng)過分析得到相應(yīng)的P值和lgFC值，閾值設(shè)定：P值＜0.05，且|logFC|＞1。

通過aov 函數(shù)使用F檢驗(yàn)方法對相同濃度（T3、CK、T8）下不同時(shí)間點(diǎn)樣本（7 d、15 d、25 d、27 d、31 d）間的基因進(jìn)行差異分析，得到相應(yīng)的P值，采用Benjamini&Hochberg 方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，得到校正的P值即Q值，DEGs閾值設(shè)定：Q值＜0.01。

1.2.6 Venn 分析 利用在線工具Venn[8]（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）分 別 對CK7d vs T37d 的DEGs 與CK15d vs T315d 的DEGs、CK7d vs T87d 的DEGs 與CK15d vs T815d 的DEGs取交集，分別獲得菌絲體的高濃度和低濃度下的交集DEGs。

同樣利用在線工具Venn 分別對CK25d vs T325d 的DEGs、CK27d vs T327d 的DEGs 與CK31d vs T331d 的DEGs、CK25d vs T825d 的DEGs、CK27d vs T827d 的DEGs 與CK31d vs T831d 的DEGs 取 交集，分別獲得子實(shí)體的高濃度和低濃度下的交集DEGs。

1.2.7 DEGs 表達(dá)趨勢聚類分析 基于上述時(shí)間梯度得到10 組DEGs，對相同時(shí)間不同IAA 濃度下的DEGs 取并集，共得到5 組（7 d、15 d、25 d、27 d、31 d）并集DEGs，結(jié)合各自相同時(shí)間下RNA-seq 數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣，得到DEGs 在不同濃度（CK、T8、T3）下的表達(dá)矩陣。分別將5 組DEGs 表達(dá)矩陣輸入到Stem 軟件[9]中進(jìn)行表達(dá)趨勢聚類分析，通過參數(shù)設(shè)置（Clustering method：STEM Clustering Method；Significance level：0.05），分別進(jìn)行5 次聚類分析后，得到相同時(shí)間不同濃度下DEGs 的不同模塊基因集。

基于上述相同濃度不同時(shí)間點(diǎn)樣本得到的3組DEGs，并結(jié)合各自相同濃度下RNA-seq 數(shù)據(jù)表達(dá)矩陣，得到DEGs在不同時(shí)間點(diǎn)（7 d、15 d、25 d、27 d、31 d）下的表達(dá)矩陣。分別將3 組DEGs 表達(dá)矩陣輸入到Stem 軟件中進(jìn)行表達(dá)趨勢聚類分析，通過參數(shù)設(shè) 置（Clustering method：STEM Clustering Method；Significance level：0.05），分別進(jìn)行3次聚類分析后，得到相同濃度不同時(shí)間點(diǎn)樣本間DEGs 的不同模塊基因集。

1.2.8 DEGs 功能富集分析 基因本體論（Gene ontology，GO）系統(tǒng)包括3 個(gè)部分：生物學(xué)過程（Biological process，BP）、分 子 功 能（Molecular functions，MF）、細(xì)胞組分（Cellular components，CC）。利 用 平 臺 軟 件Goatools[10]（https：//github. com/tanghaibao/GOatools）分別對菌絲體下高濃度間DEGs 和低濃度間DEGs、子實(shí)體下高濃度間DEGs和低濃度間DEGs 參與的GO 系統(tǒng)和KEGG 通路進(jìn)行富集分析。顯著性閾值P值＜0.05 視為顯著富集結(jié)果，選擇排名前10（按照P值排名，若富集結(jié)果不足10 條則進(jìn)行全部展示）的GO 注釋和KEGG 通路注釋進(jìn)行展示。

1.2.9 DEGs 共表達(dá)分析 基于上述得到的菌絲體高濃度DEGs、菌絲體低濃度DEGs、子實(shí)體高濃度DEGs 以及子實(shí)體低濃度DEGs，結(jié)合基因的表達(dá)量，分別計(jì)算出菌絲體高濃度DEGs、菌絲體低濃度DEGs、子實(shí)體高濃度DEGs 以及子實(shí)體低濃度DEGs 間的Pearson 相關(guān)性系數(shù)，得到相應(yīng)的P值和相關(guān)性系數(shù)cor，并進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。此外，采用“BH”校正，得到校正后的Q值，根據(jù)閾值Q值＜0.05，且|cor|＞0.5，得到基因共表達(dá)關(guān)系對。接著利用Cytoscape 軟件[11]進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（若共表達(dá)關(guān)系對過多，按照相關(guān)性系數(shù)cor 排名，分別選取正負(fù)相關(guān)各排名前50的關(guān)系對進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEGs統(tǒng)計(jì)結(jié)果

根據(jù)平菇生育階段的變化，按照所設(shè)閾值篩選低濃度與高濃度外源IAA 條件下不同時(shí)間點(diǎn)的DEGs（圖1），具體數(shù)目如表1所示。

表1 不同生育階段平菇對外源IAA濃度響應(yīng)的DEGs數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.1 The number of DEGs at different growth stages of P.ostreatus in response to the concentration of exogenous IAA

圖1 T3（A）和T8（B）IAA濃度下不同時(shí)間點(diǎn)的DEGs火山圖Fig.1 Volcano plots of DEGs at different time points under T3（A）and T8（B）IAA concentrations

菌絲體階段（7 d 與15 d），T3 濃度下共篩選到DEGs 2 931 個(gè)，其中上調(diào)DEGs 1 593 個(gè)，下調(diào)DEGs 1 338個(gè)；而T8濃度下共篩選到DEGs 2 007個(gè)，包括上調(diào)DEGs 713 個(gè)，下調(diào)DEGs 1 294 個(gè)。子實(shí)體階段，T3 濃度下共篩選到DEGs 3 978 個(gè)，其中上調(diào)DEGs 2 284 個(gè)，下調(diào)DEGs 1 694 個(gè)；T8 濃度下DEGs共3 956 個(gè)，包括上調(diào)DEGs 1 894 個(gè)，下調(diào)DEGs 2 062 個(gè)。此外，在相同濃度下的不同生育階段進(jìn)行DEGs 分析，結(jié)果顯示，CK、T8、T3 濃度下不同時(shí)間點(diǎn)樣本間DEGs分別為3 209、2 856、3 173個(gè)。

2.2 Venn分析結(jié)果

如圖2A 所示，T3 濃度下，菌絲體階段的交集DEGs 有217 個(gè)。其中包括上調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN8187_c0_g1、TRINITY_DN572_c3_g3、TRINITY_DN1371_c0_g1等及下調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN14069_c0_g1、TRINITY_DN14570_c0_g2、TRINITY_DN41591_c0_g1、TRINITY_DN27347_c0_g1、TRINITY_DN35150_c0_g1 等。而T8 濃度下，菌絲體階段的交集DEGs為81 個(gè)，結(jié)果如圖2B 所示。其中包括上調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN2732_c0_g1、TRINITY_DN8088_c0_g1、TRINITY_DN9337_c0_g1 等及下調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN5232_c1_g1、TRINITY_DB2618_c0_g1、TRINITY_DN601_c0_g1等。

圖2 DEGs Venn圖Fig.2 Venn diagram of DEGs

子實(shí)體階段，T3與T8濃度的交集DEGs分別為10個(gè)與87個(gè)，如圖2C—D所示。其中，T3濃度下包括上調(diào) 表 達(dá) 的 TRINITY_DN4505_c0_g1、TRINITY_DN7383_c0_g1 等及下調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN25720_c0_g1、TRINITY_DN18000_c0_g1、TRINITY_DN13805_c0_g1、TRINITY_DN5144_c0_g1等。T8濃度下包括上調(diào) 表 達(dá) 的 TRINITY_DN1089_c0_g2、TRINITY_DN181_c0_g1、TRINITY_DN3832_c0_g1等及下調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN560_c0_g1、TRINITY_DN530_c0_g1、TRINITY_DN4090_c0_g1等。

2.3 DEGs表達(dá)趨勢聚類分析結(jié)果

相同時(shí)間點(diǎn)的不同IAA 濃度下，時(shí)間點(diǎn)7 d 下并集DEGs 有2 358 個(gè)，聚類為16 個(gè)模塊基因集（圖3A）；在時(shí)間點(diǎn)15 d下并集DEGs有1 362個(gè)，聚類分析得到16 個(gè)模塊基因集（圖3B）；時(shí)間點(diǎn)25 d 下并集DEGs 有2 294 個(gè)，聚類分析為16 個(gè)模塊基因集（圖3C）；時(shí)間點(diǎn)27 d 下并集DEGs 有3 234 個(gè)，聚類分析得到16 個(gè)模塊基因集（圖3D）；時(shí)間點(diǎn)31 d 下并集DEGs 有905 個(gè)，聚類分析后，得到16 個(gè)模塊基因集（圖3E）。且5 個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)下均有符合先上升后下降或先下降后上升的趨勢模塊基因集，均得到2個(gè)趨勢模塊基因集（模塊9 和模塊6，其中，模塊9 為先上升后下降，模塊6 為先下降后上升）。其中，菌絲體交集DEGs TRINITY_DN8187_c0_g1、TRINITY_DN27347_c0_g1、TRINITY_DN601_c0_g1 同屬于模塊6，而TRINITY_DN14069_c0_g1歸于模塊9。子實(shí)體交集DEGs TRINITY_DN5144_c0_g1 及TRINITY_DN4090_c0_g1 同 屬 于 模 塊6，TRINITY_DN4505_c0_g1、TRINITY_DN25720_c0_g1、TRINITY_DN18000_c0_g1、TRINITY_DN13805_c0_g1 同 屬 于模塊9。

圖3 相同時(shí)間點(diǎn)不同IAA濃度下Stem聚類趨勢基因集Fig.3 Stem clustering trend gene set of different concentration of IAA at the same time points

如圖4A—C 所示，相同IAA 濃度不同時(shí)間點(diǎn)下，CK、T8、T3濃度下均得到50個(gè)模塊基因集，其中符合一直上升或者一直下降趨勢的模塊均為3 個(gè)（模塊41、模塊38和模塊9）。

圖4 相同IAA濃度不同時(shí)間點(diǎn)下Stem聚類趨勢基因集Fig.4 Stem clustering trend gene set of the same concentraion of IAA at different time points

各處理趨勢模塊數(shù)量如表2 所示。其中，菌絲體交集DEGs TRINITY_DN572_c3_g3、TRINITY_DN1371_c0_g1、TRINITY_DN2732_c0_g1 同屬于上升趨勢模塊，TRINITY_DN41591_c0_g1、TRINITY_DN35150_c0_g1、TRINITY_DN5314_c0_g2、TRINITY_DN43009_c0_g1、TRINITY_DN5232_c1_g1、TRINITY_DN2618_c0_g1 同屬于下降趨勢模塊。子實(shí)體交集DEGs TRINITY_DN1089_c0_g1、TRINITY_DN181_c0_g1、TRINITY_DN3832_c0_g1 同屬于上升趨勢模塊，TRINITY_DN560_c0_g1、TRINITY_DN530_c0_g1 及TRINITY_DN4090_c0_g1同屬于下降趨勢模塊。

表2 不同處理中各趨勢模塊的DEGs數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 The number of DEGs in each trend module with different treatments

2.4 DEGs功能富集分析結(jié)果

GO 系統(tǒng)分析表明，菌絲體下高濃度間DEGs 共富集得到52 個(gè)GO BP（主要涉及到溶酶體、細(xì)胞分布、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能）、1 個(gè)GO CC（胞外區(qū)域）、17 個(gè)GO MF（主要為氧化還原酶活性、幾丁質(zhì)結(jié)合等分子功能）。KEGG 富集分析結(jié)果表明，可富集到1 條KEGG 通路（甘油磷脂代謝）（圖5A）。菌絲體低濃度DEGs共富集得到58個(gè)GO BP（主要涉及到多種化合物的代謝、生物合成及分解過程）、12個(gè)GO CC（質(zhì)膜、核糖體等細(xì)胞組分）、38 個(gè)GO MF（多種化合物裂解酶及解氨酶活性）和4 條KEGG 通路（苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸等的代謝）（圖5B）。

子實(shí)體高濃度DEGs 共富集得到10 個(gè)GO BP（主要涉及到ADP 代謝與ATP 合成以及丙酮酸代謝等生物學(xué)功能）、1 個(gè)GO CC（磷酸丙酮酸水合酶復(fù)合物）、4 個(gè)GO MF（氧化還原酶活性、FMN 結(jié)合、NAD（P）H 脫氫酶及磷酸丙酮酸水合酶活性）和4條KEGG 通路（糖酵解、RNA 降解、甲烷代謝及醌類的生物合成）（圖5C）。子實(shí)體低濃度DEGs 共富集得到22 個(gè)GO BP（呼吸鏈的組裝、膜脂分解代謝及乙醇代謝等生物學(xué)功能）、16個(gè)GO MF（過渡金屬離子結(jié)合、血紅素結(jié)合、氧化還原酶活性、鐵結(jié)合等分子功能）和6 條KEGG 通路（過氧化物酶體、半乳糖代謝、鞘脂代謝等）（圖5D）。這里按照P值排名，選取GO和KEGG 排名前10的注釋進(jìn)行展示。

圖5 不同IAA濃度下DEGs的GO和KEGG富集結(jié)果Fig.5 GO and KEGG enrichment results of DEGs at different IAA concentrations

2.5 DEGs共表達(dá)分析結(jié)果

分別計(jì)算菌絲體高濃度DEGs、菌絲體低濃度DEGs、子實(shí)體高濃度DEGs 以及子實(shí)體低濃度DEGs 間的Pearson 相關(guān)性系數(shù)，根據(jù)閾值Q值＜0.05且|cor|＞0.5，其中菌絲體高濃度DEGs 共得到6 735個(gè)共表達(dá)關(guān)系對，菌絲體低濃度DEGs共得到766個(gè)共表達(dá)關(guān)系對，子實(shí)體高濃度DEGs 共得到32個(gè)共表達(dá)關(guān)系對，子實(shí)體低濃度DEGs 共得到1 565 個(gè)共表達(dá)關(guān)系對，分別選取正負(fù)相關(guān)排名前50的關(guān)系對進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，如圖6所示。

結(jié)果表明，T3 菌絲體階段的DEGs TRINITY_DN8187_c0_g1與多種基因表現(xiàn)出共表達(dá)關(guān)系，同時(shí)，TRINITY_DN572_c3_g3、 TRINITY_DN1371_c1_g1、TRINITY_DN14069_c0_g1、TRINITY_DN14570_c0_g2、TRINITY_DN41591_c0_g1、TRINITY_DN27347_c0_g1、TRINITY_DN5314_c0_g2 等 交 集DEGs 均 表現(xiàn)較多的共表達(dá)關(guān)系，且TRINITY_DN14570_c0_g2、TRINITY_DN41591_c0_g1、TRINITY_DN27347_c0_g1構(gòu)成同一共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖6A）。

T8菌絲體階段DEGs TRINITY_DN9079_c0_g1、TRINITY_DN5232_c1_g1、TRINITY_DN2618_c0_g1及TRINITY_DN601_c0_g1 表現(xiàn)出較多共表達(dá)關(guān)系，且屬同一共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖6B）。

T3 子實(shí)體階段DEGs TRINITY_DN4505_c0_g1、TRINITY_DN25720_c0_g1、TRINITY_DN18000_c0_g1、TRINITY_DN13805_c0_g1 及TRINITY_DN5144_c0_g1均表現(xiàn)出較多共表達(dá)關(guān)系（圖6C）。

T8子實(shí)體階段DEGs TRINITY_DN181_c0_g1、TRINITY_DN3832_c0_g1、TRINITY_DN560_c0_g1、TRINITY_DN530_c0_g1 及TRINITY_DN4090_c0_g1表現(xiàn)出較多共表達(dá)關(guān)系，TRINITY_DN1089_c0_g1與TRINITY_DN560_c0_g1 及TRINITY_DN530_c0_g1屬同一個(gè)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖6D）。

圖6 不同濃度下DEGs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 The co-expression network of DEGs under different IAA concentrations

3 結(jié)論與討論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析平菇不同生長階段對不同濃度外源IAA 響應(yīng)的DEGs，結(jié)果顯示，平菇在不同生長階段對外源IAA 濃度的響應(yīng)不同。菌絲體階段，高濃度外源IAA 引起DEGs 數(shù)量高于低濃度外源IAA，說明菌絲體階段平菇對高濃度外源IAA 響應(yīng)更為強(qiáng)烈；子實(shí)體階段，不同濃度外源IAA引起的DEGs 數(shù)量相近。菌絲體階段，不同濃度IAA 下的交集DEGs 較多，而子實(shí)體階段，不同濃度IAA 下的交集DEGs 較少。因此，平菇不同生長階段對不同濃度外源IAA 的響應(yīng)機(jī)制不同，下面對DEGs的功能進(jìn)行進(jìn)一步分析。

菌絲體是平菇的營養(yǎng)器官，菌絲體通過吸收利用培養(yǎng)基質(zhì)中的纖維素、氮、磷、鉀等養(yǎng)分，完成該階段發(fā)育。本試驗(yàn)中，低濃度外源IAA 能夠誘導(dǎo)核糖體及質(zhì)膜相關(guān)基因的異常表達(dá)，以及氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸等）代謝相關(guān)的基因也表現(xiàn)出對低濃度IAA的響應(yīng)。之前研究發(fā)現(xiàn)，外源IAA濃度的降低能夠促進(jìn)菌絲體的生長，低至1×10-10mol/L時(shí)，菌絲生長速度變慢[5]。核糖體是蛋白質(zhì)翻譯的重要場所，而苯丙氨酸、色氨酸及蛋氨酸能夠影響植物激素例如乙烯、吲哚乙酸及木質(zhì)素、花青素等的合成，對菌絲的生長具有重要作用[12]。之前有報(bào)道證明，2×10-4mol/L 外源IAA 能夠影響桃果實(shí)與種子中生長素、茉莉酸及脫落酸含量，與內(nèi)源植物激素共調(diào)控果實(shí)生長發(fā)育及成熟過程[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN2732_c0_g1 富集于核糖體GO 結(jié)果中，因此，預(yù)測在菌絲體階段，低濃度外源IAA 通過TRINITY_DN2732_c0_g1 調(diào)控核糖體合成內(nèi)源植物激素，調(diào)控平菇菌絲體階段的生長發(fā)育。高濃度IAA 下的DEGs 主要富集于植物的氧化應(yīng)激相關(guān)生物學(xué)過程，涉及到溶酶體、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能，氧化還原酶、幾丁質(zhì)結(jié)合等分子功能及甘油磷脂代謝過程。甘油磷脂代謝的產(chǎn)物能夠破壞細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，衰老的細(xì)胞器或生物大分子被溶酶體吞噬，促進(jìn)細(xì)胞的更新[14]。甘油磷脂代謝過程富集到下調(diào)的DEGs TRINITY_DN41591_c0_g1。幾丁質(zhì)作為細(xì)胞壁的主要成分，其代謝主要通過自溶過程實(shí)現(xiàn)，在幾丁質(zhì)代謝過程的富集結(jié)果中，包含了菌絲體階段下調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN14069_c0_g1。此外，TRINITY_DN35150_c0_g1、TRINITY_DN5314_c0_g2 及TRINITY_DN43009_c0_g1 均富集在氧化還原酶活性的分子功能，且三者均富集于下降趨勢的模塊，此外，三者共同構(gòu)成的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，三者表達(dá)水平存在正相關(guān)性。之前針對高濃度IAA 下平菇菌絲體關(guān)鍵基因的挖掘也同樣發(fā)現(xiàn)，高濃度IAA 能夠引起氧化還原酶相關(guān)基因的異常表達(dá)，從而保護(hù)平菇細(xì)胞免受氧化損傷[5]。因此，高濃度的IAA 對平菇具有一定的脅迫作用，同時(shí)會抑制TRINITY_DN41591_c0_g1調(diào)控的甘油磷脂代謝過程，TRINITY_DN14069_c0_g1調(diào)控的幾丁質(zhì)代謝及TRINITY_DN35150_c0_g1、TRINITY_DN5314_c0_g2 及TRINITY_DN43009_c0_g1 調(diào)節(jié)的氧化還原酶活性，以提高平菇對高濃度IAA的抗性。

子實(shí)體階段涉及到與菌絲體階段截然不同的分子機(jī)制，低濃度IAA 下的平菇子實(shí)體階段DEGs主要富集在代謝過程和呼吸鏈組分中，與之前報(bào)道平菇子實(shí)體發(fā)育階段的基因轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致[15]。富集結(jié)果顯示，下調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN530_c0_g1 能夠調(diào)控呼吸鏈的組分，上調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN3832_c0_g1 則對鞘脂的代謝具重要作用。鞘脂作為生物膜的重要組成成分，其代謝過程及相應(yīng)代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的生長、分化及衰老具有重要意義，同時(shí)也可作為這些代謝過程的重要信號分子[16-17]。 因 此，子 實(shí) 體 階 段 低 濃 度IAA 通 過TRINITY_DN530_c0_g1 及TRINITY_DN3832_c0_g1調(diào)控呼吸鏈組分及鞘脂代謝。高濃度IAA 引起子實(shí)體階段ATP 合成相關(guān)基因的異常表達(dá)，例如糖酵解途徑、ADP 代謝、ATP 合成等。子實(shí)體階段平菇生長迅速，代謝速率較快，因此，伴隨大量ATP 的合成及相關(guān)過程的激活。ATP 的合成除能為平菇子實(shí)體的生長提供能量外，也能夠提高其對環(huán)境脅迫的抗性。例如，F(xiàn)ENG 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，真菌對銅脅迫的耐受程度與ATP 合成、糖酵解途徑活性密切相關(guān)。高濃度IAA下GO及KEGG富集結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)的TRINITY_DN21430_c0_g1能夠調(diào)控糖酵解、RNA 降解及甲烷代謝過程，進(jìn)而促進(jìn)平菇子實(shí)體階段對高濃度IAA的響應(yīng)。

綜上所述，不同濃度IAA 對平菇菌絲體與子實(shí)體階段的影響機(jī)制不同。低濃度IAA 能夠通過TRINITY_DN2732_c0_g1 調(diào)控核糖體合成內(nèi)源植物激素，同時(shí)通過 TRINITY_DN530_c0_g1 及TRINITY_DN3832_c0_g1 促進(jìn)子實(shí)體階段的代謝進(jìn)程。高濃度IAA 能夠通過TRINITY_DN41591_c0_g1調(diào)控甘油磷脂代謝過程，TRINITY_DN14069_c0_g1調(diào)控幾丁質(zhì)代謝及TRINITY_DN35150_c0_g1、TRINITY_DN5314_c0_g1、TRINITY_DN43009_c0_g1調(diào)節(jié)氧化還原酶活性，同時(shí)通過TRINITY_DN21430_c0_g1調(diào)控子實(shí)體階段ATP的合成。